Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
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Los autores desean agradecer a Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He y Batbileg Bor por sus útiles discusiones y por proporcionar cepas bacterianas. Agradecemos a Susan Yost y Jessica Woods por la asistencia técnica microbiana. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) y T32 DE007327 (AJC). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Al desarrollar este protocolo, se buscó y aprobó la aprobación del IRB (#14-10) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos.
1. Preparación
<ol><li>Cuando trabaje con sujetos humanos, obtenga la aprobación necesaria del IRB y el consentimiento informado.</li>
	<li>Comience los cultivos de bacterias huésped con tiempo suficiente para crecer a la fase estacionaria temprana. Por ejemplo, inocular 2-5 mL de caldo de soja tríptico con extracto de levadura al 0,1% añadido (TSBY) con Arachnia propionica e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
	<li>Ensamble portafiltros con una membrana de filtro de 0,2 μm grabada en orugas. Envuelva el conjunto en papel de aluminio y esterilice con autoclave.</li>
	<li>Esterifugar tubos de centrífuga y conjuntos de tapas.</li>
</ol>2. Obtener una muestra de bacterias orales
NOTA: Mientras que muchas muestras orales contienen Saccharibacteria (por ejemplo, saliva, hisopos de amígdalas, raspados de lengua) la placa dental es rutinariamente la más exitosa.
<ol><li>Tome un raspado de placa usando un punto de papel estéril, curette Gracey, o, si se automuestreo, use un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta. Transfiera la placa a un tampón adecuado, como diluyente de recuperación máxima (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% peptona) o PBS. Si no se procesa inmediatamente, mantenga la muestra en hielo hasta que esté lista para continuar.</li>
	<li>Resuspend vigorosamente la placa dental en el almacenador intermediario de MRD usando una combinación de vortexing y de pipeteo con una pequeña punta de la pipeta.</li>
	<li>Agregue la muestra resuspended de la placa a 9 mL adicionales del almacenador intermediario de MRD.</li>
</ol>3. Preparar el filtrado a partir de una muestra oral
<ol><li>Usando la técnica aséptica, desenvuelva un conjunto de filtro estéril. Desenrosque un cuarto de vuelta y vuelva a apretar el soporte del filtro para asegurarse de que las roscas estén correctamente enganchadas y que el aparato esté cerrado correctamente. Usando una jeringa, lave la membrana pasando 10 ml de tampón MRD a través del aparato. El montaje incorrecto se revela en este paso por el fluido que se escapa del soporte del filtro. Si se produce una fuga, obtenga otro conjunto de filtro estéril y repita la etapa de lavado.</li>
	<li>Aplique la muestra al filtro lavado. Retire el émbolo de una jeringa y conédtelo al aparato filtrante. Vierta la muestra dental dispersa, ahora en 10 ml de tampón MRD, en una jeringa y cárguela en el filtro.</li>
	<li>Coloque un tubo de centrífuga estéril debajo del aparato de filtro para atrapar el filtrado, luego aplique presión de luz al émbolo para empujar la muestra a través del filtro.</li>
	<li>Repita el procedimiento con otros 10 mL de tampón MRD para lavar la membrana, recogiendo el flujo en el mismo tubo que la muestra filtrada. Asépticamente tapar el tubo.</li>
</ol>4. Concentrar las células de Saccharibacteria por centrifugación
<ol><li>Haga una marca de orientación en el tubo y la tapa y colóque el tubo en una centrífuga de alta velocidad con la marca en la parte superior. El pellet formado a partir de la centrifugación suele ser invisible. El marcado ayudará a determinar dónde se encuentra el pellet de células de Saccharibacteria cuando se realiza la centrifugación y se retira el tubo de la centrífuga.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 60.000 x g durante 1 h a 4 °C. NOTA: Esta fuerza y tiempo es suficiente para peletizar todas las células de Saccharibacteria. Sin embargo, las células de Saccharibacteria se pueden peletizar por lo menos parcialmente por centrifugación por tan poco como 20 minutos en 20.000 x g.</li>
	<li>Retire cuidadosamente los tubos de la centrífuga. Vierta el líquido del tubo, manteniendo el pellet en la parte superior del tubo.</li>
	<li>Resuspend la pelotilla generalmente invisible en 1-2 mL del almacenador intermediario de MRD por vortexing vigoroso.</li>
</ol>5. Infecte los cultivos del huésped con filtrado enriquecido con sacaribacterias
