Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
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Gli autori desiderano ringraziare Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He e Batbileg Bor per le utili discussioni e per aver fornito ceppi batterici. Ringraziamo Susan Yost e Jessica Woods per l'assistenza tecnica microbica. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Dental and Craniofacial Research dei National Institutes of Health con i numeri di premio R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) e T32 DE007327 (AJC). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

Durante lo sviluppo di questo protocollo, l'approvazione dell'IRB è stata richiesta e approvata (#14-10) e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti.
1. Preparazione
<ol><li>Quando si lavora con soggetti umani, ottenere la necessaria approvazione IRB e il consenso informato.</li>
	<li>Inizia colture di batteri ospiti con abbastanza tempo per crescere fino alla fase stazionaria precoce. Ad esempio, inoculare 2-5 mL di brodo di soia triptica con estratto di lievito allo 0,1% aggiunto (TSBY) con Arachnia propionica e incubare a 37 °C per 24 ore.</li>
	<li>Assemblare i supporti del filtro con membrana filtrante da 0,2 μm incisa su binario. Avvolgere l'assieme in un foglio e sterilizzare con autoclave.</li>
	<li>Sterilizzare tubi di centrifuga e gruppi di tappi.</li>
</ol>2. Ottenere un campione di batteri orali
NOTA: Mentre molti campioni orali contengono Saccharibacteria (ad esempio, saliva, tamponi di tonsille, raschiamenti della lingua) la placca dentale è di routine la più riuscita.
<ol><li>Prendere una placca raschiatura utilizzando un punto di carta sterile, una curette Gracey o, se auto-campionamento, utilizzare uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta. Trasferire la placca in un tampone adatto, come il diluente di recupero massimo (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% peptone) o PBS. Se non viene lavorato immediatamente, tenere il campione sul ghiaccio fino a quando non è pronto per procedere.</li>
	<li>Resospend vigorosamente la placca dentale nel tampone MRD utilizzando una combinazione di vortice e pipettaggio con una piccola punta di pipetta.</li>
	<li>Aggiungere il campione di placca rimorsi a un ulteriore tampone di 9 mL di MRD.</li>
</ol>3. Preparare il filtrato dal campione orale
<ol><li>Utilizzando la tecnica aseptica, scartare un assemblaggio di filtri sterile. Srotoilare un quarto di giro e filtrare il supporto del filtro per assicurarsi che i fili siano correttamente innesati e che l'apparecchio sia chiuso correttamente. Utilizzando una siringa, lavare la membrana passando 10 ml di tampone MRD attraverso l'apparato. In questa fase viene rivelato un montaggio improprio mediante fuoriuscita di liquido dal supporto del filtro. In caso di perdite, ottenere un altro gruppo di filtri sterile e ripetere il passaggio di lavaggio.</li>
	<li>Applicare il campione al filtro lavato. Rimuovere lo stantuffo da una siringa e attaccarlo all'apparato filtrante. Versare il campione dentale disperso, ora in 10 ml di tampone MRD, in una siringa e caricarlo sul filtro.</li>
	<li>Posizionare un tubo di centrifuga sterile sotto l'apparato filtrante per catturare il filtrato, quindi applicare una leggera pressione sul pistone per spingere il campione attraverso il filtro.</li>
	<li>Ripetere la procedura con altri 10 ml di tampone MRD per lavare la membrana, raccogliendo il flusso nello stesso tubo del campione filtrato. Cappuccio asettico del tubo.</li>
</ol>4. Concentrare le cellule saccharibacteria per centrifugazione
