Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
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著者らは、アン・タナー、ブルース・パスター、ハイケ・ボワバート、シュエソン・ヘ、バトビレッグ・ボーが有益な議論をしてくれたことに感謝し、細菌株を提供してくれた。スーザン・ヨストとジェシカ・ウッズの微生物技術支援に感謝します。この出版物で報告された研究は、賞番号R37 DE016937(FED)、R01 DE024468(FED)およびT32 DE007327(AJC)の下で国立衛生研究所の国立歯頭顔面研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

このプロトコルを開発する際、IRBの承認を求め、承認(#14-10)、インフォームド・コンセントはすべての対象から得られた。
1. 準備
<ol><li>人間の被験者と協力する場合は、必要なIRBの承認とインフォームド・コンセントを取得します。</li>
	<li>早期定常段階に成長するのに十分な時間を持つ宿主細菌の培養を開始する。例えば、0.1%酵母エキスを加えたトリプティック大豆ブロス2〜5mLを アラクニアプロピオンカ で2〜5mL(TSBY)し、37°Cで24時間インキュベートする。</li>
	<li>トラックエッチングされた0.2 μmのフィルター膜を用いてフィルターホルダーを組み立てます。ホイルでアセンブリを包み、オートクレーブで殺菌します。</li>
	<li>遠心管およびキャップアセンブリを殺菌する。</li>
</ol>2. 口腔内細菌のサンプルを入手する
注:多くの経口サンプルにはサッカリバクテリア(例えば、唾液、扁桃の綿棒、舌の擦り傷)が含まれていますが、歯垢は日常的に最も成功しています。
<ol><li>滅菌紙の点、グレーシーキュレットを使用してプラークスクレイピングを取るか、または、自己サンプリングの場合は、無菌の爪楊枝またはピペットチップを使用してください。プラークを適切なバッファーに移し、例えば、最大回収希釈剤(MRD、0.85% NaCl、0.1%ペプトン)またはPBS。すぐに処理されない場合は、サンプルを氷の上に置いて、準備が整うまで保管してください。</li>
	<li>小さなピペットチップを使用して、ボルテックスとピペットの組み合わせを使用して、MRDバッファー内の歯垢を激しく再中断します。</li>
	<li>再懸濁したプラークサンプルを追加の9 mLのMRDバッファーに追加します。</li>
</ol>3. 口腔試料から濾液を準備する
<ol><li>無菌技術を使用して、無菌フィルターアセンブリをアンラップします。4分の1回転を外し、フィルターホルダーを締め直して、スレッドが適切に係合され、装置が適切に閉じられていることを確認します。注射器を用いて、10mLのMRDバッファーを装置に通して膜を洗浄する。不適切なアセンブリは、フィルターホルダーから漏出流体によって、このステップで明らかにされます。漏れが生じた場合は、別の滅菌フィルターアセンブリを取得し、洗浄工程を繰り返します。</li>
	<li>洗浄したフィルターにサンプルを塗布します。シリンジからプランジャーを取り出し、フィルター装置に取り付けます。10 mLのMRDバッファーに分散した歯科サンプルを注射器に注ぎ、フィルターに積み込みます。</li>
	<li>フィルター装置の下に無菌遠心管を置いて濾液を捕捉し、プランジャーに軽い圧力をかけてサンプルをフィルターに押し込みます。</li>
	<li>別の10 mLのMRDバッファーで手順を繰り返して膜を洗浄し、濾過サンプルと同じチューブにフロースルーを収集します。無菌でチューブをキャップします。</li>
</ol>4. 遠心分離によるサッカリバクテリア細胞の濃縮
<ol><li>チューブとキャップに向きマークを付け、上部にマークが付いた高速遠心分離機にチューブを配置します。遠心分離から形成されたペレットは、通常は見えない。このマーキングは、遠心分離が行われ、チューブが遠心分離から取り除かれたときに、サッカリバクテリア細胞のペレットがどこに位置するかを決定するのに役立ちます。</li>
	<li>サンプルを4°Cで1時間60,000xgで遠心分離する。 注:この力と時間は、すべてのサッカリバクテリア細胞をペレットするのに十分です。しかし、サッカリバクテリア細胞は、20,000 x gでわずか20分間の遠心分離によって少なくとも部分的にペレット化することができる。</li>
	<li>慎重に遠心分離機からチューブを取り外します。チューブの上側にペレットを保ち、チューブから液体を注ぎます。</li>
	<li>通常、不可視ペレットを活発な渦を通してMRDバッファーの1〜2 mLに再懸濁する。</li>