<ol><li>Prepare tubos de cultivo alícuotando 2 mL de medios de crecimiento apropiados (por ejemplo, TSBY, BHI, etc.) en tubos.</li>
	<li>Añadir 200 μL de cultivo nocturno de organismos huéspedes a cada tubo. Agregue 100-200 μL de muestra resuspended, filtrada a cada tubo.</li>
	<li>Incubar muestras combinadas según corresponda para el organismo huésped (por ejemplo, 37 °C, en una atmósfera aeróbica para A. propionica).</li>
	<li>Pase las células cada dos o tres días transfiriendo 200 μL de cultivo binario a 2 mL de medio de crecimiento fresco en un tubo nuevo. Si parece que las culturas pasajeras no muestran crecimiento (es decir, la turbidez / densidad óptica de la cultura no aumenta después del paso a medios frescos) las Saccharibacteria podrían ser abrumadoras o matar a todo el organismo huésped. Para remediar esto, agregue 200 μL de cultivo de huésped no infectado al pasar las células. Repetir durante al menos 5 pasajes.</li>
</ol>6. Confirmar la infección por PCR
<ol><li>Después de 5 pasajes, confirme la infección con PCR. Cinco pasajes asegurarán que cualquier célula de Saccharibacteria no creciente se haya agotado más allá del límite de detección utilizando 25 ciclos de PCR.</li>
	<li>Prepare un mastermix pcr. Una receta sugerida que se utiliza es la siguiente, para cada tubo necesario, preparar 12,5 μL 2x tampón de PCR, 0,75 μL 10 μM Imprimación directa (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Imprimación inversa (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 y 9 μL de agua. Mezclar por vórtice.</li>
	<li>Alícuota 24 μL de mastermix en un tubo de PCR de 0,2 mL. Añadir 1 μL de cultivo infectado con Sacaribacterias a la reacción de PCR. Coloque el tubo en un termociclador y realice el siguiente protocolo: Desnaturalización inicial 95 °C durante 5 min, 25 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s, elongación final a 72 °C durante 2 min, luego retención final a 4 °C.</li>
	<li>Cargue y ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Una banda de ~ 600 bases indicará la presencia de Saccharibacteria.</li>
</ol>7. Compruebe la pureza y elimine los organismos contaminantes
<ol><li>Confirmar la pureza de los cultivos positivos mediante el revestimiento del cocultivo de Saccharibacterias en agar nutrientes suficientes para el crecimiento del organismo huésped. Realizar una dilución en serie de 10 veces del cultivo en tampón estéril (por ejemplo, MRD o PBS) y esparcir 100 μL en una placa de agar. Realizar diluciones tales que habrá aproximadamente 20-200 colonias creciendo en la placa de agar.</li>
	<li>Incubar el cultivo en condiciones de crecimiento adecuadas y observar si hay organismos contaminantes. NOTA: Las colonias de saccharibacterias haxénicas nunca se han observado, por lo que solo se observa el organismo huésped creciendo en estas placas. Más de un tipo de colonia generalmente indica contaminación. En caso de que se produzca contaminación, el cultivo debe volver a filtrarse para eliminar los contaminantes no deseados y volver a inocularse en el huésped fresco.</li>
	<li>Ocasionalmente se produce una doble infección, donde dos especies de Saccharibacteria infectan al mismo huésped. Para separar las especies de Saccharibacteria, resuspend colonias individuales en 20 μL de PBS estéril y utilizar 1 μL de suspensión en una reacción de PCR para detectar colonias con infecciones por Saccharibacteria.</li>
	<li>Transferir las suspensiones que dieron un resultado positivo al medio de crecimiento para iniciar una cultura binaria. La tasa de éxito dependerá del título de cada especie de Saccharibacteria en el cultivo. Puede ser necesario examinar más de 50 colonias para encontrar una infectada para su propagación.</li>
</ol>8. Almacenamiento de cultivos
<ol><li>Cultivar un cultivo binario de volumen suficiente (10-50 mL) durante la noche.</li>
	<li>Células pellet por centrifugación (4.000 x g durante 10 min). NOTA: La centrifugación de alta velocidad no es necesaria aquí, ya que las células de Saccharibacteria se unirán a las células más grandes y pesadas del huésped y se peletizarán con ellas.</li>
	<li>Células resuspend en cryoprotectant. Los medios de crecimiento complementados con DMSO del 5% o el glicerol del 20% son generalmente suficientes. Asegúrese de que el organismo huésped es compatible con medios crioprotectores (por ejemplo, el crecimiento de A. propionica es inhibido por el glicerol y las existencias congeladas pueden no revivir). Probar la viabilidad de un cultivo huésped no infectado con crioprotector para garantizar que las poblaciones puedan sobrevivir a la congelación.</li>
