Name: modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

여기에서 입증된 모델의 개발은 DOD 보조금 W81XWH-12-1-0163, NIH 보조금 R21 CA179981 및 R21 CA196202 및 사토 메타스타시스 연구 기금에 의해 지원되었다.

1. 셀 준비
<ol><li>사용 중 세포주에 대한 권장 지침을 준수하여 70-90% 컨실업할 때 조직 배양 접시에서 세포를 방출한다.<ol>
<li>예를 들어, PC-3 세포의 성장 배지를 흡인시키고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 식염수(PBS)의 5mL로 세포의 10cm 접시를 세척한다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜을 사용하여 0.25 %의 트립신1 mL을 추가하기 전에 PBS를 흡입하십시오.</li>
		<li>반전 된 현미경하에서 세포의 분?...

<ol>
	<li>Dillek&#229;s, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+90%+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases.">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells.">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li><li>Labelle, M., Hynes, R. 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이 논문은 주사기와 바늘을 사용하여 현탁액의 암세포에 FSS의 적용을 보여줍니다. 이 모델을 사용하여, 암세포는 비변형 상피세포(15,22,24)에비해 높은 수준의 FSS의 짧은 펄스에 더 저항하는 것으로 나타났다. 더욱이, 본 모델을 이용한 금감원에 노출되면 세포 강성, RhoA의 활성화, 피질 F-액틴 및 미오신 II 기반 수축도<sup class="x...