<ol><li>Fare un segno di orientamento sul tubo e sul cappuccio e posizionare il tubo in una centrifuga ad alta velocità con il segno sul lato superiore. Il pellet formato dalla centrifugazione è solitamente invisibile. La marcatura aiuterà a determinare dove si trova il pellet delle cellule saccharibacteria quando viene eseguita la centrifugazione e il tubo rimosso dalla centrifuga.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 60.000 x g per 1 h a 4 °C. NOTA: Questa forza e questo tempo sono sufficienti per pellettare tutte le cellule saccharibacteria. Tuttavia, le cellule saccharibacteria possono essere almeno parzialmente pellettizzazione centrifugando per un minimo di 20 minuti a 20.000 x g.</li>
	<li>Rimuovere con cura i tubi dalla centrifuga. Versare il liquido dal tubo, mantenendo il pellet sul lato superiore del tubo.</li>
	<li>Rimescolare il pellet solitamente invisibile in 1-2 mL di tampone MRD con vortici vigorosi.</li>
</ol>5. Infettare le colture ospiti con filtrato arricchito con Saccharibacteria
<ol><li>Preparare tubi di coltura aliquotando 2 ml di mezzi di crescita appropriati (ad esempio, TSBY, BHI, ecc.) in tubi.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di coltura notturna di organismi ospiti a ciascun tubo. Aggiungere 100-200 μL di campione resopensato e filtrato a ciascun tubo.</li>
	<li>Incubare campioni combinati a 10 °C, a 17 °C, in atmosfera aerobica per A. propionica.</li>
	<li>Passare le cellule ogni due o tre giorni trasferendo 200 μL di coltura binaria a 2 ml di mezzo di crescita fresco in un nuovo tubo. Se sembra che le culture passaggio non mostrino crescita (cioè, la torbidità / densità ottica della coltura non aumenta dopo il passaggio in nuovi media) i Saccharibacteria potrebbero essere travolgenti o uccidere tutto l'organismo ospite. Per rimediare a questo, aggiungere 200 μL di coltura ospite non infetta durante la passatura delle cellule. Ripetere per almeno 5 passaggi.</li>
</ol>6. Confermare l'infezione da PCR
<ol><li>Dopo 5 passaggi, confermare l'infezione da PCR. Cinque passaggi garantiranno che tutte le cellule Saccharibacteria non in crescita siano state esaurite oltre il limite di rilevamento utilizzando 25 cicli di PCR.</li>
	<li>Preparare un mastermix PCR. Una ricetta suggerita è la seguente, per ogni tubo necessario, preparare 12,5 μL 2x tampone PCR, 0,75 μL 10 μM Primer in avanti (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 10 primer inversoμM (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 e 9 μL acqua. Mescolare con il vortice.</li>
	<li>Aliquota 24 μL di mastermix in un tubo PCR da 0,2 ml. Aggiungere 1 μL di coltura infetta da Saccharibacteria alla reazione PCR. Posizionare il tubo in un termociclo ed eseguire il seguente protocollo: denaturazione iniziale 95 °C per 5 min, 25 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 30 s, allungamento finale a 72 °C per 2 min, quindi tenuta finale a 4 °C.</li>
	<li>Caricare ed eseguire i prodotti PCR in un gel di agarosio all'1%. Una banda di ~ 600 basi indicherà la presenza di Saccharibacteria.</li>
</ol>7. Verificare la purezza e rimuovere gli organismi contaminanti
<ol><li>Confermare la purezza delle colture positive placcando la cocoltura di Saccharibacteria su agar nutriente sufficiente per la crescita dell'organismo ospite. Eseguire una diluizione seriale di 10 volte della coltura in tampone sterile (ad esempio, MRD o PBS) e distribuire 100 μL su una piastra di agar. Eseguire diluizioni in modo tale che ci saranno circa 20-200 colonie che crescono sulla piastra dell'agar.</li>
	<li>Incubare la coltura in condizioni di crescita appropriate e osservare per gli organismi contaminanti. NOTA: Le colonie di Saccharibacteria axeniche non sono mai state osservate, quindi solo l'organismo ospite è osservato crescere su queste placche. Più di un tipo di colonia di solito indica contaminazione. In caso di contaminazione, la coltura deve essere rifiltrata per rimuovere i contaminanti indesiderati e riiculata sull'ospite fresco.</li>