</ol>5. サッカリバクテリアを豊富に含む濾液で宿主培養物に感染する
<ol><li>適切な成長培地(例えば、TSBY、BHIなど)の2 mLをチューブにアリクォートして培養管を調製する。</li>
	<li>各チューブに宿主生物の一晩培養200μLを加えます。各チューブに100~200μLの再懸濁されたフィルターサンプルを加えます。</li>
	<li>インキュベートは、宿主生物に適したサンプルを組み合わせた(例えば、37°C、A. プロピオンカの好気性雰囲気中)。</li>
	<li>200 μLのバイナリー培養を新しいチューブで2 mLの新鮮な成長培地に移すことによって、2~3日ごとに細胞を通過させる。通過培養物が成長を示さないと思われる場合(すなわち、新鮮な培地に通った後に培養の濁度/光学密度が増加しない)、サッカリバクテリアは、すべての宿主生物を圧倒または殺す可能性があります。これを改善するには、細胞を通過させるときに感染していない宿主培養物を200μL加える。5箇所以上を繰り返します。</li>
</ol>6. PCRによる感染の確認
<ol><li>5つの通路の後、PCRによる感染を確認する。5つの通路は、PCRの25サイクルを使用して検出の限界を超えて枯渇している非成長サッカリバクテリア細胞よりも保証されます。</li>
	<li>PCR マスターミックスを準備します。推奨レシピは以下の通り、必要な各チューブに対して、 12.5 μL 2x PCR バッファー、0.75 μL 10 μM フォワードプライマー (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C)、0.75 μL 10 μM リバースプライマー(1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCTCC)、1 μL 25mMM および 9mMMg 2MMMM および 9mM Mg 9MMMM および 9 μL渦を混ぜます。</li>
	<li>0.2 mL PCRチューブにマスターミックスのアリコート24 μL。1 μLのサッカリバクテリア感染培養液をPCR反応に加えます。チューブをサーモサイクラーに入れ、次のプロトコルを実行します:最初の変性95°C5分、30sの95°Cの25サイクル、30sの60°C、30sの72°C、72°Cでの最終伸びを2分間、そして4°Cで最終保持します。</li>
	<li>PCR産物を1%アガロースゲルでロードして実行します。600塩基のバンドは、サッカリバクテリアの存在を示します。</li>
</ol>7. 純度を確認し、汚染生物を除去する
<ol><li>宿主生物の増殖に十分な栄養寒天にサッカリバクテリアの共培養をめっきすることにより、陽性培養物の純度を確認する。滅菌バッファー(MRDまたはPBSなど)で培養液の10倍の連続希釈を行い、寒天プレートに100 μLを広げます。寒天プレート上に約20〜200コロニーが生育するような希釈を行う。</li>
	<li>適切な成長条件で培養をインキュベートし、微生物を汚染することを観察する。 注:アキセン性サッカリバクテリアコロニーは一度も観察されていないので、これらのプレート上で増殖しているのは宿主生物のみが観察されています。複数のコロニータイプは通常、汚染を示す。汚染が発生した場合、培養物を再濾過して不要な汚染物質を除去し、新鮮な宿主に再接種する必要があります。</li>
	<li>時には二重感染が起こり、2種のサッカリバクテリアが同じ宿主に感染する。サッカリバクテリア種を分離するには、20 μLの滅菌PBSで個々のコロニーを再懸濁し、1 μLの懸濁液をPCR反応に使用して、サッカリバクテリア感染のコロニーを検出します。</li>
	<li>バイナリカルチャを開始するために成長培地に肯定的な結果を与えた懸濁液を転送します。.成功率は、培養中の各サッカリバクテリア種の火長に依存します。感染したコロニーを見つけるために50以上のコロニーをスクリーニングする必要があるかもしれません。</li>
</ol>8. 文化の保管
<ol><li>一晩で十分な容積(10-50 mL)のバイナリ培養を成長させる。</li>
	<li>遠心分離によるペレット細胞(10分間4,000xg)。 注:サッカリバクテリア細胞は宿主のより大きく、重い細胞に結合し、それらとペレットになるので、高速遠心分離はここでは必要ありません。</li>
	<li>凍結保護剤の細胞を再中断します。5%DMSOまたは20%グリセロールのいずれかを補った成長培地は、通常十分である。宿主生物が凍結保護剤媒体と互換性があることを確認してください(例えば 、A.プロピオンカ の成長はグリセロールによって阻害され、凍結したストックは復活しない可能性があります)。凍結保護剤で感染していない宿主培養の生存率をテストし、在庫が凍結して生き残ることを確認します。</li>
