Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He og Batbileg Bor for nyttige diskusjoner og for å gi bakteriestammer. Vi takker Susan Yost og Jessica Woods for mikrobiell teknisk assistanse. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av The National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health under tildelingsnumre R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) og T32 DE007327 (AJC). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Ved utvikling av denne protokollen ble IRB-godkjenning søkt og godkjent (#14-10) og informert samtykke ble innhentet fra alle.
1. Forberedelse
<ol><li>Ved arbeid med mennesker, innhente nødvendig IRB-godkjenning og informert samtykke.</li>
	<li>Start kulturer av vertsbakterier med nok tid til å vokse til tidlig stasjonær fase. Inokuler for eksempel 2-5 ml tryptisk soyabuljong med 0,1% gjærekstrakt tilsatt (TSBY) med Arachnia propionica og inkuber ved 37 °C i 24 timer.</li>
	<li>Monter filterholdere med sporetset filtermembran på 0,2 μm. Pakk enheten i folie og steriliser ved autoklavering.</li>
	<li>Steriliser sentrifugerør og hetteenheter.</li>
</ol>2. Få prøve av orale bakterier
MERK: Mens mange orale prøver inneholder Saccharibacteria (f.eks. spytt, vattpinner av mandler, tungeskraping) er tannplakk rutinemessig den mest vellykkede.
<ol><li>Ta en plakkskraping med et sterilt papirpunkt, Gracey-curette, eller bruk en steril tannpirker eller pipettespiss hvis du prøver på den selvprøven. Overfør plakk til en passende buffer, for eksempel maksimal utvinningsdynningsmiddel (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% peptone) eller PBS. Hvis den ikke behandles umiddelbart, hold prøven på is til den er klar til å fortsette.</li>
	<li>Resuspender tannplakket kraftig i MRD-bufferen ved hjelp av en kombinasjon av virvel- og pipettering med en liten pipetspiss.</li>
	<li>Legg til resuspended plakkprøve i ytterligere 9 ml MRD-buffer.</li>
</ol>3. Forbered filtrat fra muntlig prøve
<ol><li>Bruk aseptisk teknikk til å pakke ut en steril filterenhet. Løsne en kvart omdreining og fest filterholderen igjen for å være sikker på at gjengene er ordentlig festet og apparatet er ordentlig lukket. Bruk en sprøyte til å vaske membranen ved å sende 10 ml MRD-buffer gjennom apparatet. Feil montering avsløres på dette trinnet ved at væske lekker ut av filterholderen. Hvis det oppstår lekkasje, må du skaffe en annen steril filterenhet og gjenta vasketrinnet.</li>
	<li>Påfør prøven på det vaskede filteret. Fjern stempelet fra en sprøyte og fest det til filterapparatet. Hell den dispergerte tannprøven, nå i 10 ml MRD-buffer, i en sprøyte og last den på filteret.</li>
	<li>Plasser et sterilt sentrifugerør under filterapparatet for å fange filtratet, og påfør deretter lett trykk på stempelet for å skyve prøven gjennom filteret.</li>
	<li>Gjenta prosedyren med ytterligere 10 ml MRD-buffer for å vaske membranen, samle gjennomstrømningen i samme rør som den filtrerte prøven. Aseptisk cap røret.</li>
</ol>4. Konsentrer Saccharibacteria celler ved sentrifugering
<ol><li>Lag et orienteringsmerke på røret og hetten og legg røret i en høyhastighets sentrifuge med merket på oversiden. Pellet dannet av sentrifugering er vanligvis usynlig. Merkingen vil bidra til å bestemme hvor pellet av Saccharibacteria celler er plassert når sentrifugering er gjort og røret fjernet fra sentrifugen.</li>
	<li>Sentrifuger prøvene ved 60 000 x g i 1 time ved 4 °C. MERK: Denne kraften og tiden er tilstrekkelig til å pellet alle Saccharibacteria celler. Saccharibacteria-celler kan imidlertid i det minste delvis pelletes ved sentrifugering i så lite som 20 minutter ved 20.000 x g.</li>
	<li>Fjern rørene forsiktig fra sentrifugen. Hell ut væsken fra røret, og hold pellet på oversiden av røret.</li>
	<li>Resuspend den vanligvis usynlige pellet i 1-2 ml MRD buffer ved kraftig virvel.</li>
</ol>5. Infiser vertskulturer med Saccharibacteria-beriket filtrat
<ol><li>Forbered kulturrør ved å aliquoting 2 ml passende vekstmedier (f.eks. TSBY, BHI, etc.) i rør.</li>
	<li>Tilsett 200 μL av over natten kultur av vertsorganismer til hvert rør. Tilsett 100-200 μL resuspended, filtrert prøve til hvert rør.</li>
	<li>Inkuber kombinerte prøver etter behov for vertsorganismen (f.eks. 37 °C, i en aerob atmosfære for A. propionica).</li>