	<li>Occasionalmente si verifica una doppia infezione, in cui due specie di Saccharibacteria infettano lo stesso ospite. Per separare le specie di Saccharibacteria, resopendare le singole colonie in PBS sterile da 20 μL e utilizzare 1 μL di sospensione in una reazione PCR per rilevare colonie con infezioni da Saccharibacteria.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni che hanno dato un risultato positivo al mezzo di crescita per avviare una cultura binaria. Il tasso di successo dipenderà dal eremo di ogni specie di Saccharibacteria nella cultura. Potrebbe essere necessario migliorare più di 50 colonie per trovarne una infetta per la propagazione.</li>
</ol>8. Conservazione delle colture
<ol><li>Far crescere una cultura binaria di volume sufficiente (10-50 mL) durante la notte.</li>
	<li>Celle a pellet per centrifugazione (4.000 x g per 10 min). NOTA: La centrifugazione ad alta velocità non è necessaria qui in quanto le cellule saccharibacteria saranno attaccate alle cellule più grandi e pesanti dell'ospite e si pelletranno con loro.</li>
	<li>Rimosoppo le cellule nel crioprotettivo. Il supporto di crescita integrato con il 5% di DMSO o il 20% di glicerolo è solitamente sufficiente. Assicurarsi che l'organismo ospite sia compatibile con i mezzi crioprotettivi (ad esempio, la crescita di A. propionica è inibita dal glicerolo e le scorte congelate potrebbero non rivivere). Testare la vitalità di una cultura ospite non infetta con crioprotettivo per garantire che gli stock possano sopravvivere al congelamento.</li>
	<li>Resuspend cell pellet nello stesso volume di coltura (10-50 mL). Aliquota 0,5 mL in criooviali etichettati. Congelare le colture cellulari a -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. 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C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinivorans+hirudinis+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+anaerobic,+mucin-degrading+bacterium+isolated+from+the+digestive+tract+of+the+medicinal+leech+Hirudo+verbana.">Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).</li><li>Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro metodo di filtraggio della placca e di applicazione alle colture pure di organismi ospiti si basa in gran parte su precedenti osservazioni sui primi Saccharibacteria coltivati, ilceppo di Nanosynbacter lyticus TM7x11,14,15. Date le piccole dimensioni delle celle, abbiamo dedotto che potevano essere separate dalla placca dentale usando un filtro e concentrate con centrifugazione. In secondo luogo, poiché questi organismi vivono come parassiti, fornire a queste cellule colture pure di ospiti consentirebbe loro di entrare in una simbiosi e crescere come colture binarie.
Un vantaggio di questo metodo è che non richiede una coltura di arricchimento o una pressione selettiva. Ilceppo TM7x del Nanosynbacter lyticus è stato coltivato da una coltura di arricchimento usando la streptomicina come agente selettivo, che il sequenziamento aveva suggerito sarebbe stato efficace nell'arricchire i Saccharibacteri. Fortuitamente, l'ospite di' Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, è noto per essere resistente alla streptomicina16. L'uso di antibiotici come agente selettivo potrebbe anche impedire all'organismo ospite di crescere, il che a sua volta precluderebbe la crescita dei Saccharibacteria.
Una questione più ampia dell'uso di colture di arricchimento è che gli organismi in rapida crescita sposteranno rapidamente gli organismi di interesse. Nella cavità orale, ad esempio, le specie di Streptococcus possono crescere rapidamente e, se lo zucchero è presente nel mezzo di crescita, produrre abbastanza acido da acidificare il mezzo, selezionando ulteriormente contro gli organismi di interesse. Evitando una coltura di arricchimento e antibiotici selettivi, il nostro metodo fornisce un approccio generale che potrebbe essere applicato a una gamma più ampia di Saccharibacteri e potenziali ospiti senza le complicazioni di questi altri metodi.