	<li>同じ培養液中の細胞ペレットを再懸濁(10〜50mL)。アリコート 0.5 mL ラベル付きクライオビアルに。細胞培養物を-80°Cで凍結する。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+gen.+nov.,+sp.+nov.,+a+human+intestinal+mucin-degrading+bacterium.">Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).</li><li>Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinivorans+hirudinis+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+anaerobic,+mucin-degrading+bacterium+isolated+from+the+digestive+tract+of+the+medicinal+leech+Hirudo+verbana.">Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).</li><li>Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+system+regulates+hemin+acquisition+in+porphyromonas+gingivalis.">A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis.</a> PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).</li><li>Martin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+growth+media+for+oral+bacteria.">New growth media for oral bacteria.</a> Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).</li><li>Vartoukian, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+'unculturable'+oral+bacteria,+facilitated+by+community+culture+and+media+supplementation+with+siderophores.">In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores.</a> Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).</li><li>Strandwitz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-modulating+bacteria+of+the+human+gut+microbiota.">GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota.</a> Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).</li><li>Hug, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+the+tree+of+life.">A new view of the tree of life.</a> Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).</li><li>Castelle, C. J., Banfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+new+microbial+groups+expand+diversity+and+alter+our+understanding+of+the+tree+of+life.">Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life.</a> Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+human-associated+TM7+phylotype+reveals+a+reduced+genome+and+epibiotic+parasitic+lifestyle.">Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).