	<li>Pellet de células resuspender en el mismo volumen de cultivo (10-50 mL). Alícuota 0,5 mL en crioviales marcados. Congelar cultivos celulares a -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+gen.+nov.,+sp.+nov.,+a+human+intestinal+mucin-degrading+bacterium.">Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).</li><li>Nelson, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+candidate+division+TM7,+a+recently+recognized+major+lineage+of+the+domain+Bacteria+with+no+known+pure-culture+representatives.">Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).</li><li>Brinig, M., Lepp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+bacteria+of+division+TM7+in+human+subgingival+plaque+and+their+association+with+disease.">Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+obtained+by+culturing+saccharibacteria+with+their+bacterial+hosts.">Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts.</a> Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+physiological+characterization+of+the+epibiotic+interaction+between+TM7x+and+its+basibiont+actinomyces.">Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces.</a> Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).</li><li>Skopek, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro método de filtrar la placa y aplicarla a cultivos puros de organismos huéspedes se basa en gran medida en observaciones anteriores sobre las primeras Saccharibacteria cultivadas, la cepa TM7x11,14,15de Nanosynbacter lyticus. Dado el pequeño tamaño de la célula, deducimos que podrían ser separados de la placa dental usando un filtro y concentrados con la centrifugación. En segundo lugar, como estos organismos viven como parásitos, proporcionar a estas células cultivos puros de huéspedes les permitiría entrar en una simbiosis y crecer como cultivos binarios.
Una ventaja de este método es que no requiere un cultivo de enriquecimiento o presión selectiva. La cepa TM7xde 'Nanosynbacter lyticus' se cultuó a partir de un cultivo de enriquecimiento utilizando estreptomicina como agente selectivo, cuya secuenciación había sugerido que sería eficaz para enriquecer para Saccharibacteria. Fortuitamente, el huésped de'Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, se sabe que es resistente a la estreptomicina16. El uso de antibióticos como agente selectivo también podría evitar que el organismo huésped crezca, lo que a su vez impediría el crecimiento de Saccharibacteria.
Un problema más grande del uso de cultivos de enriquecimiento es que los organismos de rápido crecimiento desplazarán rápidamente a los organismos de interés. En la cavidad oral, por ejemplo, las especies de Streptococcus pueden crecer rápidamente y, si el azúcar está presente en el medio de crecimiento, producir suficiente ácido para acidificar el medio, seleccionando aún más contra los organismos de interés. Al evitar un cultivo de enriquecimiento y antibióticos selectivos, nuestro método proporciona un enfoque general que podría aplicarse a una gama más amplia de saccharibacterias y huéspedes potenciales sin las complicaciones de estos otros métodos.
Hay algunos obstáculos para el método presentado aquí. En primer lugar, este método asume que saccharibacterias viven en un cultivo binario. No hemos probado combinaciones de cultivos triarios o ternarios para medir su eficacia, pero es probable que haya Sacaribacterias que requieran factores de crecimiento que un solo organismo huésped no puede suministrar. Probar las vastas combinaciones de bacterias orales que podrían apoyar el crecimiento de saccharibacterias sería una tarea desalentadora. En segundo lugar, el método asume que todas las Saccharibacteria son lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de un filtro de 0,2 μm. Podría ser que otras Saccharibacteria son más grandes de lo que se cree y el filtro está seleccionando contra estos organismos. Se podría utilizar un filtro con un tamaño de poro más grande, pero esto corre el riesgo de permitir que más bacterias orales no deseadas entren en el co-cultivo infectado. Por último, es muy difícil encontrar especies huésped fuera de las que ya se han publicado. Hasta el momento, los únicos huéspedes exitosos son especies de los géneros Actinomyces, Schaalia, Arachnia y Cellulosimicrobium,todos miembros del filo Actinobacteria15,17,18. Sin embargo, estos huéspedes sólo apoyan el crecimiento de saccharibacterias específicas. Para cultivar más especies de Saccharibacteria, se deben explorar muchos más huéspedes.
