Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Forfatterne ønsker at takke Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong Han og Batbileg Bor for nyttige diskussioner og for at give bakterielle stammer. Vi takker Susan Yost og Jessica Woods for mikrobiel teknisk bistand. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af The National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health under tildeling numre R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) og T32 DE007327 (AJC). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.

Ved udarbejdelsen af denne protokol blev IRB-godkendelse søgt og godkendt (#14-10), og der blev indhentet informeret samtykke fra alle.
1. Forberedelse
<ol><li>Når du arbejder med mennesker, skal du indhente den nødvendige IRB-godkendelse og informeret samtykke.</li>
	<li>Start kulturer værtsbakterier med tid nok til at vokse til tidlig stationær fase. For eksempel podes 2-5 mL tryptisk soja bouillon med 0,1% gærekstrakt tilsat (TSBY) med Arachnia propionica og inkuberes ved 37 °C i 24 timer.</li>
	<li>Filterholdere samles med spor ætset 0,2 μm filtermembran. Wrap samlingen i folie og sterilisere ved autoklavering.</li>
	<li>Steriliser centrifugerør og hættesamlinger.</li>
</ol>2. Få prøve af orale bakterier
BEMÆRK: Mens mange mundtlige prøver indeholder Saccharibacteria (f.eks spyt, podninger af mandler, tungen skrabning) plak rutinemæssigt er den mest succesfulde.
<ol><li>Tag en plak skrabning ved hjælp af en steril papir punkt, Gracey curette, eller, hvis selv-prøveudtagning, bruge en steril tandstikker eller pipette spids. Overfør plak til en passende buffer, såsom maksimal restitutionsdiluent (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% peptone) eller PBS. Hvis prøven ikke behandles med det samme, skal den opbevares på is, indtil den er klar til at fortsætte.</li>
	<li>Kraftigt genbruges plak i MRD buffer ved hjælp af en kombination af hvirvler og pipetter med en lille pipet spids.</li>
	<li>Der tilsættes genbrugt plakprøve til yderligere 9 mL MRD-buffer.</li>
</ol>3. Forbered filtrat fra oral prøve
<ol><li>Brug aseptisk teknik, udpakke en steril filtermontage. Tag et kvart sving ud, og ret filterholderen tilbage for at sikre, at trådene er korrekt fastgjort, og at apparatet er lukket korrekt. Ved hjælp af en sprøjte vaskes membranen ved at passere 10 mL MRD-buffer gennem apparatet. Forkert montering afsløres på dette trin ved væske, der siver ud af filterholderen. Hvis der opstår lækage, skal du anskaffe endnu en steril filtersamling og gentage vasketrinnet.</li>
	<li>Påfør prøven på det vaskede filter. Tag stemplet ud af en sprøjte og fastgør det til filterapparatet. Hæld den spredte tandprøve, nu i 10 mL MRD buffer, i en sprøjte og læg den på filteret.</li>
	<li>Placer et sterilt centrifugerør under filterapparatet for at fange filtratet, og tryk derefter stemplet for at skubbe prøven gennem filteret.</li>
	<li>Gentag proceduren med yderligere 10 mL MRD-buffer for at vaske membranen og opsamle gennemstrømningen i samme rør som den filtrerede prøve. Aseptisk hætte røret.</li>
</ol>4. Koncentrer Saccharibacteria celler ved centrifugering
<ol><li>Lav et orienteringsmærke på røret og hætten, og placer røret i en højhastighedscentrifuge med mærket på oversiden. Pellet dannet af centrifugering er normalt usynlig. Mærkningen vil hjælpe med at bestemme, hvor pellet af Saccharibacteria celler er placeret, når centrifugering er gjort, og røret fjernes fra centrifuge.</li>
	<li>Prøverne centrifuges ved 60.000 x g for 1 h ved 4 °C. BEMÆRK: Denne kraft og tid er tilstrækkelig til at pellet alle Saccharibacteria celler. Saccharibacteria-celler kan dog i det mindste delvist pelletes ved centrifugering i så lidt som 20 minutter ved 20.000 x g.</li>
	<li>Fjern forsigtigt rørene fra centrifuge. Hæld væsken ud af røret, og hold pellet på oversiden af røret.</li>
	<li>Resuspend den normalt usynlige pellet i 1-2 mL MRD buffer ved kraftig hvirvelstrømning.</li>
</ol>5. Inficere værtskulturer med Saccharibacteria-beriget filtrat
<ol><li>Forbered dyrkningsrør ved at tilstå 2 mL passende vækstmedier (f.eks.</li>