</li><li>Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+candidate+division+TM7,+a+recently+recognized+major+lineage+of+the+domain+Bacteria+with+no+known+pure-culture+representatives.">Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).</li><li>Brinig, M., Lepp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+bacteria+of+division+TM7+in+human+subgingival+plaque+and+their+association+with+disease.">Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+obtained+by+culturing+saccharibacteria+with+their+bacterial+hosts.">Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts.</a> Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+physiological+characterization+of+the+epibiotic+interaction+between+TM7x+and+its+basibiont+actinomyces.">Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces.</a> Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).</li><li>Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+plaque+development+on+defined+streptococcal+surfaces.">Dental plaque development on defined streptococcal surfaces.</a> Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).</li><li>Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+candidate+phyla+radiation+Saccharibacteria+(TM7)+bacteria+in+coculture+with+bacterial+hosts.">Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts.</a> Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).</li><li>Cross, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

プラークを濾過し、宿主生物の純粋な培養物に適用する我々の方法は、主に最初に培養されたサッカリバクテリアに関する以前の観察に基づいている、 'ナノシンバクターリチカス'株TM7x11,14,15.小さな細胞サイズを考えると、フィルターを使用して歯垢から分離し、遠心分離で濃縮することができると推測した。第二に、これらの生物は寄生虫として生きており、これらの細胞に宿主の純粋な培養を提供することは、彼らが共生に入り、バイナリ培養として成長することを可能にする。
この方法の1つの利点は、濃縮培養または選択的圧力を必要としないことである。'ナノシンバクターの株 TM7xは、セレクティブ剤としてストレプトマイシンを用いた濃縮培養から培養され、シーケンシングはサッカリバクテリアの濃縮に有効であると示唆していた。幸運なことに、「ナノシンバクター・リチカスのシャリア・オドントリチカ」の宿主は、ストレプトマイシン16に耐性であることが知られている。抗生物質を選択的な薬剤として使用することは、宿主生物の増殖を防ぐことも可能であり、サッカリバクテリアの増殖を妨げるであろう。
エンリッチメント文化を使用するより大きな問題は、急速に成長している生物がすぐに関心のある生物を置き換えるということです。口腔内では、例えば、 ストレプトコッカス 種は、急速に成長することができ、かつ、糖が成長培地に存在する場合、培地を酸性化するのに十分な酸を産生し、さらに目的の生物に対して選択する。濃縮培養と選択的抗生物質を避けることによって、我々の方法は、これらの他の方法の合併症なしにサッカリバクテリアおよび潜在的な宿主のより広い範囲に適用することができる一般的なアプローチを提供する。