전이, 또는 초기 종양 부위를 넘어 암의 확산은 암 사망률1의근본적인 주요 인자이다. 전이 중, 암세포는 순환 계통을 고속도로로서 활용하여 몸 전체에 먼 부위로 전파한다2,3. 이러한 사이트로 가는 도중에, 순환 종양 세포(CtC)는 그들의 원래 1차종양3,4,5와는 달리 동적 유체 미세 환경 내에 존재한다. 이 유체 미세 환경은 전이4에많은 장벽 중 하나입니다 제안되었습니다. 전이성 비효율성의 개념, 즉, 순환을 입력하는 대부분의 CtC가 멸망하거나 생산적인 전이성 콜로니6,7,8을형성하지 않는다는개념에대한 광범위한 합의가 있다. 그러나, 왜 전이개별 CTC의 관점에서 비효율적이다는 것은 덜 확실하고 조사의 적극적인 영역으로 남아 있습니다. CTC는 세포외 매트릭스로부터 분리되고, 1차 종양에 존재할 수 있는 수용성 성장 및 생존 인자를 박탈하고, 1차 종양4와는 훨씬 다른 방식으로 면역 계통 및 혈역학력에 노출된다. 이러한 요인의 각각은 CtC의 가난한 생존에 기여할 수 있습니다,하지만 그들의 상대적 기여는 불분명하다. 이 백서는 혈역학적 힘이 CTC에 미치는 영향에 대한 문제를 다룹니다.
CTC에 대한 혈역학적 힘의 영향을 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 현재, 전체 현부종 역학 (모세 혈관에 심장) 및 인간 혈관 시스템의 유변학적 특성을 복제 할 수있는 체외 시스템에 엔지니어링 된 이 없습니다. 또한 CtC가 순환 시스템을 어떻게 경험하는지 완전히 명확하지는 않습니다. 실험적인 기록은 대부분의 암세포가 혈액 세포 같이 연속해서 순환하지 않는다는 것을 표시합니다. 오히려, 비교적 큰 크기(직경 10-20 μm)로 인해 대부분의 CTC는 모세관 침대(직경 6-8 μm)에 갇혀 가변 길이(들에서 일)에 대해 죽거나 사치스라우거나 다음 모세혈관 침대8,9,10,11로변위된다. 그러나 CTC 크기가 생체 내에서 더 이질적일 수 있으며 더 작은 CTC가12를검출할 수 있다는 몇 가지 증거가 있습니다. 따라서 거리 및 혈류 속도에 따라 CTC는 이러한 함정 기간 사이에 몇 초 동안만 자유롭게 순환할 수 있지만 이러한 행동에 대한 정량적 설명은13이부족합니다.
또한, CtC가 혈액 순환을 입력하는 위치에 따라, 그들은 폐 및 기타 주변 부위의 여러 모세관 침대를 통과하고 최종 목적지에 도달하기 전에 오른쪽과 왼쪽 심장을 통과 할 수 있습니다. 길을 따라, CTC는 유체 전단 응력 (FSS), 마이크로 순환에 자신의 함정 동안 압축 력, 잠재적으로, 그들은 혈관 벽을 따라 백혈구와 같은 롤링을 나타낼 수있는 상황에서 견인 력을 포함하여 다양한 혈역학 적 스트레스에노출된다 14. 따라서, 모델링할 CTC 동작의 순환 및 이해를 모델링하는 능력은 모두 제한적이다. 이 불확실성 때문에, 체외 모형 시스템에서 어떤 사실 인정든지 실험적인 척추동물 유기체에서 그리고 궁극적으로, 암 환자에서 확인되어야 합니다.
앞서 언급한 주의 사항으로, 이 논문은 2012년15년에처음 설명된 CTC에 대한 FSS의 효과를 조사하기 위해 현탁액의 세포에 FSS를 적용하는 비교적 간단한 모델을 보여 준다. 금감원은 혈관 벽에 대한 혈류의 마찰로 인해 더 큰 혈관의 라미나르 흐름 조건에서 포물선 속도 그라데이션을 생성합니다. 세포는 혈관 벽 근처 FSS의 상부를 경험하고 혈관의 중심 근처 낮은 수준. 하겐-포수유 방정식에 의해 설명된 바와 같이, 흐름이 발생하는 도관의 유체 점도, 유량 및 치수는 FSS에 영향을 미친다. 이것은 뉴턴 액체로 행동하는 혈액 흐름에 적용되지만 미세 순환을 위해 보유하지 않습니다. 생리적 금감원은 림프계(<1dyn/cm2)에서가장 낮은 수준과 심장 판막 및 죽상 경화성 플라크(>500 dyn/cm2)5에서가장 높은 수준으로 여러 수주 이상의 크기를 다양하게 다양하게 다수 범위로 한다. 동맥의 평균 벽 전단 응력은 10-70 dyn/cm2 및 1-6 dyn/cm2 in 정맥16,17이다.
심장에서, 세포는 매우 높은 수준의 밸브 전단지 주위의 난류 흐름에 노출될 수 있지만, 매우 짧은 기간 FSS는18,19를경험할 수 있다. 바이오프로시전은 오랫동안 FSS가 현탁액의 포유류 세포에 미치는 영향을 연구해 왔지만, 이 정보는 일반적으로장기간 20에걸쳐 적용되는 FSS의 훨씬 낮은 수준에 초점을 맞추고 있기 때문에 CtC에 대한 FSS의 효과를 이해하기 위한 제한된 가치일 수 있다. 아래에 설명된 바와 같이, 주사기와 바늘을 사용하여, 세포 현탁액에 상대적으로 짧은 (밀리초) 기간 동안 상대적으로 높은 (수만 ~ 수천 개의 다인/cm2)FSS를 적용할 수 있다. 이모델(15)의초기 설명 이후, 다른 사람들은암세포(21,22,23)에대한 FSS의 효과를 연구하기 위해 이를채택하였다. FSS의 여러 "펄스"는 다운스트림 실험 분석을 용이하게하기 위해 짧은 기간 동안 세포 현탁액에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 모델은 적용된 펄스 수의 함수로서 세포 생존가능성을 측정하여 FSS에 의한 기계적 파괴에 저항하는 세포의 능력을 측정하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, FSS 노출이 암세포의 생물학에 미치는 영향은 다양한 다운스트림 분석을 위해 세포를 수집하여 탐구할 수 있다. 중요한 것은, 셀 서스펜션의 일부는 정지에 보관된 세포 분리 및 시간과 연관될 수 있는 것과 FSS의 효력을 비교하기 위하여 정적 제어로 예약됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black bottom plate</td>
			<td>Costar - Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence detector</td>
			<td>AMI</td>
			<td>AMI HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Titer Blue</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>D-LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle

전이 도중, epithelia를 포함하여 고체 조직에서 암세포는, 혈역학 적인 흐름 때문에 기계적인 긴장에 드러나는 림프및 조혈 순환에 접근을 얻습니다. 순환 종양 세포 (CtC) 경험 이러한 스트레스 중 하나는 유체 전단 스트레스 (FSS)입니다. 암세포는 간질 적인 흐름 때문에 종양 내의 FSS의 낮은 수준을 경험할 수 있는 동안, CTC는, 세포외 매트릭스 부착 없이, FSS의 훨씬 더 중대한 수준에, 드러냅니다. 생리학적으로, 금감원은 3~4배 이상의 크기로 림프제(<1dyne/cm2)에 존재하는 낮은수준과 세포가 심장을 통과하고 심장 판막(>500dynes/cm2)을통과할 때 가장 높은 수준이 간략하게 존재한다. 다양한 시간 프레임에 걸쳐 다양한 범위의 생리 전단 응력을 모델링하도록 설계된 몇 가지 체외 모델이 있습니다. 이 논문은 간단한 주사기 및 바늘 시스템을 사용하여 암 세포 생물학에 대한 높은 수준의 FSS의 짧은 (밀리초) 펄스의 결과를 조사하는 모델을 설명합니다.

FSS 유도 된 기계적 파괴에 대한 높은 저항은 이전에 비 변형 상피 세포 비교기(15,24)에비해 종양으로부터 갓 분리 된 다중 암 세포 주 및 암 세포에 걸쳐 보존 된 표현형으로 나타났다. 여기서, 다양한 조직 기원으로부터의 추가 암 세포주(표2)는이들 세포의 대부분이 250 μL/s에서 FSS의 10펄스 후 20%≥ 표시한다는 것을 입증하기 위해 시험되었?...

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Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

여기서 우리는 순환 종양 세포에 대한 혈역학 적 스트레스의 효과를 모델링하기 위해 현탁액의 암세포에 유체 전단 스트레스를 적용하는 방법을 시연한다.