Ci sono alcuni ostacoli al metodo qui presentato. In primo luogo, questo metodo presuppone che i Saccharibacteri vivano in una cultura binaria. Non abbiamo testato combinazioni di colture trinarie o ternarie per misurarne l'efficacia, ma ci sono probabilmente Saccharibacteri che richiedono fattori di crescita che un singolo organismo ospite non può fornire. Testare le vaste combinazioni di batteri orali che potrebbero sostenere la crescita dei Saccharibacteria sarebbe un compito scoraggiante. In secondo luogo, il metodo presuppone che tutti i Saccharibacteri siano abbastanza piccoli da passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Potrebbe essere che altri Saccharibacteri siano più grandi di quanto si credesse e che il filtro selezioni contro questi organismi. Potrebbe essere utilizzato un filtro con una dimensione dei pori più grande, ma questo corre il rischio di consentire batteri orali più indesiderati nella co-coltura infetta. Infine, è molto difficile trovare specie ospiti al di fuori di quelle che sono già state pubblicate. Finora, gli unici ospiti di successo sono specie dei generi Actinomyces, Schaalia, Arachnia e Cellulosimicrobium,tutti membri del phylum Actinobacteria15,17,18. Tuttavia, questi host supportano solo la crescita di saccharibacteria specifici. Per culturare più specie di Saccharibacteria, molti più ospiti devono essere esplorati.
Speriamo che il metodo qui presentato aiuti la ricerca futura dei Saccharibacteria e di altri organismi della RCP. Il sequenziamento metagenomico suggerisce che questi organismi hanno anche piccoli genomi e si sospetta che siano simbionti o si affidi alla comunità microbica locale per fornire metaboliti e altri fattori critici per la loro sopravvivenza19. Una strategia di filtraggio simile potrebbe essere utilizzata per isolare questi organismi, a condizione che siano abbastanza piccoli e che i loro organismi ospiti possano essere coltivati. I metodi descritti qui sono un primo passo per portare i potenti strumenti della coltura di laboratorio in questo grande e diversificato gruppo di batteri.

Coltivare nuove specie di batteri e portarli in laboratorio consente potenti esperimenti per comprendere meglio la loro fisiologia e interazioni più ampie all'interno della loro comunità microbica. Mentre esistono metodi senza cultura per interrogare queste domande (ad esempio, "meta-omica"), le complesse interazioni di diverse popolazioni microbiche rendono difficile prendere in giro singole variabili e raggiungere conclusioni significative. Mentre coltivare i batteri ha molti benefici, ci sono molte potenziali barriere all'isolamento di un batterio e alla sua crescita nella cultura pura. I potenziali requisiti specifici di crescita includono pH, tensione dell'ossigeno, vitamine, fattori di crescita, molecole di segnalazione o persino contatto diretto delle cellule per suscitare lacrescita 1. Tuttavia, si ritiene che le auxotrofie specifiche siano il principale deterrente alla ristrutturazione di nuove specie di batteri. Le formulazioni standard dei media mancano di molti nutrienti richiesti da batteri incolti, come vitamine specifiche o fonti di carbonio. Queste molecole mancanti possono essere la chiave per la fisiologia dei batteri incolti e sono solitamente fornite da un altro organismo nella comunità microbica o da un organismo ospite. Ad esempio, carboidrati complessi come le mucine possono essere forniti da ospiti animali. L'aggiunta di questi ai media ha permesso la coltivazione di diversi batteri provenienti da budella animale, tra cui Akkermansia muciniphila e Mucinivorans hirudinis2,3,4. Molti batteri patogeni hanno sviluppato la capacità di utilizzare ferro legato all'emina nelle cellule animali, incluso l'agente patogeno orale Porphyromonas gingivalis5. In laboratorio, la crescita di Porfiromonas e altri organismi, può essere stimolata dall'aggiunta di emina6.