ここに示す方法には、いくつかの障害があります。まず、この方法は、サッカリバクテリアがバイナリー培養に住んでいると仮定する。私たちは、その有効性を測定するために三項または三項培養の組み合わせをテストしていませんが、単一の宿主生物が供給できない成長因子を必要とするサッカリバク菌がある可能性があります。サッカリバクテリアの増殖を支えることができる口腔内細菌の膨大な組み合わせをテストすることは困難な作業になります。第二に、この方法は、すべてのサッカリバクテリアが0.2 μmフィルターを通過するのに十分小さいと仮定する。他のサッカリバクテリアが信じられていたよりも大きく、フィルターがこれらの生物に対して選択している可能性があります。より大きな孔サイズのフィルターを使用することができますが、これは感染した共培養に多くの不要な口腔細菌を許可するリスクを実行します。最後に、すでに公開されているもの以外の宿主種を見つけることは非常に困難です。これまでのところ、唯一の成功した宿主は、属アクチノミセス、シャアリア、アラクニアおよびセルロシミオビウム、フィラムアクチノバクテリア15、17、18のすべてのメンバーからの種である。しかし、これらの宿主は特定のサッカリバクテリアの増殖のみをサポートする。サッカリバクテリアのより多くの種を培養するには、より多くの宿主を探索する必要があります。
ここで発表された方法が、サッカリバクテリアや他のCPR生物の将来の研究に役立つことを願っています。メタゲノムシーケンシングは、これらの生物も小さなゲノムを有し、共生であるか、または生存に不可欠な代謝産物および他の要因を供給するために地元の微生物群集に依存していると疑われていることを示唆している。同様のフィルタリング戦略は、これらの生物が十分に小さく、宿主生物を培養できる限り、これらの生物を分離するために使用することができる。ここで説明する方法は、この大規模で多様な細菌群に実験室培養の強力なツールをもたらす第一歩です。

細菌の新種を培養し、実験室に持ち込むことは、彼らの生理学と微生物群集内のより広範な相互作用をよりよく理解するための強力な実験を可能にする。これらの質問(例えば、「メタオミクス」など)を尋問する培養のない方法がありますが、多様な微生物集団の複雑な相互作用は、単一の変数を離れて意味のある結論に達することを困難にします。細菌を培養することは多くの利点を持っていますが、細菌を単離し、純粋な培養でそれを成長させる多くの潜在的な障壁があります。潜在的な特異的成長要件は、pH、酸素張力、ビタミン、成長因子、シグナル伝達分子、あるいは成長を引き起こす直接的な細胞接触を含む1。しかし、特定のオーソトロフィーが新種の細菌を培養する主な抑止力であると考えられています。標準的な培地製剤は、特定のビタミンや炭素源など、未栽培の細菌に必要な多くの栄養素を欠いている。これらの欠けている分子は、未培養細菌の生理学の鍵となり、通常は微生物群集の別の生物または宿主生物のいずれかによって提供される。例えば、ムチンのような複雑な炭水化物は、動物宿主によって提供され得る。これらを培地に添加することで、アッカーマンシア・ムチニフィラおよびムシニヴォラン・ヒルディニス2、3、4を含む動物の腸からいくつかの細菌の培養が可能になった。多くの病原性細菌は、動物細胞においてヘミンに結合した鉄を使用する能力を進化させたが、口腔病原体ポルフィロミナス歯肉5を含む。研究室では、ポルフィロマおよび他の生物の増殖は、ヘミン6の添加によって刺激され得る。
最近、細菌の新しい単離物を培養する上で多くのブレークスルーは、その成長に必要な未培養細菌に特定の要因を提供するために「フィーダー」生物を使用して、共培養を通じて来ています。Vartoukianたちの優雅な研究は、細菌によって産生される鉄結合分子であるシデロフォアが、いくつかの新しい経口単離物の成長を刺激することを示した。ピオベルジンは、シュードモナド種によって産生されるシデロフォアの一種であり、新しいプレボテラ種7の成長を著しく促進することが示された。同じ研究において、クロロルレクシの第1の経口単離物を栽培し、またF.核をヘルパーとして使用して、まだ未知の化合物7を提供する。さらに最近では、ルミノコッカス科属由来の細菌をヘルパー生物8としてバクテロイデス・フラジリスを用いて単離した。その後、ガンマアミノ酪酸(GABA)、抑制性神経伝達物質が、実験室のメディア上の成長に必要とされていたことが示されました。フィーダー生物を使用することは、培養されていない細菌が増殖する特定の微小環境を模倣するための重要な戦略であることが証明されており、様々な濃度で異なる添加物を持つ成長培地を継続的に再配合するよりも効率的であることが証明されています。
