Name: modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00
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Lo sviluppo del modello qui dimostrato è stato supportato dalla sovvenzione DOD W81XWH-12-1-0163, dalle sovvenzioni NIH R21 CA179981 e R21 CA196202 e dal Sato Metastasis Research Fund.

1. Preparazione cellulare
<ol><li>Rilasciare le cellule dal piatto di coltura tissutale quando il 70-90% confluente seguendo le linee guida raccomandate per la linea cellulare in uso.<ol>
<li>Ad esempio, aspirare il mezzo di crescita per le cellule PC-3 e lavare il piatto di 10 cm di cellule con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) priva di calcio e magnesio.</li>
		<li>Aspirare il PBS prima di aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,25% utilizzando il protocollo del produttore.</li>
		<li>Dopo aver osservat...

<ol>
	<li>Dillek&#229;s, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+90%+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases.">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells.">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li><li>Labelle, M., Hynes, R. 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Questo documento dimostra l'applicazione di FSS alle cellule tumorali in sospensione utilizzando una siringa e un ago. Utilizzando questo modello, le cellule tumorali hanno dimostrato di essere più resistenti a brevi impulsi di FSS di alto livello rispetto alle cellule epiteliali non trasformate15,22,24. Inoltre, l'esposizione a FSS utilizzando questo modello si traduce in un rapido aumento della rigidità cellulare, attivazion...

Le metastasi, o la diffusione del cancro oltre il sito tumorale iniziale, sono un fattore importante alla base della mortalità per cancro1. Durante le metastasi, le cellule tumorali utilizzano il sistema circolatorio come un'autostrada per diffondersi in siti distanti in tutto il corpo2,3. Mentre sono in viaggio verso questi siti, le cellule tumorali circolanti (CTC) esistono all'interno di un microambiente fluido dinamico diverso da quello del loro tumore primario originale3,4,5. È stato proposto che questo microambiente fluido sia una delle tante barriere alle metastasi4. C'è ampio accordo nel concetto di inefficienza metastatica, cioè che la maggior parte delle CTC che entrano in circolazione periscono o non formano colonie metastatiche produttive6,7,8. Tuttavia, il motivo per cui le metastasi sono inefficienti dal punto di vista di un singolo CTC è meno certo e rimane un'area attiva di indagine. Le CTC sono staccate dalla matrice extracellulare, private dei fattori di crescita e sopravvivenza solubili che possono essere presenti nel tumore primario ed esposte al sistema immunitario e alle forze emodinamiche in modo molto diverso rispetto al tumore primario4. Ognuno di questi fattori può contribuire alla scarsa sopravvivenza dei CTC, ma i loro contributi relativi non sono chiari. Questo documento affronta la questione di come le forze emodinamiche influenzano le CTC.
Studiare gli effetti delle forze emodinamiche sulle CTC è piuttosto impegnativo. Attualmente, non esistono sistemi ingegnerizzati in vitro in grado di replicare l'intera dinamica spaziotemporale (dal cuore ai capillari) e le proprietà reologiche del sistema vascolare umano. Inoltre, il modo in cui le CTC sperimentano il sistema circolatorio non è del tutto chiaro. Prove sperimentali indicano che la maggior parte delle cellule tumorali non circolano continuamente come le cellule del sangue. Piuttosto, a causa delle loro dimensioni relativamente grandi (10-20 μm di diametro), la maggior parte dei CTC si intrappolano in letti capillari (6-8 μm di diametro) per periodi di tempo variabili (da s a giorni) dove possono morire, stravasare o essere spostati nel letto capillare successivo8,9,10,11. Tuttavia, ci sono alcune prove che le dimensioni del CTC possono essere più eterogenee in vivo e che le CTC più piccole sono rilevabili12. Pertanto, in base alla distanza e alla velocità del flusso sanguigno, le CTC possono circolare liberamente solo per una questione di secondi tra questi periodi di intrappolamento, sebbene manchi una descrizione quantitativa di questo comportamento13.
Inoltre, a seconda di dove le CTC entrano in circolazione, possono passare attraverso più letti capillari nel polmone e in altri siti periferici e attraverso il cuore destro e sinistro prima di raggiungere la loro destinazione finale. Lungo la strada, le CTC sono esposte a vari stress emodinamici tra cui lo stress da taglio del fluido (FSS), le forze di compressione durante il loro intrappolamento nel microcircolo e, potenzialmente, le forze di trazione in circostanze in cui potrebbero esibire un rotolamento simile a quello dei leucociti lungo le pareti dei vasi sanguigni14. Pertanto, sia la capacità di modellare la circolazione che la comprensione del comportamento CTC da modellare sono limitate. A causa di questa incertezza, qualsiasi risultato proveniente da sistemi modello in vitro dovrebbe essere convalidato in un organismo vertebrato sperimentale e, in definitiva, nei pazienti oncologici.
Con le avvertenze di cui sopra, questo documento dimostra un modello relativamente semplice per applicare FSS alle cellule in sospensione per sondare gli effetti di FSS sulle CTC descritte per la prima volta nel 201215. FSS deriva dall'attrito del flusso sanguigno contro la parete del vaso, che produce un gradiente di velocità parabolica in condizioni di flusso laminare in vasi più grandi. Le cellule sperimentano livelli più elevati di FSS vicino alle pareti dei vasi e livelli più bassi vicino al centro del vaso sanguigno. La viscosità del fluido, la portata e le dimensioni del condotto attraverso il quale avviene il flusso influenzano FSS, come descritto dall'equazione di Hagen-Poiseuille. Questo vale per i flussi sanguigni che si comportano come fluidi newtoniani, ma non vale per la microcircolazione. La FSS fisiologica varia su diversi ordini di grandezza con i livelli più bassi nei linfatici (<1 dyn / cm2) e i più alti nelle regioni intorno alle valvole cardiache e alle placche aterosclerotiche (>500 dyn / cm2)5. Lo sforzo medio di taglio della parete nelle arterie è di 10-70 dyn/cm2 e 1-6 dyn/cm2 nelle vene16,17.
Nel cuore, le cellule possono essere esposte a flussi turbolenti intorno ai lembi valvolari dove si può sperimentare FSS di livello molto alto, ma di brevissima durata18,19. Sebbene il campo del bioprocessing abbia a lungo studiato gli effetti di FSS sulle cellule di mammifero in sospensione, queste informazioni possono avere un valore limitato per comprendere gli effetti di FSS sulle CTC in quanto generalmente si concentrano su livelli molto più bassi di FSS applicati per una lunga durata20. Come descritto di seguito, utilizzando una siringa e un ago, si può applicare FSS relativamente alto (da decine a migliaia di dyn / cm2) per una durata relativamente breve (millisecondi) a una sospensione cellulare. Dalla descrizione iniziale di questo modello15,altri lo hanno impiegato per studiare gli effetti della FSS sulle celluletumorali21,22,23. "Impulsi" multipli di FSS possono essere applicati alle sospensioni cellulari in un breve periodo di tempo per facilitare le analisi sperimentali a valle. Ad esempio, questo modello può essere utilizzato per misurare la capacità delle cellule di resistere alla distruzione meccanica da parte di FSS misurando la vitalità delle celle in funzione del numero di impulsi applicati. In alternativa, gli effetti dell'esposizione a FSS sulla biologia delle cellule tumorali possono essere esplorati raccogliendo cellule per una varietà di analisi a valle. È importante sottolineare che parte della sospensione cellulare è riservata come controllo statico per confrontare gli effetti di FSS da quelli che potrebbero essere associati al distacco cellulare e al tempo tenuto in sospensione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black bottom plate</td>
			<td>Costar - Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence detector</td>
			<td>AMI</td>
			<td>AMI HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Titer Blue</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>D-LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle

Durante le metastasi, le cellule tumorali dei tessuti solidi, compresi gli epiteli, ottengono l'accesso alla circolazione linfatica ed ematogena dove sono esposte a stress meccanici dovuti al flusso emodinamico. Uno di questi sottolinea che le cellule tumorali circolanti (CTC) sperimentano è lo stress da taglio fluido (FSS). Mentre le cellule tumorali possono sperimentare bassi livelli di FSS all'interno del tumore a causa del flusso interstiziale, le CTC sono esposte, senza attaccamento della matrice extracellulare, a livelli molto maggiori di FSS. Fisiologicamente, la FSS varia su 3-4 ordini di grandezza, con bassi livelli presenti nei linfatici (<1 dyne/cm2) e i livelli più alti presenti brevemente mentre le cellule passano attraverso il cuore e intorno alle valvole cardiache (>500 dynes/cm2). Esistono alcuni modelli in vitro progettati per modellare diverse gamme di stress da taglio fisiologico in vari intervalli di tempo. Questo documento descrive un modello per studiare le conseguenze di brevi impulsi (millisecondi) di FSS di alto livello sulla biologia delle cellule tumorali utilizzando un semplice sistema di siringhe e aghi.

L'elevata resistenza alla distruzione meccanica indotta da FSS ha precedentemente dimostrato di essere un fenotipo conservato su più linee cellulari tumorali e cellule tumorali appena isolate dai tumori rispetto ai comparatori di cellule epiteliali non trasformate15,24. Qui, sono state testate ulteriori linee cellulari tumorali da una varietà di origini tissutali (Tabella 2) per dimostrare che la maggior parte di queste cellule mostra vitalità...

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Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Qui dimostriamo un metodo per applicare lo stress da taglio fluido alle cellule tumorali in sospensione per modellare gli effetti dello stress emodinamico sulle cellule tumorali circolanti.