	<li>Der tilsættes 200 μL værtsorganismer til hver tube fra den ene dag til den anden. Der tilsættes 100-200 μL genbrugt, filtreret prøve til hvert rør.</li>
	<li>Der inkuberes kombinerede prøver, alt efter hvad der er relevant for værtsorganismen (f.eks. 37 °C, i aerob atmosfære for A. propionica).</li>
	<li>Cellerne passage hver anden til tre dage ved at overføre 200 μL binær kultur til 2 mL frisk vækst medium i et nyt rør. Hvis det viser sig, at de passerede kulturer viser ingen vækst (dvs. turbiditet / optisk tæthed af kulturen ikke stiger efter passage i friske medier) Saccharibacteria kunne være overvældende eller dræbe alle vært organisme. For at afhjælpe dette tilsættes 200 μL uinficeret værtskultur, når cellerne passerer. Gentag i mindst 5 passager.</li>
</ol>6. Bekræft infektion med PCR
<ol><li>Efter 5 passager skal du bekræfte infektion med PCR. Fem passager vil sikre, at end nogen ikke-voksende Saccharibacteria celler er blevet udtømt ud over grænsen for påvisning ved hjælp af 25 cyklusser af PCR.</li>
	<li>Forbered en PCR mastermix. En foreslået opskrift, der bruger, er som følger, for hvert rør, der er nødvendigt, forberede 12,5 μL 2x PCR-buffer, 0,75 μL 10 μM Fremad primer (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Omvendt primer (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 og 9 μL vand. Bland ved hvirvelstrømning.</li>
	<li>Aliquot 24 μL mastermix i et 0,2 mL PCR-rør. Der tilsættes 1 μL Saccharibacteria-inficeret kultur til PCR-reaktionen. Røret anbringes i en termocykelmotor, og følgende protokol udføres: Første denaturering 95 °C i 5 min., 25 cyklusser på 95 °C for 30 s, 60 °C for 30 s, 72 °C for 30 s, endelig forlængelse ved 72 °C i 2 min. og derefter sidste hold ved 4 °C.</li>
	<li>Indlæs og kør PCR-produkterne i en 1% agarosegel. Et bånd af ~ 600 baser vil indikere tilstedeværelsen af Saccharibacteria.</li>
</ol>7. Kontroller renheden, og fjern kontaminerende organismer
<ol><li>Bekræft renheden af positive kulturer ved at plating coculture af Saccharibacteria på næringsstof agar tilstrækkelig til vækst af værtsorganismen. Der udføres en 10 gange seriel fortynding af kulturen i steril buffer (f.eks. MRD eller PBS) og 100 μL på en agarplade. Udfør fortyndinger, således at der vil være ca. 20-200 kolonier, der vokser på agarpladen.</li>
	<li>Inkubere kulturen under passende vækstbetingelser og observere for kontaminering af organismer. BEMÆRK: Axenic Saccharibacteria kolonier er aldrig blevet observeret, så kun værtsorganismen observeres vokser på disse plader. Mere end én kolonitype indikerer normalt forurening. Hvis der opstår kontaminering, skal kulturen filtreres igen for at fjerne de uønskede forurenende stoffer og vaccineres igen på frisk vært.</li>
	<li>Lejlighedsvis opstår en dobbelt infektion, hvor to Saccharibacteria-arter inficerer den samme vært. For at adskille Saccharibacteria-arten opstod de enkelte kolonier i 20 μL steril PBS og brugte 1 μL suspension i en PCR-reaktion til påvisning af kolonier med Saccharibacteria-infektioner.</li>
	<li>Overfør de suspensioner, der gav et positivt resultat til vækstmediet for at starte en binær kultur. Succesraten vil afhænge af titer af hver Saccharibacteria arter i kulturen. Det kan være nødvendigt at screene mere end 50 kolonier for at finde en inficeret en til formering.</li>
</ol>8. Opbevaring af kulturer
<ol><li>Vokse en binær kultur af tilstrækkelig volumen (10-50 mL) natten.</li>
	<li>Pellet celler ved centrifugering (4.000 x g i 10 min). BEMÆRK: Højhastigheds-centrifugering er ikke nødvendig her, da Saccharibacteria-celler vil blive fastgjort til de større, tungere celler i værten og vil pellet med dem.</li>
	<li>Genbrugte celler i kryobeskyttende middel. Vækst medier suppleret med enten 5% DMSO eller 20% glycerol er normalt tilstrækkelig. Sørg for, at værtsorganismen er kompatibel med kryobeskyttende medier (f.eks. hæmmes vækst af A. propionica af glycerol, og frosne lagre genoplives muligvis ikke). Test levedygtigheden af en uinficeret værtskultur med kryobeskyttende middel for at sikre, at bestandene kan overleve frysning.</li>
