Name: modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

Utvecklingen av den modell som demonstrerades här stöddes av DOD-bidraget W81XWH-12-1-0163, NIH-bidrag R21 CA179981 och R21 CA196202 och Sato Metastasis Research Fund.

1. Cellberedning
<ol><li>Frigör celler från vävnadskulturrätt när 70-90% sammanflöde genom att följa de rekommenderade riktlinjerna för den cellinje som används.<ol>
<li>Aspirera till exempel tillväxtmediet för PC-3-celler och tvätta cellernas 10 cm skål med 5 ml kalcium- och magnesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
		<li>Aspirera PBS innan du lägger till 1 ml 0,25% trypsin med tillverkarens protokoll.</li>
		<li>Efter att ha observerat avlossningen av cellerna under ett inverterat mikroskop, t...

<ol>
	<li>Dillek&#229;s, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+90%+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases.">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells.">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li><li>Labelle, M., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+hours+of+metastasis:+the+importance+of+cooperative+host-tumor+cell+interactions+during+hematogenous+dissemination.">The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).</li><li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment.">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li><li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+inefficiency.">Metastatic inefficiency.</a> Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).</li><li>Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+number+of+tumor+metastases;+experiments+with+a+transplantable+mouse+tumor.">Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor.</a> Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+quantitative+analysis+of+distribution+and+fate+of+tumor+embolilabeled+with+125+I-5-iodo-2'-deoxyuridine.">Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine.</a> Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).</li><li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+metastasis+in+lung:+cell+survival,+dormancy,+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency.">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li><li>Luzzi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+nature+of+metastatic+inefficiency:+dormancy+of+solitary+cells+after+successful+extravasation+and+limited+survival+of+early+micrometastases.">Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.</a> American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+circulating+tumor+cell+capture+ability+of+a+slit+filter-based+method+in+comparison+to+a+selection-free+method+in+multiple+cancer+types.">Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types.</a> International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).</li><li>Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+metastasis--integrating+intravasation,+circulation+and+end-organ+colonization.">Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+fluid+shear+stress+is+a+conserved+biophysical+property+of+malignant+cells.">Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells.</a> PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Brass, L. F., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+physics+and+biorheology+in+the+setting+of+hemostasis+and+thrombosis.">Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).</li><li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulent+blood+flow+in+the+ascending+aorta+of+humans+with+normal+and+diseased+aortic+valves.">Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).</li><li>Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+shear+stress+and+hemodynamic+factors+in+a+model+of+coronary+artery+stenosis+and+thrombosis.">Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis.</a> The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).</li><li>Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing,+aeration+and+cell+damage,+30++years+later:+what+we+learned,+how+it+affected+the+cell+culture+industry+and+what+we+would+like+to+know+more+about.">Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).</li><li>Vennin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trsient+tissue+priming+via+ROCK+inhibition+uncouples+pancreatic+cancer+progression,+sensitivity+to+chemotherapy,+and+metastasis.">Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.</a> Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).</li><li>Mitchell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+reduces+circulating+tumor+cell+resistance+to+fluid+shear+stress.">Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).</li><li>Ortiz-Otero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+confer+shear+resistance+to+circulating+tumor+cells+during+prostate+cancer+metastatic+progression.">Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression.</a> Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).</li><li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA/actomyosin-dependent+mechano-adaptation.">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li><li>Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tumour+cell+composition+in+tumours+composed+of+paired+mixtures+of+mammary+tumour+cell+lines.">Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines.</a> British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).</li><li>Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cancer+cell+mechanical+properties+after+fluid+shear+stress+exposure:+a+micropipette+aspiration+study.">Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study.</a> Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).</li><li>Gensbittel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+adaptability+of+tumor+cells+in+metastasis.">Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis.</a> Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).</li><li>O'Leary, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+ascorbate+inhibits+pancreatic+cancer+metastases+via+a+peroxide-mediated+mechanism.">Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).</li><li>Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysis+near+a+transversely+oscillating+wire.">Hemolysis near a transversely oscillating wire.</a> Science. 169 (3948), 871-873 (1970).</li><li>Rooney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysis+near+an+ultrasonically+pulsating+gas+bubble.">Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble.</a> Science. 169 (3948), 869-871 (1970).</li><li>Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+inertial+positions+and+viability+of+cells+in+suspension+under+different+in+vivo+flow+conditions.">The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).</li><li>Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biorheology+of+tumor+cells.">The biorheology of tumor cells.</a> Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).</li><li>Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+induces+cancer+stem+cell-like+phenotype+in+MCF7+breast+cancer+cell+line+without+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).</li><li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+shear+flow+alters+the+viability+and+proliferation+of+circulating+colon+cancer+cells.">Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 27073 (2016).</li><li>Fu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+MnSOD+promotes+survival+of+circulating+breast+cancer+cells+and+increases+their+resistance+to+doxorubicin.">High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin.</a> Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways.">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival/chemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow.">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li></ol>

Detta dokument visar tillämpningen av FSS på cancerceller i suspension med hjälp av en spruta och nål. Med hjälp av denna modell har cancerceller visat sig vara mer resistenta mot korta pulser av högnivå FSS i förhållande till icke-omvandlade epitelceller15,22,24. Dessutom resulterar exponering för FSS med denna modell i en snabb ökning av cellstelhet, aktivering av RhoA och ökad när F-aktin och myosin II-baserad ko...

