Name: modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

Utviklingen av modellen som ble demonstrert her ble støttet av DOD grant W81XWH-12-1-0163, NIH gir R21 CA179981 og R21 CA196202, og Sato Metastasis Research Fund.

1. Celleforberedelse
<ol><li>Slipp celler fra vevskulturretten når 70-90% sammenfaller ved å følge de anbefalte retningslinjene for cellelinjen som er i bruk.<ol>
<li>For eksempel aspirer vekstmediet for PC-3-celler, og vask 10 cm parabolen av celler med 5 ml kalsium- og magnesiumfri fosfatbufret saltvann (PBS).</li>
		<li>Aspirer PBS før du legger til 1 ml 0,25 % trypsin ved hjelp av produsentens protokoll.</li>
		<li>Etter å ha observert løsningen av cellene under et invertert mikroskop, tilsett 5 ml DMEM: F12 ...

<ol>
	<li>Dillek&#229;s, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+90%+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases.">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells.">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li><li>Labelle, M., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+hours+of+metastasis:+the+importance+of+cooperative+host-tumor+cell+interactions+during+hematogenous+dissemination.">The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).</li><li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment.">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li><li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+inefficiency.">Metastatic inefficiency.</a> Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).</li><li>Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+number+of+tumor+metastases;+experiments+with+a+transplantable+mouse+tumor.">Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor.</a> Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+quantitative+analysis+of+distribution+and+fate+of+tumor+embolilabeled+with+125+I-5-iodo-2'-deoxyuridine.">Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine.</a> Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).</li><li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+metastasis+in+lung:+cell+survival,+dormancy,+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency.">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li><li>Luzzi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+nature+of+metastatic+inefficiency:+dormancy+of+solitary+cells+after+successful+extravasation+and+limited+survival+of+early+micrometastases.">Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.</a> American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+circulating+tumor+cell+capture+ability+of+a+slit+filter-based+method+in+comparison+to+a+selection-free+method+in+multiple+cancer+types.">Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types.</a> International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).</li><li>Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+metastasis--integrating+intravasation,+circulation+and+end-organ+colonization.">Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+fluid+shear+stress+is+a+conserved+biophysical+property+of+malignant+cells.">Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells.</a> PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Brass, L. F., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+physics+and+biorheology+in+the+setting+of+hemostasis+and+thrombosis.">Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).</li><li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulent+blood+flow+in+the+ascending+aorta+of+humans+with+normal+and+diseased+aortic+valves.">Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).</li><li>Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+shear+stress+and+hemodynamic+factors+in+a+model+of+coronary+artery+stenosis+and+thrombosis.">Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis.</a> The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).</li><li>Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing,+aeration+and+cell+damage,+30++years+later:+what+we+learned,+how+it+affected+the+cell+culture+industry+and+what+we+would+like+to+know+more+about.">Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).</li><li>Vennin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trsient+tissue+priming+via+ROCK+inhibition+uncouples+pancreatic+cancer+progression,+sensitivity+to+chemotherapy,+and+metastasis.">Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.</a> Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).</li><li>Mitchell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+reduces+circulating+tumor+cell+resistance+to+fluid+shear+stress.">Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).</li><li>Ortiz-Otero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+confer+shear+resistance+to+circulating+tumor+cells+during+prostate+cancer+metastatic+progression.">Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression.</a> Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).</li><li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA/actomyosin-dependent+mechano-adaptation.">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li><li>Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tumour+cell+composition+in+tumours+composed+of+paired+mixtures+of+mammary+tumour+cell+lines.">Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines.</a> British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).</li><li>Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cancer+cell+mechanical+properties+after+fluid+shear+stress+exposure:+a+micropipette+aspiration+study.">Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study.</a> Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).</li><li>Gensbittel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+adaptability+of+tumor+cells+in+metastasis.">Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis.</a> Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).</li><li>O'Leary, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+ascorbate+inhibits+pancreatic+cancer+metastases+via+a+peroxide-mediated+mechanism.">Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).</li><li>Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysis+near+a+transversely+oscillating+wire.">Hemolysis near a transversely oscillating wire.</a> Science. 169 (3948), 871-873 (1970).</li><li>Rooney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysis+near+an+ultrasonically+pulsating+gas+bubble.">Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble.</a> Science. 169 (3948), 869-871 (1970).</li><li>Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+inertial+positions+and+viability+of+cells+in+suspension+under+different+in+vivo+flow+conditions.">The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).</li><li>Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biorheology+of+tumor+cells.">The biorheology of tumor cells.</a> Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).</li><li>Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+induces+cancer+stem+cell-like+phenotype+in+MCF7+breast+cancer+cell+line+without+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).</li><li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+shear+flow+alters+the+viability+and+proliferation+of+circulating+colon+cancer+cells.">Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 27073 (2016).</li><li>Fu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+MnSOD+promotes+survival+of+circulating+breast+cancer+cells+and+increases+their+resistance+to+doxorubicin.">High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin.</a> Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways.">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival/chemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow.">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li></ol>

Dette dokumentet demonstrerer anvendelsen av FSS til kreftceller i suspensjon ved hjelp av en sprøyte og nål. Ved hjelp av denne modellen har kreftceller vist seg å være mer motstandsdyktige mot korte pulser av høynivå FSS i forhold til ikke-transformerte epitelceller15,22,24. Videre resulterer eksponering for FSS ved hjelp av denne modellen i en rask økning i cellestivhet, aktivering av RhoA og økt kortikale F-aktin- og...