	<li>Før cellene hver annen til tre dager ved å overføre 200 μL binær kultur til 2 ml fersk vekstmedium i et nytt rør. Hvis det ser ut til at de passasjerkulturene ikke viser noen vekst (dvs. kulturens turbiditet / optiske tetthet øker ikke etter passasje i friske medier) kan Saccharibacteria være overveldende eller drepe all vertsorganismen. For å rette opp dette, legg til 200 μL uinfektert vertskultur når du passerer cellene. Gjenta i minst 5 passasjer.</li>
</ol>6. Bekreft infeksjon av PCR
<ol><li>Etter 5 passasjer, bekreft infeksjon med PCR. Fem passasjer vil sikre enn noen ikke-voksende Saccharibacteria celler har blitt utarmet utover grensen for deteksjon ved hjelp av 25 sykluser av PCR.</li>
	<li>Forbered en PCR-mastermix. En foreslått oppskrift ved hjelp av er som følger, for hvert rør som trengs, forberede 12,5 μL 2x PCR-buffer, 0,75 μL 10 μM foroverprimer (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10μM Reversprimer (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 og 9 μL vann. Bland ved virveling.</li>
	<li>Aliquot 24 μL mastermix i et 0,2 ml PCR-rør. Tilsett 1 μL Saccharibacteria-infisert kultur til PCR-reaksjonen. Plasser røret i en termosykler og utfør følgende protokoll: Første denaturering 95 °C i 5 minutter, 25 sykluser på 95 °C i 30 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, endelig forlengelse ved 72 °C i 2 minutter, og hold deretter slutt på 4 °C.</li>
	<li>Last og kjør PCR-produktene i en 1% agarose gel. Et bånd på ~ 600 baser vil indikere tilstedeværelsen av Saccharibacteria.</li>
</ol>7. Kontroller renhet og fjern forurensende organismer
<ol><li>Bekreft renhet av positive kulturer ved å plating kokulturen av Saccharibacteria på næringsagar tilstrekkelig for veksten av vertsorganismen. Utfør en 10 ganger seriell fortynning av kulturen i steril buffer (f.eks. MRD eller PBS) og spred 100 μL på en agarplate. Utfør fortynning slik at det vil være ca 20-200 kolonier som vokser på agarplaten.</li>
	<li>Inkuber kulturen under passende vekstforhold og observere for forurensende organismer. MERK: Axenic Saccharibacteria kolonier har aldri blitt observert, så bare vertsorganismen observeres vokser på disse platene. Mer enn én kolonitype indikerer vanligvis forurensning. Hvis forurensning oppstår, bør kulturen filtreres på nytt for å fjerne de uønskede forurensningene og re-inokulert på fersk vert.</li>
	<li>Noen ganger oppstår en dobbel infeksjon, hvor to Saccharibacteria-arter infiserer samme vert. For å skille Saccharibacteria-arten, resuspend individuelle kolonier i 20 μL sterile PBS og bruk 1 μL suspensjon i en PCR-reaksjon for å oppdage kolonier med Saccharibacteria infeksjoner.</li>
	<li>Overfør suspensjonene som ga et positivt resultat til vekstmedium for å starte en binær kultur. Suksessraten vil avhenge av titeret til hver Saccharibacteria-art i kulturen. Det kan være nødvendig å screene mer enn 50 kolonier for å finne en infisert for forplantning.</li>
</ol>8. Lagring av kulturer
<ol><li>Vokse en binær kultur med tilstrekkelig volum (10-50 ml) over natten.</li>
	<li>Pelletsceller ved sentrifugering (4000 x g i 10 min). MERK: Høyhastighets sentrifugering er ikke nødvendig her, da Saccharibacteria-celler vil bli festet til de større, tyngre cellene til verten og vil pellets med dem.</li>
	<li>Resuspend celler i kryoprektant. Vekstmedier supplert med enten 5% DMSO eller 20% glyserol er vanligvis tilstrekkelig. Forsikre deg om at vertsorganismen er kompatibel med kryotopektantmedier (f.eks. vekst av A. propionica hemmes av glyserol og frosne lagre kan ikke gjenopplive). Test levedyktigheten til en uinfektert vertskultur med kryopreotektant for å sikre at lagrene kan overleve frysing.</li>