Metastasering, eller spridning av cancer bortom den ursprungliga tumörplatsen, är en viktig faktor bakom cancerdödlighet1. Under metastasering använder cancerceller cirkulationssystemet som en motorväg för att sprida sig till avlägsna platser i hela kroppen2,3. Medan på väg till dessa platser finns cirkulerande tumörceller (CTC) i en dynamisk flytande mikromiljö till skillnad från deras ursprungliga primära tumör3,4,5. Det har föreslagits att denna flytande mikromiljö är ett av många hinder för metastasering4. Det råder bred enighet i begreppet metastaserad ineffektivitet,dvs. Varför metastasering är ineffektivt ur ett individuellt CTC-perspektiv är dock mindre säkert och förblir ett aktivt undersökningsområde. CTCs är fristående från extracellulär matris, berövas löslig tillväxt och överlevnad faktorer som kan finnas i den primära tumören, och utsätts för immunsystemet och hemodynamic krafter på ett mycket annorlunda sätt än i den primära tumör4. Var och en av dessa faktorer kan bidra till ctc:s dåliga överlevnad, men deras relativa bidrag är oklara. Detta dokument tar upp frågan om hur hemodynamiska krafter påverkar CTC.
Att studera effekterna av hemodynamiska krafter på CTC är ganska utmanande. För närvarande finns det inga konstruerade in vitro-system som kan replikera hela spatiotemporal dynamiken (hjärta till kapillärer) och reologiska egenskaper hos det mänskliga kärlsystemet. Dessutom är det inte helt klart hur CTC upplever cirkulationssystemet. Experimentella bevis tyder på att de flesta cancerceller inte cirkulerar kontinuerligt som blodkroppar. Snarare, på grund av deras relativt stora storlek (10-20 μm i diameter), blir de flesta CTC fastspända i kapillärbäddar (6-8 μm i diameter) under varierande tidslängder (s till dagar) där de kan dö, extravasera eller förskjutas till nästa kapillärbädd8,9,10,11. Det finns dock vissa bevis för att CTC-storleken kan vara mer heterogen in vivo och att mindre CTC är detekterbara12. Därför, baserat på avstånd och blodflödeshastighet, får CTC endast cirkulera fritt i några sekunder mellan dessa perioder av entrapment, även om en kvantitativ beskrivning av detta beteendesaknas 13.
Beroende på var CTC:er kommer ut i cirkulationen kan de dessutom passera genom flera kapillärbäddar i lungan och andra perifera platser och genom både höger och vänster hjärta innan de når sin slutdestination. Längs vägen utsätts CTC: er för olika hemodynamiska påfrestningar inklusive vätskesjuvspänning (FSS), tryckkrafter under deras indragning i mikrocirkulationen och potentiellt dragkrafter under omständigheter där de kan uppvisa leukocytliknande rullning längs blodkärlsväggarna14. Således är både förmågan att modellera cirkulationen och förståelsen av CTC-beteendet som ska modelleras begränsad. På grund av denna osäkerhet bör eventuella resultat från in vitro-modellsystem valideras hos en experimentell ryggradsdjursorganism och i slutändan hos cancerpatienter.
Med de ovannämnda förbehållen visar detta dokument en relativt enkel modell för att tillämpa FSS på celler i suspension för att undersöka effekterna av FSS på CTC som först beskrevs 201215. FSS är resultatet av friktion av blodflödet mot kärlväggen, vilket ger en parabol hastighetsgradient under förhållanden med laminärt flöde i större kärl. Celler upplever högre nivåer av FSS nära kärlväggar och lägre nivåer nära blodkärlets centrum. Vätskeviskositet, flödeshastighet och dimensioner av röret genom vilka flödet uppstår påverkar FSS, enligt beskrivningen i ekvationen Hagen-Poiseuille. Detta gäller blodflöden som beter sig som newtonska vätskor, men håller inte för mikrocirkulationen. Fysiologisk FSS sträcker sig över flera storleksordningar med de lägsta nivåerna i lymfatiska medel (<1 dyn/cm2) och den högsta vid regioner runt hjärtklaffar och aterosklerotiska plack (>500 dyn/cm2)5. Genomsnittlig väggsjuvspänning i artärer är 10-70 dyn/cm2 och 1-6 dyn/cm2 i vener16,17.
I hjärtat kan celler utsättas för turbulenta flöden runt ventilbroschyrer där mycket hög nivå, men mycket kortvarig FSS kanupplevas 18,19. Även om biobearbetningsfältet länge har studerat effekterna av FSS på däggdjursceller i suspension, kan denna information vara av begränsat värde för att förstå effekterna av FSS på CTC eftersom den i allmänhet fokuserar på mycket lägre nivåer av FSS som tillämpas under en lång varaktighet20. Som beskrivits nedan, med hjälp av en spruta och nål, kan man applicera relativt hög (tiotusentals dyn / cm2) FSS under en relativt kort (millisekunder) varaktighet på en cellupphängning. Sedan den första beskrivningen av denna modell15, andra har använt den för att studera effekterna av FSS på cancerceller21,22,23. Flera "pulser" av FSS kan appliceras på cellupphängningar på kort tid för att underlätta experimentella analyser nedströms. Denna modell kan till exempel användas för att mäta cellernas förmåga att motstå mekanisk destruktion av FSS genom att mäta cellens livskraft som en funktion av antalet pulser som appliceras. Alternativt kan effekterna av FSS-exponering på cancercellernas biologi utforskas genom att samla celler för en mängd olika nedströmsanalyser. Viktigt är att en del av cellfjädringen reserveras som en statisk kontroll för att jämföra effekterna av FSS från de som kan vara associerade med cellavlossning och tid som hålls i suspension.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black bottom plate</td>
			<td>Costar - Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence detector</td>
			<td>AMI</td>
			<td>AMI HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Titer Blue</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>D-LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the effects of hemodynamic stress on circulating tumor cells using a syringe and needle