	<li>Genbrugt cellepille i samme mængde kultur (10-50 mL). Aliquot 0,5 mL i mærket cryovials. Fryse cellekulturer ved -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+gen.+nov.,+sp.+nov.,+a+human+intestinal+mucin-degrading+bacterium.">Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).</li><li>Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinivorans+hirudinis+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+anaerobic,+mucin-degrading+bacterium+isolated+from+the+digestive+tract+of+the+medicinal+leech+Hirudo+verbana.">Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).</li><li>Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+system+regulates+hemin+acquisition+in+porphyromonas+gingivalis.">A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis.</a> PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).</li><li>Martin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+growth+media+for+oral+bacteria.">New growth media for oral bacteria.</a> Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).</li><li>Vartoukian, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+'unculturable'+oral+bacteria,+facilitated+by+community+culture+and+media+supplementation+with+siderophores.">In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores.</a> Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).</li><li>Strandwitz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-modulating+bacteria+of+the+human+gut+microbiota.">GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota.</a> Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).</li><li>Hug, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+the+tree+of+life.">A new view of the tree of life.</a> Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).</li><li>Castelle, C. J., Banfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+new+microbial+groups+expand+diversity+and+alter+our+understanding+of+the+tree+of+life.">Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life.</a> Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+human-associated+TM7+phylotype+reveals+a+reduced+genome+and+epibiotic+parasitic+lifestyle.">Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).</li><li>Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+candidate+division+TM7,+a+recently+recognized+major+lineage+of+the+domain+Bacteria+with+no+known+pure-culture+representatives.">Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).</li><li>Brinig, M., Lepp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+bacteria+of+division+TM7+in+human+subgingival+plaque+and+their+association+with+disease.">Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+obtained+by+culturing+saccharibacteria+with+their+bacterial+hosts.">Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts.</a> Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+physiological+characterization+of+the+epibiotic+interaction+between+TM7x+and+its+basibiont+actinomyces.">Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces.</a> Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).</li><li>Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+plaque+development+on+defined+streptococcal+surfaces.">Dental plaque development on defined streptococcal surfaces.</a> Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).</li><li>Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+candidate+phyla+radiation+Saccharibacteria+(TM7)+bacteria+in+coculture+with+bacterial+hosts.">Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts.</a> Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).</li><li>Cross, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Vores metode til filtrering af plak og anvendelse af den på rene kulturer af værtsorganismer er i høj grad baseret på tidligere observationer af den første kultiverede Saccharibacteria, 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x11,14,15. I betragtning af den lille cellestørrelse udledte vi, at de kunne adskilles fra plak ved hjælp af et filter og koncentreret med centrifugering. For det andet, da disse organismer lever som parasitter, ville disse celler rene kulturer af værter give dem mulighed for at indgå i en symbiose og vokse som binære kulturer.