	<li>Resuspendcellepellet i samme kulturvolum (10-50 ml). Aliquot 0,5 ml i merkede kryobier. Frys cellekulturer ved -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+gen.+nov.,+sp.+nov.,+a+human+intestinal+mucin-degrading+bacterium.">Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).</li><li>Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinivorans+hirudinis+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+anaerobic,+mucin-degrading+bacterium+isolated+from+the+digestive+tract+of+the+medicinal+leech+Hirudo+verbana.">Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).</li><li>Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+system+regulates+hemin+acquisition+in+porphyromonas+gingivalis.">A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis.</a> PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).</li><li>Martin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+growth+media+for+oral+bacteria.">New growth media for oral bacteria.</a> Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).</li><li>Vartoukian, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+'unculturable'+oral+bacteria,+facilitated+by+community+culture+and+media+supplementation+with+siderophores.">In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores.</a> Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).</li><li>Strandwitz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-modulating+bacteria+of+the+human+gut+microbiota.">GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota.</a> Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).</li><li>Hug, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+the+tree+of+life.">A new view of the tree of life.</a> Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).</li><li>Castelle, C. J., Banfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+new+microbial+groups+expand+diversity+and+alter+our+understanding+of+the+tree+of+life.">Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life.</a> Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+human-associated+TM7+phylotype+reveals+a+reduced+genome+and+epibiotic+parasitic+lifestyle.">Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).</li><li>Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+candidate+division+TM7,+a+recently+recognized+major+lineage+of+the+domain+Bacteria+with+no+known+pure-culture+representatives.">Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).</li><li>Brinig, M., Lepp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+bacteria+of+division+TM7+in+human+subgingival+plaque+and+their+association+with+disease.">Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+obtained+by+culturing+saccharibacteria+with+their+bacterial+hosts.">Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts.</a> Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+physiological+characterization+of+the+epibiotic+interaction+between+TM7x+and+its+basibiont+actinomyces.">Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces.</a> Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).</li><li>Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+plaque+development+on+defined+streptococcal+surfaces.">Dental plaque development on defined streptococcal surfaces.</a> Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).</li><li>Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+candidate+phyla+radiation+Saccharibacteria+(TM7)+bacteria+in+coculture+with+bacterial+hosts.">Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts.</a> Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).</li><li>Cross, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Vår metode for filtrering av plakk og påføring av den på rene kulturer av vertsorganismer er i stor grad basert på tidligere observasjoner om den første kultiverte Saccharibacteria, 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x11,14,15. Gitt den lille cellestørrelsen, utledet vi at de kunne skilles fra tannplakk ved hjelp av et filter og konsentrert med sentrifugering. For det andre, ettersom disse organismene lever som parasitter, vil det å gi disse cellene rene kulturer av verter tillate dem å gå inn i en symbiose og vokse som binære kulturer.
En fordel med denne metoden er at den ikke krever en berikelseskultur eller selektivt trykk. 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x ble dyrket fra en berikelseskultur ved hjelp av streptomycin som et selektivt middel, som sekvensering hadde antydet ville være effektiv til å berike for Saccharibacteria. Fortuitously, verten for 'Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, er kjent for å være motstandsdyktig mot streptomycin16. Bruk av antibiotika som selektivt middel kan også forhindre at vertsorganismen vokser, noe som igjen vil utelukke veksten av Saccharibacteria.