未培養細菌の最大のグループの一つは、「候補フィラ放射」(CPR)、いくつかの候補細菌フィラ9、10の単球群である。この書き込みの時点で、CPR内のサッカリバクテリアフィラムのメンバーだけが実験室で正常に培養されています。第1の単離物'ナノシンバクター・リチカス'株TM7xは、未培養TM711、12のために濃縮すると予測されていた抗生物質ストレプトマイシンを使用して単離した。この研究の重要な発見は、細菌宿主であるSchaalia odontolyticaと直接接触して成長する寄生虫として新しい単離物が成長し、顕微鏡検査はこれらの寄生虫が超小細菌であることを示した。
これらの手がかりを用いて、0.2μmのフィルターを通して歯垢やその他の経口サンプルを濾過し、遠心分離によって濾液中の細胞を採取し、それらを使用して候補宿主細菌の培養物に感染させることによって、サッカリバクテリアのバイナリコ培養をパートナーと迅速に確立する方法を考案しました。この方法は、急速に成長している生物で圧倒することができる濃縮文化を避けるという利点を有する。また、抗生物質の使用を避け、標的となるサッカリバクテリア種またはその宿主の成長を止めることができる。ここで示した方法を用いて、我々はサッカリバクテリアフィラムから32の分離株を培養することに成功した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

多くの細菌種は、標準的な方法を使用して実験室で培養することができず、地球上の微生物の多様性の大部分を研究する上で大きな障壁を引き起当てます。これらの培養されていない細菌を培養する新しいアプローチは、研究者が実験室で利用可能な強力なツールを使用して生理学とライフスタイルを効果的に研究できるようにする必要があります。フィラ放射線候補(CPR)は、地球上の生きている多様性の約15%を含む未培養細菌の最大のグループの一つです。このグループの最初の単離株は、サッカリバクテリアフィラムのメンバーでした, 'ナノシンバクターの腸の株 TM7x. TM7xは、細菌宿主、 シャアリア・オドントリチカ、 株XH001と直接接触して共生として生きる異常に小さな細菌です。異常に小さい細胞サイズと共生生物としての生活様式を利用して、我々は歯垢からサッカリバクテリアを急速に培養するプロトコルを開発した。このプロトコルは、0.2 μmフィルターを介して歯垢の懸濁を濾過し、収集したサッカリバクテリア細胞を濃縮し、宿主生物の培養物に感染する方法を示します。得られたコカルチャーは、PCRにより正常な細菌培養および感染が確認されるように継代することができる。結果として得られるバイナリー培養は、実験室で維持され、将来の実験に使用することができる。汚染が可能である一方で、バイナリ培養は、宿主のさらなるフィルタリングおよび再感染、または感染したコロニーのバイナリ培養およびスクリーニングをめっきすることによって精製することができる。私たちは、このプロトコルが他のサンプルタイプや環境に拡大され、CPRにおけるより多くの種の栽培につながることを願っています。

サッカリバクテリアの検出のためのPCRは、サッカリバクテリア共生生物の数が少ないため、初期感染培養において陰性(すなわち、製品は見られない)に見えることがある。しかし、いくつかの通路の後、強いPCR産物が安定した感染が起こったことを示すはずです(図1A)。逆に、一部の感染症は最初はPCRによって陽性に見えますが、1〜4の通過後には検出不能に減少します(図示しません)。これは、初期の濾液中に大量のサッカリバクテリア細胞が存在していたが、通過によって希釈され、宿主培養と安定した共生に入ることができなかったことを示している。口腔から同じサッカリバクテリア濾液を有するいくつかの宿主種を試験することは、通常、共生宿主の相互作用が非常に特異的であるため、低い成功率(図1B)を有するであろう。研究者はまた、いくつかの異なる被験者からの濾液で同じホストをテストすることができます.良い宿主生物( アラクニアプロピオニカ や シャリアオドントリティカなど)を使用すると、50%の成功率が期待できます。
PCR によるテストは非常に重要です。経験豊富な研究者は、偽陽性を報告するためだけに、顕微鏡検査による感染を確認しようとしました。サッカリバクテリア細胞は小さく、小胞と不規則な細胞エンベロープの膨らみを区別することは困難です。感染が成功したことを確認するには、いくつかの通路を通して安定したPCRシグナルが重要です。
感染した培養物が成長するにつれて、正常な濁った成長が現れるはずです。共生が確立するにつれて、感染した培養物は、感染していない宿主生物の培養物よりも濁って見えなくなる(図2A)。感染した培養物が完全に成長しなくなり、まったく濁らない場合があります。これは、サッカリバクテリア細胞が宿主生物を圧倒している感染症によるものと考えられる。これらの培養物に「新鮮な」(感染していない)宿主を加えることは、サッカリバクテリア寄生虫の継続的な増殖を支える十分な宿主集団を提供すべきである。