En fordel ved denne metode er, at den ikke kræver en berigelseskultur eller selektivt tryk. 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x blev dyrket fra en berigelseskultur ved hjælp af streptomycin som selektivt middel, som sekventering havde antydet ville være effektiv til berigelse for Saccharibacteria. Tilfældigvis er værten for 'Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, kendt for at være resistent over for streptomycin16. Brug af antibiotika som selektivt middel kan også forhindre værtsorganismen i at vokse, hvilket igen ville udelukke væksten af Saccharibacteria.
Et større problem med at bruge berigelseskulturer er, at hurtigt voksende organismer hurtigt vil fortrænge organismer af interesse. I mundhulen kan streptokokkusarter for eksempel vokse hurtigt og, hvis sukker er til stede i vækstmediet, producere nok syre til at forsure mediet og yderligere vælge mod organismer af interesse. Ved at undgå en berigelseskultur og selektiv antibiotika giver vores metode en generel tilgang, der kan anvendes på en bredere vifte af Saccharibacteria og potentielle værter uden komplikationer fra disse andre metoder.
Der er nogle hindringer for den metode, der præsenteres her. For det første antager denne metode, at Saccharibacteria lever i en binær kultur. Vi har ikke testet kombinationer af trinære eller ternære kulturer for at måle deres effektivitet, men der er sandsynligvis Saccharibacteria, der kræver vækstfaktorer, som en enkelt værtsorganisme ikke kan levere. Test af store kombinationer af orale bakterier, der kunne understøtte væksten af Saccharibacteria ville være en skræmmende opgave. For det andet antager metoden, at alle Saccharibacteria er små nok til at passere gennem et 0,2 μm filter. Det kunne være, at andre Saccharibacteria er større end antaget, og filteret er at vælge mod disse organismer. Et filter med en større porestørrelse kan bruges, men dette risikerer at tillade mere uønskede orale bakterier i den inficerede co-kultur. Endelig er det meget vanskeligt at finde værtsarter uden for dem, der allerede er blevet offentliggjort. Hidtil er de eneste succesfulde værter arter fra slægterne Actinomyces, Schaalia, Arachnia og Cellulosimicrobium, alle medlemmer af phylum Actinobacteria15,17,18. Disse værter understøtter dog kun væksten af specifikke Saccharibacteria. For at dyrke flere arter af Saccharibacteria skal mange flere værter udforskes.
Vi håber, at den metode, der præsenteres her, vil støtte fremtidig forskning af Saccharibacteria og andre HLR-organismer. Metagenomisk sekventering tyder på, at disse organismer også har små genomer og mistænkes for at være symbionter eller stole på det lokale mikrobielle samfund til at levere metabolitter og andre faktorer, der er kritiske for deres overlevelse19. En lignende filtreringsstrategi kunne bruges til at isolere disse organismer, forudsat at de er små nok, og at deres værtsorganismer kan dyrkes. De metoder, der er beskrevet her, er et første skridt til at bringe de magtfulde værktøjer i laboratoriekulturen til denne store og forskelligartede gruppe af bakterier.

Dyrkning af nye bakteriearter og bringe dem ind i laboratoriet giver mulighed for kraftfulde eksperimenter for bedre at forstå deres fysiologi og bredere interaktioner inden for deres mikrobielle samfund. Mens der er kulturfri metoder til at afhøre disse spørgsmål (f.eks. "meta-omics"), gør de komplekse interaktioner mellem forskellige mikrobielle populationer det vanskeligt at drille enkelte variabler fra hinanden og nå frem til meningsfulde konklusioner. Mens dyrkning af bakterier har mange fordele, er der mange potentielle barrierer for at isolere en bakterie og dyrke den i ren kultur. Potentielle specifikke vækstkrav omfatter pH, iltspænding, vitaminer, vækstfaktorer, signalmolekyler eller endda direkte cellekontakt for at fremkalde vækst1. Det menes dog, at specifikke auxotrophies er den primære afskrækkende virkning på dyrkning af nye arter af bakterier. Standard medier formuleringer mangler mange næringsstoffer, der kræves af udyrkede bakterier, såsom specifikke vitaminer eller kulstof kilder. Disse manglende molekyler kan være nøglen til fysiologien af de ikke-dyrkede bakterier og leveres normalt af enten en anden organisme i det mikrobielle samfund eller en værtsorganisme. For eksempel kan komplekse kulhydrater som muciner leveres af dyreværter. Tilføjelse af disse til medierne har tilladt dyrkning af flere bakterier fra dyreindvolde, herunder Akkermansia muciniphila og Mucinivorans hirudinis2,3,4. Mange patogene bakterier har udviklet evnen til at bruge jern bundet til hemin i dyreceller, herunder det orale patogen Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan væksten af Porphyromonas og andre organismer stimuleres ved tilsætning af hemin6.