Et større problem med å bruke berikelseskulturer er at raskt voksende organismer raskt vil fortrenge organismer av interesse. I munnhulen, for eksempel, kan Streptococcus-arter vokse raskt, og hvis sukker er tilstede i vekstmediet, produsere nok syre til å surgjøre mediet, og videre velge mot organismer av interesse. Ved å unngå en berikelseskultur og selektiv antibiotika, gir vår metode en generell tilnærming som kan brukes på et bredere spekter av Saccharibacteria og potensielle verter uten komplikasjoner av disse andre metodene.
Det er noen hindringer for metoden som presenteres her. For det første antar denne metoden at Saccharibacteria lever i en binær kultur. Vi har ikke testet kombinasjoner av trinære eller ternære kulturer for å måle effektiviteten, men det er sannsynligvis Saccharibacteria som krever vekstfaktorer som en enkelt vertsorganisme ikke kan levere. Å teste de enorme kombinasjonene av orale bakterier som kan støtte veksten av Saccharibacteria ville være en skremmende oppgave. For det andre antar metoden at alle Saccharibacteria er små nok til å passere gjennom et 0,2 μm filter. Det kan være at andre Saccharibacteria er større enn antatt, og filteret velger mot disse organismene. Et filter med større porestørrelse kan brukes, men dette risikerer å tillate mer uønskede orale bakterier i den infiserte samkulturen. Til slutt er det svært vanskelig å finne vertsarter utenfor de som allerede er publisert. Så langt er de eneste vellykkede vertene arter fra slekten Actinomyces, Schaalia, Arachnia og Cellulosimicrobium, alle medlemmer av phylum Actinobacteria15,17,18. Imidlertid støtter disse vertene bare veksten av spesifikk Saccharibacteria. For å dyrke flere arter av Saccharibacteria, må mange flere verter utforskes.
Vi håper metoden som presenteres her vil hjelpe fremtidig forskning av Saccharibacteria og andre HLR-organismer. Metagenomisk sekvensering antyder at disse organismene også har små genomer og mistenkes å være symbionter eller stole på det lokale mikrobielle samfunnet for å levere metabolitter og andre faktorer som er kritiske for deres overlevelse19. En lignende filtreringsstrategi kan brukes til å isolere disse organismene, forutsatt at de er små nok og at vertsorganismene deres kan dyrkes. Metodene beskrevet her er et første skritt for å bringe de kraftige verktøyene i laboratoriekulturen til denne store og mangfoldige gruppen av bakterier.

Kultivering av nye arter av bakterier og å bringe dem inn i laboratoriet gjør det mulig for kraftige eksperimenter å bedre forstå deres fysiologi og bredere interaksjoner i deres mikrobielle samfunn. Selv om det finnes kulturfrie metoder for å forhøre disse spørsmålene (f.eks. "meta-omics"), gjør de komplekse interaksjonene mellom ulike mikrobielle populasjoner det vanskelig å erte fra hverandre enkeltvariabler og nå meningsfulle konklusjoner. Mens dyrking av bakterier har mange fordeler, er det mange potensielle barrierer for å isolere en bakterie og vokse den i ren kultur. Potensielle spesifikke vekstkrav inkluderer pH, oksygenspenning, vitaminer, vekstfaktorer, signalmolekyler eller til og med direkte cellekontakt for å fremkalle vekst1. Det antas imidlertid at spesifikke auxotrophies er den primære avskrekkende for å dyrke nye arter av bakterier. Standard medieformuleringer mangler mange næringsstoffer som kreves av ukulturerte bakterier, for eksempel spesifikke vitaminer eller karbonkilder. Disse manglende molekylene kan være nøkkelen til fysiologien til de ukulturerte bakteriene og leveres vanligvis av enten en annen organisme i det mikrobielle samfunnet eller en vertsorganisme. For eksempel kan komplekse karbohydrater som mucins leveres av dyreverter. Å legge disse til media har tillatt dyrking av flere bakterier fra dyremot, inkludert Akkermansia muciniphila og Mucinivorans hirudinis2,3,4. Mange patogene bakterier har utviklet evnen til å bruke jern bundet til hemin i dyreceller, inkludert det orale patogenet Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan veksten av Porphyromonas og andre organismer stimuleres ved tilsetning av hemin6.