過剰増殖、または過度に濁った培養物は、0.2 μmフィルターを通過することができた実験室汚染物質または別の小さな経口細菌のいずれかによる汚染を示す可能性があります。 カンピロバクター および カプノサイトファガspp. は、これらの実験の典型的な経口汚染物質である。これは、培養物をめっきし、宿主生物の非定型であるコロニーを探し、その後16S rRNAシーケンシングを行うことで確認することができる。汚染が見られる場合、これらの培養物を0.2 μmのフィルターでろ過すれば、通常は汚染物質を除去するのに十分です。濾液中のサッカリバクテリア細胞は遠心分離によって濃縮され、純粋な宿主培養物に再感染するために使用することができる。
汚染された培養物を浄化するもう一つの方法は、感染した培養物をめっきから感染したコロニーを摘み取る方法である。感染した宿主のコロニーは、感染していないコロニーと比較して不規則なコロニー形状によって識別される場合がある(図2B-D)。これらの不規則なコロニーは、バイナリー培養におけるサッカリバクテリアの価価に依存しており、価価が低い場合、コロニーの割合が少ないと不規則に見える。これにより、感染したコロニーを簡単に特定することができ、純粋なバイナリー培養を開始するために使用することができます。サッカリバクテリア感染培養物からのめっきに不規則なコロニーが見られない場合、共生生物が低い価数にあるか、不規則な形のコロニーを引き起こさない可能性がある。このような場合、正常な外観を有するPCRスクリーニングコロニーは、サッカリバクテリアによる感染を示すことができるが、低率(全コロニーの2〜10%)である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> 図1:宿主培養のサッカリバクテリア感染の典型的なPCR結果(A)サッカリバクテリアの存在を示すPCR産物は、初期感染では現れないかもしれないが、共培養が確立するにつれて、その後の通路で現れ、より強くなる可能性がある。(B) サッカリバクテリアを豊富に含む濾液に感染した宿主のほとんどは、共生の特異性のためにその増殖を支えない。この例では、A.プロピオンカだけが正常に感染した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> 図2:サッカリバクテリア感染培養物の成長特性( A)感染培養を示す A.プロピオンカ の感染培養物の成長曲線は、感染していないコントロールと同じ密度に成長せず、濁って見えない。(B-D)コカルチャーのめっきは、サッカリバテリア感染によって引き起こされる不規則なコロニーを産生することができる。不規則なコロニーは、共培養中のサッカリバクテリアの火酸に対する割合が減少する。(B) サッカリバクテリアの高レベルの宿主(C)10倍希釈したサッカリバクテリア(D)感染していない宿主培養.白い矢印は、不規則なコロニーの例を示しています。スケールバー= 1 cm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

我々は、歯垢を濾過し、宿主細菌と共培養することによって、新しい細菌フィラムサッカリバクの成長困難なメンバーを単離する方法を実証する。

口腔から共生サッカリバクテリアの安定したバイナリ培養を確立する

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

サッカリバクテリアは、適切な宿主細菌との共培養を必要とする寄生虫です。ヒトの経口サッカリバクテリアとしては、既知の宿主細菌種を用いてほとんどの個体に対して容易に単離することができる。このプロトコルは、任意の研究者や研究室がバイナリコカルチャーで自分の株を分離することを可能にします。この技術は、ほとんどの微生物学研究所に存在する単純な装置および装置を使用し、6種のサッカリバクテリアを表す30種以上の分離株を培養するのに成功した。このプロトコルは、適切なアクチノバクテリア宿主を同定し、単離できる場合、他の候補に従った放射線種、ならびに異なる環境および他の哺乳類からのサッカリバクテリアの単離に有用であり得る。この手順を実証することは、私の研究室の元博士研究員のアンドリュー・コリンズです。まず、クモ膜プロピオンカなどの宿主菌の培養を開始し、早期定常期に成長するのに十分な時間を費やします。培養を開始するには、0.1%酵母エキスを含むトリプティック大豆ブロスを2~5ミリリットルにアラクニアプロピオンカで接種し、摂氏37度で24時間培養する。次に、トラックエッチング0.2マイクロメートルのフィルター膜を備えたフィルターホルダーを組み立てます。ホイルで包み、遠心分離管とキャップアセンブリと一緒にオートクレーブで滅菌します。