Esperamos que el método presentado aquí ayudará a la investigación futura de las sacaribacterias y otros organismos de RCP. La secuenciación metagenómica sugiere que estos organismos también tienen genomas pequeños y se sospecha que son simbiontes o dependen de la comunidad microbiana local para suministrar metabolitos y otros factores críticos para su supervivencia19. Se podría utilizar una estrategia de filtrado similar para aislar estos organismos, siempre que sean lo suficientemente pequeños y que sus organismos huéspedes puedan ser cultivados. Los métodos descritos aquí son un primer paso para llevar las poderosas herramientas del cultivo de laboratorio a este grupo grande y diverso de bacterias.

Cultivar nuevas especies de bacterias y llevarlas al laboratorio permite experimentos poderosos para comprender mejor su fisiología y las interacciones más amplias dentro de su comunidad microbiana. Si bien existen métodos libres de cultura para interrogar estas preguntas (por ejemplo, "meta-ómicas"), las complejas interacciones de diversas poblaciones microbianas hacen que sea difícil separar variables individuales y llegar a conclusiones significativas. Si bien el cultivo de bacterias tiene muchos beneficios, hay muchas barreras potenciales para aislar una bacteria y cultivarla en cultivo puro. Los posibles requisitos específicos de crecimiento incluyen pH, tensión de oxígeno, vitaminas, factores de crecimiento, moléculas de señalización o incluso contacto celular directo para provocar el crecimiento1. Sin embargo, se cree que las auxotrofias específicas son el principal elemento disuasorio para el cultivo de nuevas especies de bacterias. Las formulaciones de medios estándar carecen de muchos nutrientes requeridos por bacterias no cultivadas, como vitaminas específicas o fuentes de carbono. Estas moléculas faltantes pueden ser clave para la fisiología de las bacterias incultas y generalmente son proporcionadas por otro organismo en la comunidad microbiana o un organismo huésped. Por ejemplo, los carbohidratos complejos como las mucinas pueden ser proporcionados por huéspedes animales. La adición de estos a los medios de comunicación ha permitido el cultivo de varias bacterias de las tripas de los animales, incluyendo Akkermansia muciniphila y Mucinivorans hirudinis2,3,4. Muchas bacterias patógenas han desarrollado la capacidad de utilizar hierro unido a la hemina en células animales, incluyendo el patógeno oral Porphyromonas gingivalis5. En el laboratorio, el crecimiento de Porphyromonas y otros organismos, puede ser estimulado por la adición de hemin6.
Recientemente, muchos avances en el cultivo de nuevos aislados de bacterias han llegado a través del co-cultivo, utilizando un organismo "alimentador" para proporcionar factores específicos a las bacterias no cultivadas necesarias para su crecimiento. Un estudio elegante de Vartoukian y de sus colegas mostró que los siderophores, moléculas obligatorias del hierro producidas por las bacterias, estimularon el crecimiento de varios aislantes orales nuevos. Se demostró que las pirodinas, un tipo de sideróforo producido por especies pseudomonadas, facilitan significativamente el crecimiento de una nueva especie de Prevotella 7. En el mismo estudio, se cultivó el primer aislado oral para el filo Chloroflexi, utilizando también F. nucleatum como ayudante para proporcionar algún compuesto aún desconocido7. Más recientemente, una bacteria del género Ruminococcaceae fue aislada usando Bacteroides fragilis como organismo ayudante8. Fue mostrado más adelante que el ácido aminobutírico gamma (GABA), un neurotransmisor inhibitorio, fue requerido para el crecimiento en medios de laboratorio. El uso de organismos alimentadores ha demostrado ser una estrategia clave para imitar microambientes específicos donde crecen bacterias no cultas, siendo más eficiente que reformular continuamente los medios de crecimiento con diferentes aditivos en diferentes concentraciones.
Uno de los grupos más grandes de bacterias no curativas se encuentran en la "Radiación filo candidata" (RCP), un grupo monofilético de varios filos bacterianos candidatos9,10. En el momento de escribir este artículo, sólo los miembros del filo Saccharibacteria dentro de la RCP se han cultivado con éxito en el laboratorio. El primer aislado, la cepa TM7xde 'Nanosynbacter lyticus', se aisló utilizando el antibiótico estreptomicina, que se había predicho que enriquecería para el inculto TM711,12. Un descubrimiento clave de este trabajo fue que el nuevo aislado creció como un parásito que crecía en contacto directo con un huésped bacteriano, Schaalia odontolytica,y la microscopía mostró que estos parásitos eran bacterias ultras pequeñas.