Nylig har mange gjennombrudd i culturing nye isolasjoner av bakterier kommet gjennom co-culturing, ved hjelp av en "feeder" organisme for å gi spesifikke faktorer til ukulturerte bakterier som er nødvendige for deres vekst. En elegant studie av Vartoukian og kolleger viste at siderophores, jernbindende molekyler produsert av bakterier, stimulerte veksten av flere nye orale isolasjoner. Pyoverdines, en type siderophore produsert av pseudomonad arter, ble vist å lette veksten av en roman Prevotella arter7betydelig . I samme studie ble den første orale isolasjonen for phylum Chloroflexi dyrket, og brukte også F. nucleatum som hjelper for å gi noen ennå ukjent forbindelse7. Mer nylig ble en bakterie fra slekten Ruminococcaceae isolert ved hjelp av Bacteroides fragilis som hjelperorganisme8. Det ble senere vist at gamma aminosmørsyre (GABA), en hemmende nevrotransmitter, var nødvendig for vekst på laboratoriemedier. Bruk av materorganismer har vist seg å være en nøkkelstrategi for å etterligne spesifikke mikromiljø der ukulturerte bakterier vokser, og er mer effektive enn kontinuerlig å reformulere vekstmedier med forskjellige tilsetningsstoffer i varierende konsentrasjoner.
En av de største gruppene av ukulturerte bakterier er i "Candidate Phyla Radiation" (HLR), en monofyletisk gruppe av flere kandidatbakterielle phyla9,10. I skrivende stund har bare medlemmer av Saccharibacteria-fylumen i HLR blitt dyrket i laboratoriet. Den første isolerende, 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x, ble isolert ved hjelp av antibiotika streptomycin, som hadde blitt spådd å berike for den ukulturerte TM711,12. En viktig oppdagelse av dette arbeidet var at den nye isolasjonen vokste som en parasitt som vokste i direkte kontakt med en bakteriell vert, Schaalia odontolytica, og mikroskopi viste at disse parasittene var ultrasmallbakterier.
Ved hjelp av disse ledetrådene utviklet vi en metode for raskt å etablere binære kokulturer av Saccharibacteria med partnerne sine ved å filtrere tannplakk og andre orale prøver gjennom et 0,2 μm filter, samle celler i filtratet ved sentrifugering og bruke dem til å infisere kulturer av kandidatvertbakterier. Denne metoden har fordelen av å unngå berikelseskulturer, som kan overveldes med raskt voksende organismer. Det unngår også bruk av antibiotika, noe som kan stoppe veksten av enten de målrettede Saccharibacteria-artene eller deres verter. Ved hjelp av metoden som er demonstrert her, har vi vellykket dyrket 32 isolasjoner fra Saccharibacteria-phylum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

Mange bakteriearter kan ikke dyrkes i laboratoriet ved hjelp av standardmetoder, noe som utgjør en betydelig barriere for å studere det meste av mikrobielt mangfold på jorden. Nye tilnærminger kreves for å dyrke disse ukulturerte bakteriene slik at undersøkere effektivt kan studere sin fysiologi og livsstil ved hjelp av de kraftige verktøyene som er tilgjengelige i laboratoriet. Candidate Phyla Radiation (HLR) er en av de største gruppene av ukulturerte bakterier, som består av ~ 15% av det levende mangfoldet på jorden. Den første isolasjonen av denne gruppen var medlem av Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' stamme TM7x. TM7x er en uvanlig liten bakterie som lever som symbiont i direkte kontakt med en bakteriell vert, Schaalia odontolytica, stamme XH001. Ved å dra nytte av den uvanlig små cellestørrelsen og livsstilen som en symbiotisk organisme, utviklet vi en protokoll for raskt å dyrke Saccharibacteria fra tannplakk. Denne protokollen vil vise hvordan man filtrerer en suspensjon av tannplakk gjennom et 0,2 μm filter, og konsentrerer deretter de samlede Saccharibacteria-cellene og infiserer en kultur av vertsorganismer. Den resulterende kokulturen kan passeres da enhver normal bakteriekultur og infeksjon bekreftes av PCR. Den resulterende binære kulturen kan opprettholdes i laboratoriet og brukes til fremtidige eksperimenter. Selv om forurensning er en mulighet, kan den binære kulturen renses ved enten ytterligere filtrering og reinfeksjon av vert, eller ved å plating binær kultur og screening for infiserte kolonier. Vi håper denne protokollen kan utvides til andre utvalgstyper og miljøer, noe som fører til dyrking av mange flere arter i HLR.