For nylig er mange gennembrud i dyrkning af nye isolater af bakterier kommet gennem co-dyrkning, ved hjælp af en "feeder" organisme til at give specifikke faktorer til ikke-dyrkede bakterier er nødvendige for deres vækst. En elegant undersøgelse af Vartoukian og kolleger viste, at siderophores, jern bindende molekyler produceret af bakterier, stimuleret væksten af flere nye mundtlige isolater. Pyoverdiner, en type siderophore produceret af pseudomonad arter, blev vist sig at lette væksten af en ny Prevotella art7. I samme undersøgelse blev det første orale islat til phylum Chloroflexi dyrket, også ved hjælp af F. nucleatum som hjælper til at give nogle endnu ukendte forbindelser7. For nylig blev en bakterie fra slægten Ruminococcaceae isoleret ved hjælp af Bacteroides fragilis som hjælperorganisme8. Det blev senere vist, at gamma aminobutyrinsyre (GABA), en hæmmende neurotransmitter, var nødvendig for vækst på laboratoriemedier. Brug af foderorganismer har vist sig at være en nøglestrategi til at efterligne specifikke mikromiljøer, hvor ikke-dyrkede bakterier vokser, idet de er mere effektive end løbende at omformulere vækstmedier med forskellige tilsætningsstoffer i forskellige koncentrationer.
En af de største grupper af ikke-dyrkede bakterier er i "Candidate Phyla Radiation" (CPR), en monofyletisk gruppe af flere kandidatbakterielle phyla9,10. Fra dette skrives, kun medlemmer af Saccharibacteria phylum inden for CPR er blevet med succes dyrket i laboratoriet. Den første isolere, 'Nanosynbacter lyticus 'stamme TM7x, blev isoleret ved hjælp af antibiotika streptomycin, som var blevet forudsagt at berige for den ikke-dyrkede TM711,12. En vigtig opdagelse af dette arbejde var, at det nye isolat voksede som en parasit, der voksede i direkte kontakt med en bakteriel vært, Schaalia odontolytica, og mikroskopi viste, at disse parasitter var ultrasmalle bakterier.
Ved hjælp af disse spor udtænkte vi en metode til hurtigt at etablere binære cokulturer af Saccharibacteria med deres partnere ved at filtrere plak og andre mundtlige prøver gennem et 0,2 μm filter, indsamle celler i filtrat ved centrifugering og bruge dem til at inficere kulturer af kandidatværtsbakterier. Denne metode har den fordel at undgå berigelseskulturer, som kan overvældes med hurtigt voksende organismer. Det undgår også brugen af antibiotika, som kan stoppe væksten af enten den målrettede Saccharibacteria arter eller deres værter. Ved hjælp af den metode, der demonstreres her, har vi med succes dyrket 32 isolater fra Saccharibacteria phylum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

Mange bakteriearter kan ikke dyrkes i laboratoriet ved hjælp af standardmetoder, hvilket udgør en betydelig barriere for at studere størstedelen af den mikrobielle mangfoldighed på jorden. Nye tilgange er nødvendige for at dyrke disse ikke-dyrkede bakterier, så efterforskerne effektivt kan studere deres fysiologi og livsstil ved hjælp af de kraftfulde værktøjer, der er tilgængelige i laboratoriet. Kandidaten Phyla Radiation (CPR) er en af de største grupper af udyrkede bakterier, der omfatter ~ 15% af den levende mangfoldighed på jorden. Det første isoleret i denne gruppe var medlem af Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x. TM7x er en usædvanlig lille bakterie, der lever som en symbiont i direkte kontakt med en bakterievært, Schaalia odontolytica, stamme XH001. Ved at drage fordel af den usædvanligt lille cellestørrelse og dens livsstil som en symbiotisk organisme udviklede vi en protokol til hurtigt at dyrke Saccharibacteria fra plak. Denne protokol vil vise, hvordan man filtrerer en suspension af plak gennem et 0,2 μm filter, og koncentrerer derefter de indsamlede Saccharibacteria-celler og inficerer en kultur af værtsorganismer. Den resulterende coculture kan passeres som enhver normal bakteriel kultur og infektion er bekræftet af PCR. Den resulterende binære kultur kan opretholdes i laboratoriet og bruges til fremtidige eksperimenter. Mens forurening er en mulighed, kan den binære kultur renses ved enten yderligere filtrering og geninfektion af vært, eller ved plating den binære kultur og screening for inficerede kolonier. Vi håber, at denne protokol kan udvides til andre prøvetyper og miljøer, hvilket fører til dyrkning af mange flere arter i CPR.