주사기와 바늘을 사용하여 순환 종양 세포에 혈역학 적 스트레스의 효과 모델링

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

이 프로토콜은 전이성 암세포가 순환 계통에있는 동안 혈역학력에 어떻게 노출되는지의 특정 측면을 모방하기 위하여 액체 전단 긴장의 짧은 펄스에 현탁액에 있는 암세포를 노출합니다. 그것은 높은 수준의 유체 전단 응력의 짧은 펄스를 적용하는 비교적 간단한 기술이다. 이 프로토콜을 시도할 때는 제한되지 않은 바늘에 주의하고 이를 적용한 힘 전단 응력이 변경되기 때문에 구부리지 마십시오.이 절차는 에어로졸을 생성할 수 있으므로 적절한 안전 조치를 사용합니다. 먼저, 성장 배지를 달아10센티미터 접시를 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세척하여 조직 배양 접시에서 70~90%의 컨컬라이트 PC3 세포를 방출한다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 0.25 %의 트립신 1 밀리리터를 추가하십시오.트립시화 후, 반전 된 현미경하에서 세포의 분리를 관찰한다. 트립신을 억제하려면 10%의 FBS를 함유한 DMEM/F12 배지 5밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 원내 튜브에 넣고 세포 농도 및 총 세포 수를 결정한다.3분 동안 세포 현탁액을 300 x g로 원심분리한 다음, 수퍼네티티를 흡인하고 혈청이 없는 조직 배양 배지에서 펠릿을 재놓습니다. 7 밀리리터 라인에서 14 밀리리터 폴리스티렌 튜브의 바닥을 잘라 절단 튜브에 혼합 세포 현탁액을 배치합니다. 별도로 유체 전단 응력 노출 전에 세포의 정적 제어 샘플을 수집하여 해석을 수행하는 데 사용됩니다.나머지 세포 서스펜션 샘플을 유체 전단 응력에 노출하려면 셀 서스펜션을 5 밀리리터 주사기로 끌어넣고 30 게이지 하프 인치 바늘을 부착합니다. 주사기 펌프에 캡이 없는 바늘로 주사기를 배치하고 고정하고 유량을 설정하여 원하는 수준의 유체 전단 응력에 도달합니다. 주사기 펌프를 실행하고 발포를 줄이기 위해 절단 튜브에서 식기 샘플을 약 45도 각도로 수집합니다.주사기 펌프에서 주사기를 조심스럽게 제거하고 펜치를 사용하여 바늘을 제거하여 만지지 않도록주의하십시오. 세포 현탁액이 유체 전단 응력의 원하는 수의 펄스에 노출 될 때까지 절차를 반복하십시오. 유체 전단 응력에 세포를 노출하기 전에 정적 샘플로 생존 가능성 해석을 수행합니다.효소 적 해석의 경우, 96 웰 플레이트로 복제된 정적 샘플에서 100개의 마이크로리터 알리쿼트를 전송합니다. 그런 다음 유체 전단 응력 노출 후 100 마이크로 리터의 샘플을 수집하고 96 웰 플레이트에 놓습니다. 각 샘플에 밀리리터 레사쥐린 용액당 0.15 밀리그램의 20 마이크로리터를 추가하고 100 마이크로리터만 함유된 웰에 첨가합니다.섭씨 37도 조직 배양 배양 인큐베이터에서 웰 플레이트를 2시간 동안 배양한 다음 플레이트 판독기를 사용하여 형광및 흡광도를 측정하고 각 유체 전단 응력으로부터 의 평균 신호를 정적 제어 샘플에 평균으로 비교하여 실행 가능한 세포의 백분율을 얻습니다. 마찬가지로, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 유동 세포측정 및 clonogenic 분석법을 수행하기 위해 정적 샘플에서 알리쿼시를 수집합니다. 대표적인 분석에서, 합성 생검 유방 상피암세포의 생존가능성은 다수의 유체 전단 응력 펄스에 세포를 노출한 후 resazurin 변환을 사용하여 평가되었다.각 세포주가 서로 다른 저항 프로파일을 표시하더라도, 유체 전단 응력 노출의 10 펄스 후에 생존가능성에 있는 유의한 다름이 없었습니다. 다양한 조직 기원으로부터의 추가 암 세포선은 유체 전단 스트레스로 인한 기계적 파괴에 대한 민감성으로 인해 10% 미만의 생존력을 보인 MIA PaCa-2 세포를 제외한 10펄스 의 유체 전단 응력 후 20% 이상의 생존가능성을 입증하였다. 유체 전단 응력 적용 전에 정적 샘플을 수집할 때 셀 서스펜션이 균질적으로 혼합되어 있는지 확인하십시오.조심스럽게 펜치로 바늘을 제거하고 구부리거나 바늘을 만지지 않습니다. 세포 생존 가능성을 측정하는 것 외에도 유전자 발현, 세포 신호, 증식 및 마이그레이션의 변화를 평가할 수 있습니다. 유체 전단 스트레스에 노출의 모델로 이것을 사용하여, 하나는 암세포가 유체 전단 응에 의한 파괴에 저항하는 방법을 연구하고 암세포의 생물학에 액체 전단 응력의 효력을 평가할 수 있습니다.이 기술은 순환 종양 세포에 액체 전단 긴장의 효력을 탐구하기 위하여 우리의 실험실 및 그 외에 의해 이용되었습니다. 이러한 연구는 유체 전단 스트레스가 암세포의 기계적 특성을 빠르게 변화시키고 이것이 유체 전단 스트레스에 의한 파괴에 저항하는 암세포의 능력에 기여한다는 것을 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

연구

암 연구학

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...