PCR for påvisning av Saccharibacteria kan virke negativ (dvs. ikke noe produkt sett) i innledende infeksjonskulturer på grunn av et lavt antall Saccharibacteria symbionter. Etter noen få passasjer skal det imidlertid oppstå et sterkt PCR-produkt som viser at det har oppstått en stabil infeksjon (Figur 1A). Omvendt vil noen infeksjoner i utgangspunktet virke positive av PCR, men reduseres til uoppdagelig etter 1-4 passasjer (ikke vist). Dette indikerer at en stor mengde Saccharibacteria-celler var til stede i det første filtratet, men ble fortynnet ut ved passasje og ingen var i stand til å gå inn i en stabil symbiose med vertskulturen. Testing av flere vertsarter med samme Saccharibacteria filtrat fra munnhulen vil vanligvis ha en lav suksessrate (Figur 1B) da symbiont-vert interaksjonen er veldig spesifikk. En forsker kan også teste den samme verten med filtrater fra flere forskjellige. Hvis en god vertsorganisme (som Arachnia propionica eller Schaalia odontolytica) brukes, kan en suksessrate på 50% forventes.
Testing av PCR er avgjørende. Erfarne forskere har forsøkt å bekrefte infeksjon ved mikroskopi, bare for å rapportere falske positiver. Saccharibacteria-cellene er små og vanskelige å skille mellom vesikler eller uregelmessige cellekonvoluttbulger. Et PCR-signal stabilt gjennom flere passasjer er nøkkelen til å bekrefte en vellykket infeksjon.
Etter hvert som de infiserte kulturene vokser, bør normal uklar vekst vises. Når symbiosen etablerer seg, vil infiserte kulturer virke mindre uklare enn kulturer av uinfiserte vertsorganismer (Figur 2A). I noen tilfeller kan infiserte kulturer synes å slutte å vokse helt og ikke bli uklart i det hele tatt. Dette kan skyldes en infeksjon der Saccharibacteria-cellene overvelder vertsorganismen. Å legge til "frisk" (uinfektert) vert for disse kulturene bør gi en tilstrekkelig befolkning av vert for å støtte den fortsatte veksten av Saccharibacteria-parasittene.
Overvekst, eller overdreven turbid kulturer, kan indikere forurensning av enten en laboratoriekontaminant eller en annen liten oral bakterie som var i stand til å passere gjennom 0,2 μm-filteret. Campylobacter og Capnocytophaga spp. er typiske orale forurensninger av disse forsøkene. Dette kan bekreftes ved å plating kulturen og leter etter kolonier som er atypiske av vertsorganismen etterfulgt av 16S rRNA sekvensering. Hvis forurensning ses, er filtrering av disse kulturene gjennom et 0,2 μm filter vanligvis tilstrekkelig til å fjerne forurensningene. Saccharibacteria celler i filtratet kan konsentreres ved sentrifugering og brukes til å infisere en ren vertskultur.