Metastase, eller spredning av kreft utover det første tumorstedet, er en viktig faktor som ligger til grunn for kreftdødelighet1. Under metastase bruker kreftceller sirkulasjonssystemet som en motorvei for å spre seg til fjerne steder i hele kroppen2,3. Mens de er på vei til disse stedene, eksisterer sirkulerende tumorceller (CTCer) i et dynamisk væskemikromiljø i motsetning til deres opprinnelige primæresvulst 3,4,5. Det er foreslått at dette flytende mikromiljøet er en av mange barrierer for metastase4. Det er bred enighet i begrepet metastatisk ineffektivitet, det vil si at de fleste CTCer som kommer inn i sirkulasjonen enten går til grunne eller ikke danner produktive metastatiske kolonier6,7,8. Men hvorfor metastase er ineffektiv fra perspektivet til en individuell CTC er mindre sikker og forblir et aktivt undersøkelsesområde. CTCer er løsrevet fra ekstracellulær matrise, fratatt løselig vekst og overlevelsesfaktorer som kan være til stede i primærsvulsten, og utsatt for immunsystemet og hemodynamiske krefter på en mye annen måte enn i den primære svulsten4. Hver av disse faktorene kan bidra til dårlig overlevelse av CTCer, men deres relative bidrag er uklare. Dette dokumentet tar for seg spørsmålet om hvordan hemodynamiske krefter påvirker CTCer.
Det er ganske utfordrende å studere effekten av hemodynamiske krefter på CTCer. For tiden er det ingen konstruerte in vitro-systemer som kan gjenskape hele den romlige dynamikken (hjerte til kapillærer) og reologiske egenskaper til det menneskelige vaskulære systemet. Dessuten er det ikke helt klart hvordan CTCer opplever sirkulasjonssystemet. Eksperimentelle bevis indikerer at de fleste kreftceller ikke sirkulerer kontinuerlig som blodceller. Snarere, på grunn av deres relativt store størrelse (10-20 μm i diameter), blir de fleste CTCer fanget i kapillære senger (6-8 μm i diameter) for variable tidslengder (s til dager) hvor de kan dø, ekstravasere eller bli forskjøvet til neste kapillære seng8,9,10,11. Det er imidlertid noen bevis på at CTC-størrelse kan være mer heterogen in vivo, og at mindre CTCer kan påvises12. Derfor, basert på avstand og blodstrømhastighet, kan CTCer bare sirkulere fritt i noen sekunder mellom disse periodene med entrapment, selv om en kvantitativ beskrivelse av denne oppførselen mangler13.
Videre, avhengig av hvor CTCer kommer inn i sirkulasjonen, kan de passere gjennom flere kapillære senger i lungen og andre perifere steder og gjennom både høyre og venstre hjerte før de når sitt endelige reisemål. Underveis blir CTCer utsatt for ulike hemodynamiske påkjenninger, inkludert væskeskjærspenning (FSS), kompresjonskrefter under deres innblanding i mikrosirkulasjonen, og potensielt trekkraftkrefter under omstendigheter der de kan vise leukocyttlignende rullende langs blodkarvegger14. Dermed er både evnen til å modellere sirkulasjonen og forståelsen av CTC-oppførselen som skal modelleres begrenset. På grunn av denne usikkerheten bør eventuelle funn fra in vitro-modellsystemer valideres i en eksperimentell virveldyrorganisme og til slutt hos kreftpasienter.
Med de nevnte forbeholdene demonstrerer dette papiret en relativt enkel modell for å bruke FSS på celler i suspensjon for å undersøke effekten av FSS på CTCer som først ble beskrevet i 201215. FSS skyldes friksjon av blodstrøm mot karveggen, som produserer en parabolsk hastighetsgradient under forhold med laminær strømning i større kar. Celler opplever høyere nivåer av FSS nær karvegger og lavere nivåer nær midten av blodkaret. Væskeviskositet, strømningshastighet og dimensjoner på ledningen gjennom hvilken strømmen oppstår påvirker FSS, som beskrevet av Hagen-Poiseuille-ligningen. Dette gjelder blodstrømmer som oppfører seg som newtonske væsker, men holder ikke for mikrosirkulasjonen. Fysiologisk FSS varierer over flere størrelsesordener med de laveste nivåene i lymfetikken (<1 dyn/cm2) og den høyeste i områder rundt hjerteklaffer og aterosklerotiske plakk (>500 dyn/cm2)5. Gjennomsnittlig veggskjær stress i arterier er 10-70 dyn / cm2 og 1-6 dyn / cm2 i årer16,17.
I hjertet kan celler bli utsatt for turbulente strømmer rundt ventilbrosjyrer der det er svært høyt nivå, men svært kortvarig FSS kan oppleves18,19. Selv om bioprosesseringsfeltet lenge har studert effekten av FSS på pattedyrceller i suspensjon, kan denne informasjonen være av begrenset verdi for å forstå effekten av FSS på CTCer, da den generelt fokuserer på mye lavere nivåer av FSS brukt over lang varighet20. Som beskrevet nedenfor, ved hjelp av en sprøyte og nål, kan man bruke relativt høy (titusenvis dyn / cm2) FSS for en relativt kort (millisekunder) varighet til en celleoppheng. Siden den første beskrivelsen av denne modellen15, har andre brukt den til å studere effekten av FSS på kreftceller21,22,23. Flere "pulser" av FSS kan brukes på cellefjæringer på kort tid for å lette nedstrøms eksperimentelle analyser. For eksempel kan denne modellen brukes til å måle cellenes evne til å motstå mekanisk ødeleggelse av FSS ved å måle celle levedyktighet som en funksjon av antall pulser som brukes. Alternativt kan effekten av FSS-eksponering på biologien til kreftceller utforskes ved å samle celler for en rekke nedstrømsanalyser. Det er viktig at en del av celleopphenget er reservert som en statisk kontroll for å sammenligne effekten av FSS fra de som kan være forbundet med celleavløsning og tid som holdes i suspensjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black bottom plate</td>
			<td>Costar - Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence detector</td>
			<td>AMI</td>
			<td>AMI HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Titer Blue</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>D-LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle

Under metastase får kreftceller fra fast vev, inkludert epithelia, tilgang til lymfatisk og hematogen sirkulasjon der de blir utsatt for mekanisk stress på grunn av hemodynamisk strømning. En av disse påkjenningene som sirkulerende tumorceller (CTCer) opplever er væskeskjærspenning (FSS). Mens kreftceller kan oppleve lave nivåer av FSS i svulsten på grunn av interstitiell strømning, blir CTCer utsatt, uten ekstracellulær matrisefeste, til mye større nivåer av FSS. Fysiologisk varierer FSS over 3-4 størrelsesordener, med lave nivåer tilstede i lymfatikk (<1 dyne / cm2) og de høyeste nivåene presenterer kort når cellene passerer gjennom hjertet og rundt hjerteklaffer (>500 dysener / cm2). Det er noen få in vitro-modeller designet for å modellere forskjellige områder av fysiologisk skjærspenning over ulike tidsrammer. Dette dokumentet beskriver en modell for å undersøke konsekvensene av korte (millisekunder) pulser av høynivå FSS på kreftcellebiologi ved hjelp av en enkel sprøyte og nålsystem.

Forhøyet resistens mot FSS-indusert mekanisk ødeleggelse har tidligere vist seg å være en konservert fenotype på tvers av flere kreftcellelinjer og kreftceller som er fersk isolert fra svulster i forhold til ikke-transformerte epitelcellekomparatorer15,24. Her ble ytterligere kreftcellelinjer fra en rekke vevsopprinnelse (tabell 2) testet for å demonstrere at de fleste av disse cellene viser levedyktighet ≥ 20% etter 10 pulser av FSS ved ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Her demonstrerer vi en metode for å bruke væskeskjærspenning på kreftceller i suspensjon for å modellere effekten av hemodynamisk stress på sirkulerende tumorceller.

Modellering av effekten av hemodynamisk stress på sirkulerende tumorceller ved hjelp av en sprøyte og nål