Recentemente, molte scoperte nella coltivazione di nuovi isolati di batteri sono arrivate attraverso la co-coltura, utilizzando un organismo "alimentatore" per fornire fattori specifici ai batteri non coltivati necessari per la loro crescita. Un elegante studio di Vartoukian e colleghi ha dimostrato che i siderofori, molecole di legame del ferro prodotte dai batteri, stimolavano la crescita di diversi nuovi isolati orali. Le pyoverdine, un tipo di sideroforo prodotto da specie pseudomonad, hanno dimostrato di facilitare significativamente la crescita di una nuova specie prevotella 7. Nello stesso studio, è stato coltivato il primo isolato orale per il phylum Chloroflexi, usando anche F. nucleatum come aiutante per fornire alcuni composti ancora sconosciuti7. Più recentemente, un batterio del genere Ruminococcaceae è stato isolato usando Bacteroides fragilis come organismo aiutante8. In seguito è stato dimostrato che l'acido gamma amminobutirrico (GABA), un neurotrasmettitore inibitorio, era necessario per la crescita sui mezzi di laboratorio. L'uso di organismi di alimentazione si è rivelato una strategia chiave per imitare microambientati specifici in cui crescono batteri non coltivati, essendo più efficiente che riformulare continuamente i mezzi di crescita con diversi additivi in concentrazioni variabili.
Uno dei più grandi gruppi di batteri incolti si trova nella "Candidate Phyla Radiation" (RCP), un gruppo monofilattico di diversi phyla battericicandidati 9,10. Al momento della stesura di questo articolo, solo i membri del phylum Saccharibacteria all'interno della RCP sono stati coltivati con successo in laboratorio. Il primo isolato, il ceppo TM7xdel Nanosynbacter lyticus, è stato isolato utilizzando l'antibiotico streptomicina, che si prevedeva si arricchisse per l'incolto TM711,12. Una scoperta chiave di questo lavoro è stata che il nuovo isolato è cresciuto come un parassita che cresce a diretto contatto con un ospite batterico, Schaalia odontolytica, e la microscopia ha mostrato che questi parassiti erano batteri ultrasottili.
Utilizzando questi indizi, abbiamo ideato un metodo per stabilire rapidamente coculture binarie di Saccharibacteria con i loro partner filtrando la placca dentale e altri campioni orali attraverso un filtro da 0,2 μm, raccogliendo cellule nel filtrato mediante centrifugazione e usandole per infettare colture di batteri ospiti candidati. Questo metodo ha il vantaggio di evitare colture di arricchimento, che possono essere sopraffatte da organismi in rapida crescita. Evita anche l'uso di antibiotici, che potrebbero fermare la crescita delle specie di Saccharibacteria mirate o dei loro ospiti. Utilizzando il metodo qui dimostrato, abbiamo coltivato con successo 32 isolati dal phylum Saccharibacteria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

Molte specie batteriche non possono essere coltivate in laboratorio utilizzando metodi standard, ponendo una barriera significativa allo studio della maggior parte della diversità microbica sulla terra. Sono necessari nuovi approcci per coltura di questi batteri incolti in modo che gli investigatori possano studiare efficacemente la loro fisiologia e il loro stile di vita utilizzando i potenti strumenti disponibili in laboratorio. La radiazione di phyla candidata (CPR) è uno dei più grandi gruppi di batteri incolti, che comprende ~ 15% della diversità vivente sulla terra. Il primo isolato di questo gruppo è stato un membro del phylum Saccharibacteria,ceppoTM7x. TM7x è un batterio insolitamente piccolo che vive come simbionte a diretto contatto con un ospite batterico, Schaalia odontolytica, ceppo XH001. Sfruttando le dimensioni delle cellule insolitamente piccole e il suo stile di vita come organismo simbiotico, abbiamo sviluppato un protocollo per coltura rapida dei Saccharibacteria dalla placca dentale. Questo protocollo mostrerà come filtrare una sospensione della placca dentale attraverso un filtro da 0,2 μm, quindi concentrare le cellule Saccharibacteria raccolte e infettare una coltura di organismi ospiti. La cocoltura risultante può essere passageata come qualsiasi normale coltura batterica e infezione è confermata dalla PCR. La coltura binaria risultante può essere mantenuta in laboratorio e utilizzata per esperimenti futuri. Mentre la contaminazione è una possibilità, la coltura binaria può essere purificata sia filtrando ulteriormente e rifezione dell'ospite, sia placcando la cultura binaria e lo screening per le colonie infette. Speriamo che questo protocollo possa essere esteso ad altri tipi di campioni e ambienti, portando alla coltivazione di molte più specie nella RCP.