PCR til påvisning af Saccharibacteria kan forekomme negativ (dvs. intet produkt set) i indledende infektionskulturer på grund af et lavt antal Saccharibacteria symbionter. Efter nogle få passager skal der dog forekomme et stærkt PCR-produkt, der viser, at der er opstået en stabil infektion (Figur 1A). Omvendt vil nogle infektioner i første omgang synes positive af PCR, men mindskes til målbart efter 1-4 passager (ikke vist). Dette indikerer, at en stor mængde Saccharibacteria celler var til stede i den oprindelige filtrat, men blev fortyndet ud ved passage, og ingen var i stand til at indgå i en stabil symbiose med værtskulturen. Test af flere værtsarter med samme Saccharibacteria filtrat fra mundhulen vil normalt have en lav succesrate (Figur 1B), da symbiont-host-interaktionen er meget specifik. En forsker kan også teste den samme vært med filtrater fra flere forskellige. Hvis der anvendes en god værtsorganisme (såsom Arachnia propionica eller Schaalia odontolytica),kan der forventes en succesrate på 50%.
Testning af PCR er afgørende. Erfarne forskere har forsøgt at bekræfte infektion med mikroskopi, kun for at rapportere falske positiver. Saccharibacteria cellerne er små og vanskelige at skelne mellem vesikler eller uregelmæssig celle kuvert buler. Et PCR-signal stabilt gennem flere passager er nøglen til at bekræfte en vellykket infektion.
Efterhånden som de inficerede kulturer vokser, skal normal uklar vækst forekomme. Som symbiosen etablerer sig, vil inficerede kulturer fremstå mindre uklare end kulturer af uinficerede værtsorganismer (Figur 2A). I nogle tilfælde kan inficerede kulturer synes at stoppe med at vokse helt og ikke blive uklare overhovedet. Dette kan skyldes en infektion, hvor Saccharibacteria cellerne er overvældende vært organismen. Tilføjelse af "frisk" (uinficeret) vært for disse kulturer bør give en tilstrækkelig befolkning af vært til at støtte den fortsatte vækst af Saccharibacteria parasitter.
Overvækst eller overdrevent uklare kulturer kan indikere kontaminering med enten et laboratorieforurenende stof eller en anden lille oral bakterie, der kunne passere gennem 0,2 μm-filteret. Campylobacter og Capnocytophaga spp. er typiske orale forurenende stoffer af disse eksperimenter. Dette kan bekræftes ved at plating kulturen og leder efter kolonier, der er atypiske af værtsorganismen efterfulgt af 16S rRNA sekventering. Hvis der ses kontaminering, er filtrering af disse kulturer gennem et 0,2 μm filter normalt tilstrækkeligt til at fjerne de forurenende stoffer. Saccharibacteria celler i filtrat kan koncentreres ved centrifugering og bruges til at re-inficere en ren værtskultur.