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Denne protokollen eksponerer kreftceller i en suspensjon for korte pulser av væskeskjærspenning for å etterligne visse aspekter av hvordan metastatiske kreftceller blir utsatt for hemodynamiske krefter mens de er i sirkulasjonssystemet. Det er en relativt enkel teknikk å bruke korte pulser av flytende skjærspenning på høyt nivå. Når du prøver denne protokollen, vær forsiktig på uappeterte nåler og ikke bøy dem, da dette vil endre påført kraftskjærspenning.Denne prosedyren kan produsere aerosoler, så bruk passende sikkerhetstiltak. Til å begynne med frigjør du 70 til 90% sammenfølende PC3-celler fra vevskulturretten ved å aspirere vekstmediet og vaske 10 centimeter parabolen med fem milliliter kalsium- og magnesiumfri PBS. Deretter aspirerer du PBS og legger til en milliliter 0,25% trypsin.Etter-trypsinisering, observere løsningen av cellene under et invertert mikroskop. For å hemme trypsin, legg til fem milliliter DMEM / F12 medium som inneholder 10% FBS. Deretter plasserer du celleopphenget i et konisk rør og bestemmer cellekonsentrasjonen og det totale cellenummeret.Sentrifuger cellefjæringen ved 300 x g i tre minutter, aspirer deretter supernatanten og resuspend pellet i et serumfritt vevskulturmedium. Klipp rundt bunnen av 14 milliliter polystyrenrør på syv milliliterlinjen og legg blandet cellefjæring i kuttrøret. Samle statiske kontrollprøver av celler separat før væskeskjær stresseksponering for bruk for å utføre analyser.For å eksponere den gjenværende celleopphengsprøven for væskeskjærspenning, trekk celleopphenget inn i en fem milliliter sprøyte og fest en 30 gauge halv tomme nål. Plasser og fest sprøyten med en uappetål på en sprøytepumpe og still inn strømningshastigheten for å oppnå ønsket nivå av væskeskjærspenning. Kjør sprøytepumpen og samle den skjærede prøven i kuttrøret i en ca. 45 graders vinkel for å redusere skumming.Fjern sprøyten forsiktig fra sprøytepumpen og bruk tanger for å fjerne nålen, pass på at du ikke berører den. Gjenta prosedyren til celleopphenget har blitt utsatt for ønsket antall pulser av væskeskjærspenning. Utfør levedyktighetsanalyser med de statiske prøvene før du utsetter cellene for væskeskjærspenning.For enzymatiske analyser, overfør 100 mikroliter aliquots fra de statiske prøvene i duplikat til en 96-brønns plate. Samle deretter 100 mikroliter prøver etter væskeskjær stresseksponering og legg dem i en 96-brønns plate. Tilsett 20 mikroliter av en resazurinløsning på 0,15 milligram per milliliter til hver prøvebrønn og til brønner som inneholder 100 mikroliter middels alene.Inkuber brønnplatene i 37 grader Celsius vevskulturinkubator i to timer, mål deretter fluorescens og absorbans ved hjelp av en plateleser og oppnå prosentandelen levedyktige celler ved å sammenligne gjennomsnittlig signal fra hver av væskeskjærspenningen utsatte prøver til gjennomsnittet til statisk kontrollprøve. På samme måte samler du aliquots fra statiske prøver for å utføre strømningscytometri og klonogene analyser som beskrevet i tekstmanuskriptet. I den representative analysen ble levedyktigheten til epitelkreftceller med biopsipattedyr vurdert ved hjelp av resazurinkonvertering etter å ha eksponert celler for en rekke væskeskjærstresspulser.Selv om hver cellelinje viste forskjellige motstandsprofiler, var det ingen signifikant forskjell i levedyktighet etter 10 pulser av væskeskjær stresseksponering. Ytterligere kreftcellelinjer fra en rekke vevsopprinnelse viste levedyktigheten til mer enn 20% etter 10 pulser av væskeskjærstress, bortsett fra MIA PaCa-2-celler, som viste en levedyktighet på mindre enn 10% på grunn av følsomhet mot mekanisk ødeleggelse fra væskeskjærspenning. Når du samler den statiske prøven før du bruker væsker skjærspenning, må du sørge for at celleopphenget er en homogent blandet.Fjern nålen forsiktig med tang og ikke bøy eller berør nålen. I tillegg til å måle celle levedyktighet, kan man evaluere endringer i genuttrykk, cellesignalering, spredning og migrasjon. Ved å bruke dette som en modell for eksponering for væskeskjærstress, kan man studere både hvordan kreftceller motstår ødeleggelse av væskeskjærstress og evaluerer effekten av væskeskjærspenning på biologien til kreftceller.Denne teknikken har blitt brukt av vårt laboratorium og andre for å utforske effekten av væskeskjærspenning på sirkulerende tumorceller. Disse studiene har vist at væskeskjærstress raskt endrer de mekaniske egenskapene til kreftceller, og at dette bidrar til kreftcellens evne til å motstå ødeleggelse av væskeskjærstress.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av sirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering av en lunge kolonisering analysen for sirkulerende svulst celle effekt i lunge vev

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakteristikk av tumorceller bruke en medisinsk ledning for å fange sirkulerende kreftceller: en 3D tilnærming basert på Immunofluorescence og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging tilnærminger til vurderinger av toksikologiske oksidativt Stress bruker genetisk kodet Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metode for å definere effekten av miljømessig berikelse på kolon Microbiome biologisk mangfold i en mus kolon svulst modell

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...