En annen måte å rense en forurenset kultur på er ved å plukke infiserte kolonier fra å plating en infisert kultur. Kolonier av infiserte verter kan noen ganger identifiseres med uregelmessig koloniform sammenlignet med uinfiserte kolonier (Figur 2B-D). Disse uregelmessige koloniene er avhengige av titeren av Saccharibacteria i binærkulturen, og en mindre andel kolonier vil virke uregelmessige hvis titeret er lavt. Dette kan gjøre det enkelt å identifisere infiserte kolonier, som kan plukkes og brukes til å starte en ren binær kultur. Hvis ingen uregelmessige kolonier ses på plating fra en Saccharibacteria infisert kultur, er det mulig at symbionten er på et lavt titer eller ikke forårsaker uregelmessig formede kolonier. I et slikt tilfelle kan PCR-screeningkolonier med normalt utseende vise infeksjon av Saccharibacteria, men med lav hastighet (2-10% av alle kolonier).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Figur 1: Typiske PCR-resultater av Saccharibacteria-infeksjoner av vertskulturer. (A) Et PCR-produkt som indikerer tilstedeværelse av Saccharibacteria, kan ikke vises med den første infeksjonen, men kan vises og bli sterkere i etterfølgende passasjer når kokulturen etablerer seg. (B) De fleste verter som er smittet med Saccharibacteria-beriket filtrat, vil ikke støtte veksten på grunn av symbiosens spesifisitet. I dette eksemplet ble bare A. propionica vellykket infisert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Figur 2: Vekstegenskapene tilSaccharibacteria infiserte kulturer. (A) Vekstkurver av infiserte og uinfiserte kulturer av A. propionica som viser infisert kultur, vil ikke vokse til samme tetthet som den uinfiserte kontrollen og virke mindre uklar. (B-D) Plating av kokulturer kan produsere uregelmessige kolonier, forårsaket av Saccharibateria infeksjoner. Uregelmessige kolonier vil avta i forhold til titeret av Saccharibacteria i kokulturen. (B) Vert med et høyt nivå av Saccharibacteria. (C) 10 ganger fortynnet Saccharibacteria (D) Uinfektert vertskultur. Hvite piler indikerer eksempler på uregelmessige kolonier. Skala bar = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Vi demonstrerer en metode for å isolere vanskelig å vokse medlemmer av den nye bakterielle phylum, Saccharibacteria, ved å filtrere tannplakk og co-culturing med vertsbakterier.

Etablering av stabile binære kulturer av symbiotisk saccharibacteria fra munnhulen

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Saccharibacteria er obligatoriske parasitter som krever samkultur med passende vertsbakterier. Som menneskelig oral saccharibacteria kan lett isoleres for de fleste individer ved hjelp av kjente vertsbakterielle arter. Denne protokollen vil tillate enhver etterforsker eller laboratorium å isolere sine egne stammer i binær samkultur.Denne teknikken bruker enkle enheter og utstyr som finnes i de fleste mikrobiologiske laboratorier og har blitt brukt til å dyrke over 30 isolasjoner som representerer seks arter av saccharibacteria. Denne protokollen kan være nyttig for isolering av andre kandidat-fulgte strålingsarter, samt saccharibacteria fra forskjellige miljøer og andre pattedyr hvis passende actinobakterielle verter kan identifiseres og isoleres. Andrew Collins, en tidligere postdoktor i laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren.Til å begynne med, start kulturer av vertsbakterier som arachnia propionica, med nok tid til at de kan vokse til tidlig stasjonær fase. For å initiere kulturen, inokulere to til fem milliliter tryptisk soyabuljong som inneholder 0,1% gjærekstrakt med arachnia propionica, og inkubere den ved 37 grader Celsius i 24 timer. Monter deretter filterholdere med spor etset 0,2 mikrometer filtermembraner.Pakk dem inn i folie og steriliser ved autoklavering, sammen med sentrifugerør og hetteenheter. Steriliser ekstra forsyninger ved utilsiktet kontakt med ikke-sterile overflater. Samle tannplakk ved å skrape langs tannkjøttlinjen, ved hjelp av et sterilt papirpunkt, grasiøs curette eller en steril tannpirker eller pipettespiss, og overfør den til en passende buffer som MRD eller PBS.Hold prøven på is til den er klar til å fortsette videre. Resuspender tannplakket kraftig ved hjelp av en