En anden måde at rense en forurenet kultur er ved at plukke inficerede kolonier fra plating en inficeret kultur. Kolonier af inficerede værter kan undertiden identificeres ved uregelmæssig koloniform sammenlignet med uinficerede kolonier (Figur 2B-D). Disse uregelmæssige kolonier er afhængige af saccharibakteriernes titer i den binære kultur, og en mindre andel af kolonierne vil forekomme uregelmæssige, hvis titer er lav. Dette kan gøre det nemt at identificere inficerede kolonier, som kan plukkes og bruges til at starte en ren binær kultur. Hvis der ikke ses uregelmæssige kolonier ved plating fra en Saccharibacteria inficeret kultur, er det muligt, at symbionten er ved en lav titer eller ikke forårsager uregelmæssigt formede kolonier. I et sådant tilfælde kan PCR-screeningskolonier med et normalt udseende vise infektion med Saccharibacteria, men med lav hastighed (2-10% af alle kolonier).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Figur 1: Typiske PCR-resultater af Saccharibacteria-infektioner i værtskulturer. (B) De fleste værter, der er smittet med Saccharibacteria-beriget filtrat, vil ikke understøtte deres vækst på grund af symbiosens specificitet. I dette eksempel var det kun A. propionica, der blev inficeret med succes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Figur 2: Vækstkarakteristika for Saccharibacteria inficerede kulturer. (B-D) Plating af cokulturer kan producere uregelmæssige kolonier, forårsaget af Saccharibateria infektioner. Uregelmæssige kolonier vil falde i forhold til saccharibakteriernes titer i samkulturen. (B) Vært med et højt niveau af Saccharibacteria. (C) 10 gange fortyndet Saccharibacteria (D) Uinficeret værtskultur. Hvide pile angiver eksempler på uregelmæssige kolonier. Skalalinje= 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Vi demonstrerer en metode til at isolere svært at dyrke medlemmer af romanen bakteriel phylum, Saccharibacteria, ved at filtrere plak og co-dyrkning med vært bakterier.

Etablering af stabile binære kulturer symbiotiske saccharibakterier fra mundhulen

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Saccharibacteria er obligatoriske parasitter, der kræver co-kultur med passende værtsbakterier. Som human oral saccharibacteria kan let isoleres for de fleste personer ved hjælp af kendte vært bakterielle arter. Denne protokol vil gøre det muligt for enhver efterforsker eller laboratorium at isolere deres egne stammer i binær co-kultur.Denne teknik bruger enkle anordninger og udstyr til stede i de fleste mikrobiologiske laboratorier og er med succes blevet brugt til at dyrke over 30 isolater, der repræsenterer seks arter af saccharibakterier. Denne protokol kan være nyttig til isolering af andre kandidat-fulgte stråling arter, samt saccharibacteria fra forskellige miljøer og andre pattedyr, hvis passende actinobakterielle værter kan identificeres og isoleres. Demonstrere proceduren vil være Andrew Collins, en tidligere postdoc stipendiat i mit laboratorium.Til at begynde med skal du starte kulturer af værtsbakterier som arachnia propionica, med nok tid til, at de kan vokse til tidlig stationær fase. For at starte kulturen skal du vaccinere to til fem milliliter tryptisk soja bouillon indeholdende 0,1% gærekstrakt med arachnia propionica og inkubere det ved 37 grader Celsius i 24 timer. Derefter samles filterholdere med spor ætset 0,2 mikrometer filtermembraner.Wrap dem i folie og sterilisere ved autoklavering, sammen med centrifuge rør og hætte forsamlinger. Steriliser ekstra forsyninger i tilfælde af utilsigtet kontakt med ikke-sterile overflader. Saml plak ved at skrabe langs tandkødsranden, ved hjælp af et sterilt papirpunkt, yndefuld curette eller en steril tandstikker eller pipettespids, og overfør den til en passende buffer som MRD eller PBS.Hold prøven på is, indtil den er klar til at fortsætte. Genbrug plak kraftigt ved hjælp af en kombination af hvirvler og pipetter med en lille pipette spids, derefter tilføje den genopsnyttede plak prøve til et rør, der indeholder ni milliliter MRD buffer. Pak forsigtigt en steril