Modellazione degli effetti dello stress emodinamico sulle cellule tumorali circolanti utilizzando una siringa e un ago

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Questo protocollo espone le cellule tumorali in una sospensione a brevi impulsi di stress da taglio fluido per imitare alcuni aspetti di come le cellule tumorali metastatiche sono esposte alle forze emodinamiche mentre sono nel sistema circolatorio. È una tecnica relativamente semplice per applicare brevi impulsi di stress da taglio del fluido di alto livello. Quando si tenta questo protocollo, fare attenzione agli aghi non tappati e non piegarli in quanto ciò cambierà lo sforzo di taglio della forza applicato.Questa procedura può produrre aerosol, quindi utilizzare misure di sicurezza appropriate. Per iniziare, rilasciare dal 70 al 90% di cellule PC3 confluenti dal piatto di coltura tissutale aspirando il mezzo di crescita e lavando il piatto da 10 centimetri con cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio. Quindi, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di 0,25% tripsina.Post-tripsinizzazione, osservare il distacco delle cellule al microscopio invertito. Per inibire la tripsina, aggiungere cinque millilitri di mezzo DMEM/F12 contenente il 10% di FBS. Quindi, posizionare la sospensione cellulare in un tubo conico e determinare la concentrazione cellulare e il numero totale di cellule.Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per tre minuti, quindi aspirare il surnatante e ricasegare il pellet in un terreno di coltura tissutale privo di siero. Tagliare intorno al fondo del tubo di polistirene da 14 millilitro sulla linea dei sette millilitro e posizionare la sospensione a celle miste nel tubo tagliato. Raccogliere separatamente campioni di controllo statico delle cellule prima dell'esposizione allo stress da taglio del fluido da utilizzare per l'esecuzione di saggi.Per esporre il campione di sospensione cellulare rimanente allo stress di taglio del fluido, aspirare la sospensione cellulare in una siringa da cinque millilitri e collegare un ago da mezzo pollice da 30 gauge. Posizionare e fissare la siringa con un ago non tappato su una pompa a siringa e impostare la portata per raggiungere il livello desiderato di sforzo di taglio del fluido. Eseguire la pompa della siringa e raccogliere il campione tranciato nel tubo tagliato con un angolo di circa 45 gradi per ridurre la formazione di schiuma.Rimuovere con cautela la siringa dalla pompa della siringa e utilizzare le pinze per rimuovere l'ago, facendo attenzione a non toccarlo. Ripetere la procedura fino a quando la sospensione cellulare non è stata esposta al numero desiderato di impulsi di sforzo di taglio del fluido. Eseguire saggi di vitalità con i campioni statici prima di esporre le cellule allo stress di taglio del fluido.Per i saggi enzimatici, trasferire aliquote di 100 microliti dai campioni statici in duplice copia in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, raccogliere 100 microlitri di campioni dopo l'esposizione allo stress da taglio del fluido e posizionarli in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri di una soluzione di resazurina da 0,15 milligrammi per millilitro a ciascun pozzetto del campione e ai pozzetto contenenti 100 microlitri di solo mezzo.Incubare le piastre del pozzo nell'incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius per due ore, quindi misurare la fluorescenza e l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre e ottenere la percentuale di cellule vitali confrontando il segnale medio da ciascuno dei campioni esposti allo stress di taglio del fluido con il campione di controllo medio a statico. Allo stesso modo, raccogliere aliquote da campioni statici per eseguire citometria a flusso e saggi clonogenici come descritto nel manoscritto di testo. Nell'analisi rappresentativa, la vitalità delle cellule tumorali epiteliali mammarie della biopsia singeneica è stata valutata utilizzando la conversione della resazurina dopo aver esposto le cellule a una serie di impulsi di stress da taglio fluido.Anche se ogni linea cellulare mostrava diversi profili di resistenza, non vi era alcuna differenza significativa nella vitalità dopo 10 impulsi di esposizione allo stress da taglio del fluido. Ulteriori linee cellulari tumorali da una varietà di origini tissutali hanno dimostrato la vitalità di oltre il 20% dopo 10 impulsi di stress da taglio fluido, ad eccezione delle cellule MIA PaCa-2, che hanno mostrato una vitalità inferiore al 10% a causa della sensibilità verso la distruzione meccanica da stress da taglio fluido. Quando si raccoglie il campione statico prima di applicare lo sforzo di taglio dei fluidi, assicurarsi che la sospensione cellulare sia omogeneamente miscelata.Rimuovere con attenzione l'ago con una pinza e non piegare o toccare l'ago. Oltre a misurare la vitalità cellulare, si possono valutare i cambiamenti nell'espressione genica, nella segnalazione cellulare, nella proliferazione e nella migrazione. Usando questo come modello di esposizione allo stress da taglio fluido, si può studiare sia come le cellule tumorali resistono alla distruzione da parte dello stress da taglio fluido sia valutare gli effetti dello stress da taglio fluido sulla biologia delle cellule tumorali.Questa tecnica è stata utilizzata dal nostro laboratorio e da altri per esplorare gli effetti dello stress da taglio fluido sulle cellule tumorali circolanti. Questi studi hanno dimostrato che lo stress da taglio del fluido altera rapidamente le proprietà meccaniche delle cellule tumorali e che ciò contribuisce alla capacità delle cellule tumorali di resistere alla distruzione da parte dello stress da taglio del fluido.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Ricerca

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Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

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