kombinasjon av virvel- og pipettering med en liten pipettespiss, og tilsett deretter den resuspenderte plakkprøven til et rør som inneholder ni milliliter MRD-buffer. Pakk forsiktig ut en steril filterenhet ved hjelp av aseptisk teknikk.Trekk ut en kvart omdreining, og stram filterholderen igjen for å sikre at gjengene er ordentlig festet, og apparatet er ordentlig lukket. Vask membranen ved å sende 10 milliliter MRD-buffer gjennom apparatet ved hjelp av en sprøyte. For å påføre prøven på det vaskede filteret, fjern stempelet fra en sprøyte og fest det til filterapparatet.Legg et sterilt sentrifugerør under filterapparatet for å fange filtratet, hell deretter den dispergerte tannprøven i sprøyten og last den på filteret. Påfør deretter lett trykk på stempelet for å skyve prøven gjennom filteret. Vask membranen med ytterligere 10 milliliter MRD-buffer, og samle gjennom strømmen i samme rør som den filtrerte prøven.Deretter hette røret aseptisk, og hold på is. Lag et orienteringsmerke på røret og hetten for å identifisere plasseringen av cellepellet etter sentrifugering. Plasser røret i en høyhastighets sentrifuge med merket på oversiden og sentrifuger prøvene ved 60.000 G i en time ved fire grader Celsius.Etter sentrifugering, hell forsiktig ut supernatanten, og hold pellet på oversiden av røret. Deretter resuspenderer pellet i en til to milliliter MRD-buffer ved kraftig virveling. Forbered kulturrør ved å aliquoting to milliliter av passende vekstmedier inn i rørene.Tilsett deretter 200 mikroliter av nattkultur av vertsorganismer og 100 til 200 mikroliter resuspendert filtrert prøve til hvert rør. Inkuber de kombinerte prøvene under forhold som passer for vertsorganismen. Før cellene hver annen til tre dager ved å overføre 200 mikroliter av binærkulturen til to milliliter frisk vekstmedium i et nytt rør.Hvis de passasjede kulturene ikke viser noen vekst ved 200 mikroliter av uinfisert vertskultur, når du passerer cellene, returner inokulerte rør til inkubatoren. Aliquote 24 mikroliter av PCR master blandes inn i et 0,2 milliliter PCR-rør. På en mikroliter av saccharibacteria infisert kultur, plasser røret i en termosykator.Angi PCR-programmet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Last inn og kjør PCR-produktene på en 1%Agros gel. Et bånd på ca 600 baser vil bekrefte tilstedeværelsen av saccharibacteria.For å bekrefte renheten av positive kulturer, utfør en 10 ganger seriell fortynning av saccharibacteria-kokulturen i en steril buffer, og spred 100 mikroliter på en agarplate. Inkuber kulturen under passende vekstforhold og observere for forurensende organismer. Et bånd på ca 600 baser vil bekrefte tilstedeværelsen av saccharibacteria.PCR-deteksjon kan virke negativt i innledende infeksjonskulturer på grunn av et lavt antall saccharibacteria symbionter. Men etter noen få passasjer skal det oppstå et sterkt PCR-produkt, noe som indikerer at en stabil infeksjon har oppstått. Testing av flere vertsarter med samme saccharibacteria filtrat vil vanligvis ha en lav suksessrate.Siden den symbionte vertsinteraksjonen er veldig spesifikk. Etter hvert som de infiserte kulturene vokser, bør normal uklar vekst vises. Når symbiosen etablerer seg, vil infiserte kulturer virke mindre uklare enn kulturer av uinfiserte vertsorganismer.En forurenset kultur kan renses ved å plukke infiserte kolonier etter plating. Infiserte kolonier kan noen ganger identifiseres med en uregelmessig koloniform sammenlignet med uinfiserte kolonier. Andelen av en vanlig koloni avhenger av titeret av saccharibacteria i binærkulturen.Hvis titeren er lav, vil færre kolonier virke uregelmessige, noe som gjør det enkelt å velge de infiserte koloniene og starte en ren binær kultur. Kulturer kan ikke virke positive for flere passasjer. Så noen pasienter vil være nødvendig.Det er også nødvendig å regelmessig sjekke for forurensning av binære kulturer, da dette kan destabilisere kulturen og føre til saccharibacterias død. Den binære kulturen kan brukes til alle slags laboratorieforsøk. DNA og RNA kan ekstraheres for henholdsvis genomsekvensering og transkripsjonsanalyse.Patogenisitet kan også undersøkes ved hjelp av dyremodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...