Under metastasering får cancerceller från fasta vävnader, inklusive epitel, tillgång till lymfatisk och hematogen cirkulation där de utsätts för mekanisk stress på grund av hemodynamiskt flöde. En av dessa påfrestningar som cirkulerande tumörceller (CTCs) erfarenhet är vätskesjuvning stress (FSS). Medan cancerceller kan uppleva låga nivåer av FSS inom tumör på grund av interstitiellt flöde, ctcs exponeras, utan extracellulära matrisfäste, för mycket högre nivåer av FSS. Fysiologiskt sträcker sig FSS över 3-4 storleksordningar, med låga nivåer i lymfatisk (<1 dyne/cm2)och de högsta nivåerna som förekommer kort när celler passerar genom hjärtat och runt hjärtklaffar (>500 dyner/cm2). Det finns några in vitro-modeller utformade för att modellera olika intervall av fysiologisk savstress under olika tidsramar. Detta dokument beskriver en modell för att undersöka konsekvenserna av korta (millisekunder) pulser av hög nivå FSS på cancercellsbiologi med hjälp av en enkel spruta och nålsystem.

Förhöjd resistens mot FSS-inducerad mekanisk förstörelse har tidigare visat sig vara en bevarad fenotyp över flera cancercelllinjer och cancerceller som nyligen isolerats från tumörer i förhållande till icke-omvandlade epitelcellsjämförelse15,24. Här testades ytterligare cancercelllinjer från en mängd olika vävnads ursprung (tabell 2) för att visa att majoriteten av dessa celler visar livskraft ≥ 20% efter 10 pulser av FSS vid 2...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle at JoVE.com

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Här demonstrerar vi en metod för att applicera vätskesjuvningsstress på cancerceller i suspension för att modellera effekterna av hemodynamisk stress på cirkulerande tumörceller.

Modellering av effekterna av hemodynamisk stress på cirkulerande tumörceller med en spruta och nål