filtersamling ud ved hjælp af aseptisk teknik.Træk en kvart drejning ud, og stram filterholderen igen for at sikre, at trådene er korrekt aktiveret, og at apparatet er korrekt lukket. Membranen vaskes ved at passere 10 milliliter MRD-buffer gennem apparatet ved hjælp af en sprøjte. Hvis du vil påføre prøven på det vaskede filter, skal du fjerne stemplet fra en sprøjte og fastgøre det til filterapparatet.Placer et sterilt centrifugerør under filterapparatet for at fange filtrat, hæld derefter den spredte tandprøve i sprøjten og læg det på filteret. Tryk derefter let på stemplet for at skubbe prøven gennem filteret. Membranen vaskes med yderligere 10 milliliter MRD-buffer, og strømmen opsamles i samme rør som den filtrerede prøve.Derefter hætte røret aseptisk, og holde på is. Lav et orienteringsmærke på røret og hætten for at identificere placeringen af cellepillen efter centrifugering. Røret anbringes i en højhastighedscentrifuge med mærket på oversiden, og prøverne centrifuges ved 60.000 G i en time ved fire grader Celsius.Efter centrifugering hældes forsigtigt supernatanten ud og holder pellet på oversiden af røret. Derefter genbruges pellet i en til to milliliter MRD buffer ved kraftigt hvirvlende. Forbered dyrkningsrør ved at aliquoting to milliliter af passende vækst medier i rørene.Derefter tilsættes 200 mikroliter af værtsorganismers overnatningskultur og 100 til 200 mikroliter genbrugt filtreret prøve til hvert rør. Inkuber de kombinerede prøver under forhold, der er relevante for værtsorganismen. Passage cellerne hver anden til tre dage ved at overføre 200 mikroliter af den binære kultur til to milliliter frisk vækst medium i et nyt rør.Hvis de passerede kulturer ikke viser nogen vækst ved 200 mikroliter af uinficeret værtskultur, når de passerer cellerne, returneres podede rør til inkubatoren. Aliquote 24 mikroliter af PCR master blandes i en 0,2 milliliter PCR rør. Ved en mikroliter af saccharibacteria inficeret kultur, placere røret i en Thermo cycler.Indstil PCR-programmet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Indlæs og kør PCR-produkterne på en 1%Agros gel. Et bånd på ca. 600 baser vil bekræfte tilstedeværelsen af saccharibacteria.For at bekræfte renheden af positive kulturer skal du udføre en 10 gange seriel fortynding af saccharibacterias co-kultur i en steril buffer og sprede 100 mikroliter på en agarplade. Inkubere kulturen under passende vækstbetingelser og observere for kontaminerende organismer. Et bånd på ca. 600 baser vil bekræfte tilstedeværelsen af saccharibacteria.PCR-detektion kan forekomme negativ i indledende infektionskulturer på grund af et lavt antal saccharibacteria symbionter. Men efter et par passager skal der forekomme et stærkt PCR-produkt, hvilket indikerer, at der er opstået en stabil infektion. Test af flere værtsarter med samme saccharibacteria filtrat vil normalt have en lav succesrate.Da symbiont-værtsinteraktionen er meget specifik. Efterhånden som de inficerede kulturer vokser, skal normal uklar vækst forekomme. Som symbiosen etablerer sig, vil inficerede kulturer fremstå mindre uklare end kulturer af uinficerede værtsorganismer.En forurenet kultur kan renses ved at plukke inficerede kolonier efter plating. Inficerede kolonier kan undertiden identificeres ved en uregelmæssig koloni form i forhold til uinficerede kolonier. Andelen af regelmæssige kolonier afhænger af saccharibacterias titer i den binære kultur.Hvis titeren er lav, vil færre kolonier forekomme uregelmæssige, hvilket gør det nemt at vælge de inficerede kolonier og starte en ren binær kultur. Kulturer kan ikke synes positive for flere passager. Så nogle patienter vil være behov for.Det er også nødvendigt regelmæssigt at kontrollere for forurening af binære kulturer, da dette kan destabilisere kulturen og føre til saccharibacteriaens død. Den binære kultur kan bruges til alle former for laboratorieforsøg. DNA og RNA kan udvindes til henholdsvis genomsekvensering og transskriptionsanalyse.Patogenitet kan også undersøges ved hjælp af dyremodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...