La PCR per il rilevamento di Saccharibacteria può apparire negativa (cioè nessun prodotto visto) nelle colture di infezione iniziale a causa di un basso numero di simbionti Saccharibacteria. Tuttavia, dopo alcuni passaggi dovrebbe apparire un forte prodotto PCR che mostra che si è verificata un'infezione stabile (Figura 1A). Al contrario, alcune infezioni appariranno inizialmente positive dalla PCR, ma diminuiranno fino a non rilevabili dopo 1-4 passaggi (non mostrati). Ciò indica che una grande quantità di cellule saccharibacteria erano presenti nel filtrato iniziale ma sono state diluite per passaggio e nessuna è stata in grado di entrare in una simbiosi stabile con la coltura ospite. La sperimentazione di diverse specie ospiti con lo stesso filtrato saccharibacteria dalla cavità orale avrà di solito un basso tasso di successo (Figura 1B) in quanto l'interazione simbionte-ospite è molto specifica. Un ricercatore può anche testare lo stesso ospite con filtrati da diversi soggetti. Se si utilizza un buon organismo ospite (come Arachnia propionica o Schaalia odontolytica),ci si può aspettare un tasso di successo del 50%.
I test da parte della PCR sono fondamentali. Ricercatori esperti hanno tentato di confermare l'infezione per microscopia, solo per segnalare falsi positivi. Le cellule saccharibacteria sono piccole e difficili da distinguere tra vescicole o rigonfiamenti irregolari dell'involucro cellulare. Un segnale PCR stabile attraverso diversi passaggi è la chiave per confermare un'infezione di successo.
Man mano che le culture infette crescono, dovrebbe apparire una normale crescita torbida. Man mano che la simbiosi si stabilisce, le colture infette appariranno meno torbidi delle colture di organismi ospiti non infetti (Figura 2A). In alcuni casi, le culture infette possono sembrare smettere completamente di crescere e non diventare affatto torbidi. Ciò può essere dovuto a un'infezione in cui le cellule saccharibacteria stanno travolgendo l'organismo ospite. L'aggiunta di ospite "fresco" (non infetto) a queste culture dovrebbe fornire una popolazione di ospiti sufficiente a sostenere la continua crescita dei parassiti saccharibacteria.
La crescita eccessivo, o colture eccessivamente torbidi, può indicare la contaminazione da un contaminante di laboratorio o da un altro piccolo batterio orale che è stato in grado di passare attraverso il filtro da 0,2 μm. Campylobacter e Capnocytophaga spp. Questo può essere confermato placcando la coltura e cercando colonie atipiche dell'organismo ospite seguite dal sequenziamento di 16S rRNA. Se si verifica una contaminazione, filtrare queste colture attraverso un filtro da 0,2 μm è solitamente sufficiente per rimuovere i contaminanti. Le cellule saccharibacteria nel filtrato possono essere concentrate per centrifugazione e utilizzate per infettare di nuovo una coltura ospite pura.