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Detta protokoll exponerar cancerceller i en suspension för korta pulser av vätskesjuvningsstress för att efterlikna vissa aspekter av hur metastaserade cancerceller utsätts för hemodynamiska krafter medan de är i cirkulationssystemet. Det är en relativt enkel teknik att applicera korta pulser av hög nivå vätskesjuvspänning. När du försöker detta protokoll, var försiktig på oappade nålar och böj dem inte eftersom detta kommer att ändra tillämpad kraftskurarstress.Detta förfarande kan ge upphov till aerosoler, så använd lämpliga säkerhetsåtgärder. Till att börja med, släpp 70 till 90% konfluenta PC3-celler från vävnadskulturrätten genom att aspirera tillväxtmediet och tvätta 10 centimeter skålen med fem milliliter kalcium och magnesiumfri PBS. Aspirera sedan PBS och tillsätt en milliliter på 0,25% trypsin.Efter trypsinisering, observera avlossningen av cellerna under ett inverterat mikroskop. För att hämma trypsin, tillsätt fem milliliter DMEM/F12 medium som innehåller 10% FBS. Placera sedan cellupphängningen i ett koniskt rör och bestäm cellkoncentrationen och det totala cellnumret.Centrifugera cellupphängningen vid 300 x g i tre minuter, aspirera sedan supernatanten och återanvänd pelleten i ett serumfritt vävnadskulturmedium. Skär runt botten av 14 milliliter polystyrenrör vid sju milliliterlinjen och placera den blandade cellupphängningen i det skurna röret. Samla separat statiska kontrollprover av celler innan vätskesjuvning stress exponering för användning för att utföra analyser.För att utsätta det återstående cellupphängningsprovet för vätskesjuvspänning, dra cellupphängningen i en fem milliliter spruta och fäst en 30 gauge halv tums nål. Placera och fäst sprutan med en oappad nål på en sprutpump och ställ in flödeshastigheten för att uppnå önskad nivå av vätskesjuvspänning. Kör sprutpumpen och samla det klippta provet i det skurna röret i en cirka 45 graders vinkel för att minska skumbildningen.Ta försiktigt bort sprutan från sprutpumpen och använd tång för att ta bort nålen, var noga med att inte röra den. Upprepa proceduren tills cellfjädringen har utsatts för önskat antal pulser av vätskesjuvspänning. Utför lönsamhetsanalyser med de statiska proverna innan cellerna exponeras för vätskesjuvspänning.För enzymatiska analyser, överför 100 mikroliter alikvoter från de statiska proverna i duplicerad till en 96-brunnsplatta. Samla sedan in 100 mikroliter prover efter vätskesjuvningsstressexponering och placera dem i en 96-brunnsplatta. Tillsätt 20 mikroliter på en 0,15 milligram per milliliter återzurinlösning till varje provbrunn och till brunnar som innehåller 100 mikroliter medium ensam.Inkubera brunnsplattorna i 37 grader Celsius vävnadskulturinkubator i två timmar, mät sedan fluorescensen och absorbansen med hjälp av en plåtläsare och få procentandelen livskraftiga celler genom att jämföra den genomsnittliga signalen från var och en av vätskeskjuvspänningsutsplikationsproverna med genomsnittet för statiskt kontrollprov. Samla på samma sätt alikvoter från statiska prover för att utföra flödescytometri och clonogenic analyser som beskrivs i textmanuskriptet. I den representativa analysen bedömdes livskraften hos syngeneic biopsi bröst epitelial cancer celler med hjälp av resazurin omvandling efter att ha exponerat celler för ett antal flytande shear stress pulser.Även om varje cellinje visade olika resistansprofiler, fanns det ingen signifikant skillnad i livskraft efter 10 pulser av vätskesjuvning stress exponering. Ytterligare cancer cellinjer från en mängd olika vävnad ursprung visade livskraften hos mer än 20%efter 10 pulser av flytande shear stress, med undantag för MIA PaCa-2 celler, som visade en livskraft på mindre än 10%på grund av känslighet för mekanisk förstörelse från flytande shear stress. När du samlar in det statiska provet före applicering av vätskesjuvspänning, se till att cellupphängningen är homogent blandad.Ta försiktigt bort nålen med tång och böj eller rör inte nålen. Förutom att mäta cellens livskraft kan man utvärdera förändringar i genuttryck, cellsignalering, spridning och migrering. Med hjälp av detta som en modell för exponering för vätskesjuvningsstress kan man studera både hur cancerceller motstår förstörelse genom vätskesjuvspänning och utvärdera effekterna av vätskesjuvspänning på cancercellernas biologi.Denna teknik har använts av vårt laboratorium och andra för att utforska effekterna av vätskesjuvning stress på cirkulerande tumörceller. Dessa studier har visat att vätskesjuvningsstress snabbt förändrar cancercellernas mekaniska egenskaper och att detta bidrar till cancercellernas förmåga att motstå förstörelse genom vätskesjuvspänning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Fånga och Release av livsdugliga cirkulerande tumörceller från blod

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av cirkulerande tumörceller i en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Inrättandet av en Lung Colonization analys för cirkulerande tumör Cell visualisering i lungvävnad

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering av tumörceller med hjälp av en medicinsk tråd för att fånga cirkulerande tumörceller: en 3D strategi baserad på immunofluorescens och DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging metoder för bedömningar av toxikologiska oxidativ Stress använder genetiskt-kodade Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metod för att definiera effekterna av miljömässiga berikning på kolon mikrobiomet biologisk mångfald i en musmodell kolon tumör

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation av cirkulerande tumör celler för nedströms molekylär analys och metastatisk potentiell bedömning

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...