非滅菌表面との偶発的な接触の場合には、余分な消耗品を殺菌する。歯垢をガムラインに沿って削り取り、滅菌紙ポイント、グレーシーキュレット、または無菌の爪楊枝またはピペットチップを使用して、MRDまたはPBSなどの適切なバッファーに移します。さらに進む準備ができるまで、サンプルを氷の上に置いておいてください。小さなピペットチップを使用してボルテックスとピペットの組み合わせを使用して歯垢を激しく再中断し、MRDバッファーの9ミリリットルを含むチューブに再懸濁プラークサンプルを追加します。無菌技術を使用して滅菌フィルターアセンブリを慎重にアンラップします。4分の1回転を外し、フィルターホルダーを締め直してスレッドが適切に係合され、装置が適切に閉じられていることを確認します。10ミリリットルのMRDバッファーを装置に通し、注射器を使用して膜を洗浄する。洗浄されたフィルターにサンプルを塗布するには、シリンジからプランジャーを取り出し、フィルター装置に取り付けます。そのフィルター装置の下に無菌遠心分離管を置いて濾液を捕まえ、分散した歯科サンプルを注射器に注ぎ、フィルターに積み込みます。次に、プランジャーに軽い圧力をかけて、サンプルをフィルターに押し込みます。膜を別の10ミリリットルのMRDバッファーで洗浄し、濾過サンプルと同じチューブ内の流れを収集します。その後、無菌でチューブをキャップし、氷の上に保ちます。チューブとキャップに向きマークを付けて、遠心分離後の細胞ペレットの位置を特定します。上側にマークを付けた高速遠心分離機にチューブを置き、サンプルを摂氏4度で1時間60,000 Gで遠心します。遠心分離後、上清を慎重に注ぎ、ペレットをチューブの上側に置きます。次に、ボクテクによってMRDバッファーの1〜2ミリリットルでペレットを再懸濁する。適切な成長培地を2ミリリットルずつチューブにアリクォートして培養管を準備します。次いで、宿主生物の一晩培養200マイクロリットルと、各チューブに再懸濁濾過サンプルの100〜200マイクロリットルを加える。結合サンプルを宿主生物に適した条件下でインキュベートする。200マイクロリットルのバイナリー培養物を新しいチューブ中の新鮮な成長培地の2ミリリットルに移すことによって、2〜3日ごとに細胞を通過させる。継代行培養物が200マイクロリットルの未感染宿主培養で増殖を示さない場合、細胞を通過させると、接種されたチューブをインキュベーターに戻す。24マイクロリットルのPCRマスターミックスを0.2ミリリットルのPCRチューブに混ぜ合わせます。サッカリバクテリア感染培養液の1マイクロリットルで、チューブをサーモサイクラーに入れます。テキスト原稿に記載されているとおりにPCRプログラムを設定します。PCR 製品を 1%Agros ゲルでロードして実行します。約600塩基のバンドは、サッカリバクテリアの存在を確認します。陽性培養物の純度を確認するために、無菌緩衝液中のサッカリバクテリアの共培養物の10倍の連続希釈を行い、寒天板に100マイクロリットルを広げる。適切な成長条件下で培養をインキュベートし、微生物を汚染することを観察する。約600塩基のバンドは、サッカリバクテリアの存在を確認します。PCR検出は、サッカリバクテリアの共生生物の数が少ないため、初期感染培養において陰性に見えることがある。しかし、数回の経過の後、強いPCR産物が現れ、安定した感染が起こったことを示す。同じ糖菌の濾液を有するいくつかの宿主種を試験すると、通常は成功率が低い。共生ホストの相互作用は非常に具体的です。感染した培養物が成長するにつれて、正常な濁った成長が現れるはずです。共生が確立するにつれて、感染した培養物は、感染していない宿主生物の培養物よりも濁って見えなくなる。汚染された培養物は、めっき後に感染したコロニーを摘み取ることによって精製することができる。感染したコロニーは、感染していないコロニーと比較して不規則なコロニー形状によって識別される場合があります。通常のコロニーの割合は、バイナリー培養におけるサッカリバクテリアの火酸に依存する。価価が低い場合、不規則に見えるコロニーが少なくなり、感染したコロニーを選んで純粋なバイナリー培養を始めるのが簡単になります。文化はいくつかの箇所に陽性に見えないかもしれません。だから、いくつかの患者が必要になります。また、バイナリ培養の汚染を定期的にチェックする必要があり、これは培養を不安定にし、サッカリバクテリアの死につながる可能性があります。バイナリカルチャは、あらゆる種類の実験室での実験に使用できます。DNAとRNAは、それぞれゲノムシーケンシングとトランスクリプトーム解析のために抽出することができます。病原性は、動物モデルを用いて調べることもできます。

Research

JoVE Journal

Biology

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