Un altro modo per purificare una cultura contaminata è raccogliere colonie infette dalla placcatura di una cultura infetta. Colonie di ospiti infetti possono talvolta essere identificate dalla forma irregolare della colonia rispetto alle colonie non infette (Figura 2B-D). Queste colonie irregolari dipendono dal tintore di Saccharibacteria nella coltura binaria e una piccola percentuale di colonie apparirà irregolare se il formicolio è basso. Questo può rendere facile identificare le colonie infette, che possono essere raccolte e utilizzate per iniziare una cultura binaria pura. Se non si vedono colonie irregolari sulla placcatura da una coltura infetta da Saccharibacteria, è possibile che il simbionte si trova a un basso formicolio o non causi colonie di forma irregolare. In tal caso, le colonie di screening PCR con un aspetto normale possono mostrare infezione da Saccharibacteria, ma a un tasso basso (2-10% di tutte le colonie).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Figura 1: Risultati tipici della PCR delle infezioni da Saccharibacteria delle colture ospiti. (A) Un prodotto PCR che indica la presenza di Saccharibacteria può non apparire con l'infezione iniziale, ma può apparire e diventare più forte nei passaggi successivi man mano che la cocultura si stabilisce. (B) La maggior parte degli ospiti infettati da filtrato arricchito da Saccharibacteria non sosterrà la loro crescita a causa della specificità della simbiosi. In questo esempio, solo A. propionica è stato infettato con successo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Figura 2: Caratteristiche di crescita delle colture infette da Saccharibacteria. (A) Le curve di crescita delle colture infette e non infette di A. propionica che mostrano una coltura infetta non cresceranno alla stessa densità del controllo non influenzato e appariranno meno torbidi. (B-D) La placcatura delle coculture può produrre colonie irregolari, causate da infezioni da Saccharibateria. Le colonie irregolari diminuiranno in proporzione rispetto al formicolio dei Saccharibacteria nella cocoltura. (B) Ospite con un alto livello di Saccharibacteria. (C) Saccharibacteria diluiti 10 volte (D) Coltura ospite non infetta. Le frecce bianche indicano esempi di colonie irregolari. Scale bar= 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">cm.</a>

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Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Dimostriamo un metodo per isolare i membri difficili da coltivare del nuovo phylum batterico, Saccharibacteria, filtrando la placca dentale e co-coltivando con i batteri ospiti.

Stabilire culture binarie stabili di Saccharibacteria simbiotici dalla cavità orale

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

I saccharibatteri sono parassiti obbligati che richiedono co-coltura con batteri ospiti appropriati. Poiché i saccaribatteri orali umani possono essere facilmente isolati per la maggior parte degli individui che utilizzano specie batteriche ospiti conosciute. Questo protocollo consentirà a qualsiasi ricercatore o laboratorio di isolare i propri ceppi nella co-coltura binaria.Questa tecnica utilizza semplici dispositivi e attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori microbiologici ed è stata utilizzata con successo per coltura di oltre 30 isolati che rappresentano sei specie di saccharibacteri. Questo protocollo può essere utile per l'isolamento di altre specie di radiazioni seguite dal candidato, nonché di saccaribatteri provenienti da ambienti diversi e altri mammiferi, se è possibile identificare e isolare adeguati ospiti anobatterici. A dimostrare la procedura sarà Andrew Collins, un ex post-dottorato nel mio laboratorio.Per iniziare, inizia colture di batteri ospiti come l'arachnia propionica, con abbastanza tempo per crescere fino alla fase stazionaria precoce. Per iniziare la coltura, inoculare da due a cinque millilitri di brodo di soia triptico contenente lo 0,1% di estratto di lievito con arachnia propionica e incubarlo a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, assemblare i supporti filtranti con membrane filtranti da 0,2 micrometri incise.Avvolgerli in un foglio e sterilizzare con autoclave, insieme a tubi di centrifuga e gruppi di tappi. Sterilizzare forniture extra in caso di contatto accidentale con superfici non sterili. Raccogliere la placca dentale raschiando lungo la linea gengivale, utilizzando un punto di carta sterile, una curetta aggraziata o uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta e trasferirla in un tampone adatto come MRD o PBS.Tenere il campione sul ghiaccio fino a quando non è pronto a procedere ulteriormente. Rimescolare vigorosamente la placca dentale utilizzando una combinazione di vortici e pipettaggio con una piccola punta di pipetta, quindi aggiungere il campione di placca rimorsio su un tubo contenente nove millilitri di tampone MRD. Scartare con cura un gruppo filtrante sterile con tecnica aseptica.Srotoilare un quarto di giro e stringere di nuovo il supporto del filtro per assicurarsi che i fili siano correttamente innesati e che l'apparecchio sia correttamente chiuso. Lavare la membrana passando 10 millilitri di tampone MRD attraverso l'apparecchio, usando una siringa. Per applicare il campione al filtro lavato, rimuovere lo stantuffo da una siringa e attaccarlo all'apparato filtrante.Posizionare un tubo di centrifuga sterile sotto quell'apparato filtrante per catturare il filtrato, quindi versare il campione dentale disperso nella siringa e caricarlo sul filtro. Quindi applicare una leggera pressione sul pistone per spingere il campione attraverso il filtro. Lavare la membrana con altri 10 millilitri di tampone MRD e raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo del campione filtrato.Quindi capovolgi il tubo a livello asettico e tieni il ghiaccio. Fare un segno di orientamento sul tubo e sul cappuccio per identificare la posizione del pellet di cella dopo la centrifugazione. Posizionare il tubo in una centrifuga ad alta velocità con il segno sul lato superiore e centrifugare i campioni a 60.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, versare con cura il supernatante, mantenendo il pellet sul lato superiore del tubo. Quindi rimescolare il pellet in uno o due millilitri di tampone MRD con un vortice vigoroso. Preparare tubi di coltura aliquotando due millilitri di mezzi di crescita appropriati nei tubi.Aggiungere quindi 200 microlitri di coltura notturna di organismi ospiti e da 100 a 200 microlitri di campione filtrato rimorsinato a ciascun tubo. Incubare i campioni combinati in condizioni appropriate per l'organismo ospite. Passare le cellule ogni due o tre giorni trasferendo 200 microlitri della coltura binaria a due millilitri di mezzo di crescita fresco in un nuovo tubo.Se le colture passaggio non mostrano alcuna crescita a 200 microlitri di coltura ospite non infetta, quando si passa le cellule, restituire tubi inoculati all'incubatore. I microlitri Aliquote 24 del master PCR si mescolano in un tubo PCR da 0,2 millilitri. In un microlitro di coltura infetta da saccharibacteria, posizionare il tubo in un ciclore Thermo.Impostare il programma PCR come descritto nel manoscritto di testo. Caricare ed eseguire i prodotti PCR su un gel Agros dell'1%. Una banda di circa 600 basi confermerà la presenza di saccharibacteria.Per confermare la purezza delle colture positive, eseguire una diluizione seriale di 10 volte della cocoltura di saccharibacteri in un tampone sterile e distribuire 100 microlitri su una piastra di agar. Incubare la coltura in condizioni di crescita appropriate e osservare gli organismi contaminanti. Una banda di circa 600 basi confermerà la presenza di saccharibacteria.Il rilevamento della PCR può apparire negativo nelle colture di infezione iniziale a causa di un basso numero di simbionti saccharibacteria. Tuttavia, dopo alcuni passaggi, dovrebbe apparire un forte prodotto PCR, che indica che si è verificata un'infezione stabile. Testare diverse specie ospiti con lo stesso filtrato saccharibacteria di solito avrà un basso tasso di successo.Poiché l'interazione dell'host simbionte è molto specifica. Man mano che le culture infette crescono, dovrebbe apparire una normale crescita torbida. Man mano che la simbiosi si stabilisce, le colture infette appariranno meno torbidi delle colture di organismi ospiti non infetti.Una coltura contaminata può essere purificata raccogliendo colonie infette dopo la placcatura. Le colonie infette possono talvolta essere identificate da una forma irregolare di colonia rispetto alle colonie non infette. La proporzione di colonie regolari dipende dal formicolio dei saccharibatteri nella coltura binaria.Se il formicolio è basso, meno colonie appariranno irregolari, rendendo facile scegliere le colonie infette e iniziare una pura cultura binaria. Le culture potrebbero non apparire positive per diversi passaggi. Quindi saranno necessari alcuni pazienti.È anche necessario controllare regolarmente la contaminazione delle colture binarie, in quanto ciò può destabilizzare la cultura e portare alla morte dei saccharibacteria. La coltura binaria può essere utilizzata per tutti i tipi di esperimenti di laboratorio. DNA e RNA possono essere estratti rispettivamente per il sequenziamento del genoma e l'analisi del trascrittame.La patogenicità può anche essere studiata utilizzando modelli animali.

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