Usando estas pistas, ideamos un método para establecer rápidamente cocultivos binarios de Saccharibacteria con sus socios filtrando la placa dental y otras muestras orales a través de un filtro de 0,2 μm, recogiendo células en el filtrado por centrifugación y usándolas para infectar cultivos de bacterias candidatas del huésped. Este método tiene la ventaja de evitar los cultivos de enriquecimiento, que pueden ser abrumados con organismos de rápido crecimiento. También evita el uso de antibióticos, que podrían detener el crecimiento de las especies de Saccharibacterias objetivo o de sus huéspedes. Usando el método demostrado aquí, hemos cultivado con éxito 32 aislantes del filo de Saccharibacteria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

Muchas especies bacterianas no se pueden cultivar en el laboratorio utilizando métodos estándar, lo que representa una barrera significativa para el estudio de la mayoría de la diversidad microbiana en la tierra. Se requieren nuevos enfoques para cultivar estas bacterias incultas para que los investigadores puedan estudiar eficazmente su fisiología y estilo de vida utilizando las poderosas herramientas disponibles en el laboratorio. La radiación de profilaxis candidata (RCP) es uno de los grupos más grandes de bacterias no cultivadas, que comprende ~ 15% de la diversidad viva en la tierra. El primer aislado de este grupo fue un miembro del filo Saccharibacteria, 'Nanosynbacter lyticus' cepa TM7x. TM7x es una bacteria inusualmente pequeña que vive como un simbionte en contacto directo con un huésped bacteriano, Schaalia odontolytica, cepa XH001. Aprovechando el tamaño de célula inusualmente pequeño y su forma de vida como organismo simbiótico, desarrollamos un protocolo para cultivar rápidamente Saccharibacteria de la placa dental. Este protocolo mostrará cómo filtrar una suspensión de placa dental a través de un filtro de 0,2 μm, luego concentrar las células de Saccharibacteria recolectadas e infectar un cultivo de organismos huéspedes. El cocultivo resultante puede ser aprobado como cualquier cultivo bacteriano normal y la infección se confirma por PCR. El cultivo binario resultante se puede mantener en el laboratorio y utilizar para futuros experimentos. Mientras que la contaminación es una posibilidad, la cultura binaria se puede purificar por la filtración y la reinfección adicionales del anfitrión, o por la galjanoplastia de la cultura binaria y la investigación para las colonias infectadas. Esperamos que este protocolo se pueda ampliar a otros tipos de muestras y ambientes, dando lugar al cultivo de muchas más especies en la RCP.

La PCR para la detección de Saccharibacteria puede aparecer negativa (es decir, ningún producto visto) en las culturas iniciales de la infección debido a un número bajo de simbiontes de Saccharibacteria. Sin embargo, después de algunos pasajes debe aparecer un producto de PCR fuerte que muestre que se ha producido una infección estable (Figura 1A). Por el contrario, algunas infecciones inicialmente aparecerán positivas por PCR, pero disminuirán a indetectables después de 1-4 pasajes (no se muestran). Esto indica que una gran cantidad de células de Saccharibacteria estaban presentes en el filtrado inicial, pero se diluyeron por el paso y ninguno fue capaz de entrar en una simbiosis estable con el cultivo del huésped. El ensayo de varias especies huésped con el mismo filtrado de Saccharibacteria de la cavidad oral suele tener una baja tasa de éxito(Figura 1B)ya que la interacción simbionte-huésped es muy específica. Un investigador también puede probar el mismo huésped con filtrados de varios sujetos diferentes. Si se utiliza un buen organismo huésped (como Arachnia propionica o Schaalia odontolytica),se puede esperar una tasa de éxito del 50%.
Las pruebas por PCR son cruciales. Investigadores experimentados han intentado confirmar la infección por microscopía, solo para reportar falsos positivos. Las células de Saccharibacteria son pequeñas y difíciles de distinguir entre vesículas o protuberancias irregulares de la envoltura celular. Una señal de PCR estable a través de varios pasajes es clave para confirmar una infección exitosa.
A medida que los cultivos infectados crecen, debe aparecer un crecimiento turbio normal. A medida que la simbiosis se establece, los cultivos infectados aparecerán menos turbios que los cultivos de organismos huéspedes no infectados (Figura 2A). En algunos casos, los cultivos infectados pueden parecer que dejan de crecer por completo y no se vuelven turbios en absoluto. Esto puede ser debido a una infección donde las células de Saccharibacteria están abrumando el organismo huésped. La adición de huésped "fresco" (no infectado) a estos cultivos debe proporcionar una población suficiente de huésped para apoyar el crecimiento continuo de los parásitos Saccharibacteria.
El crecimiento excesivo, o cultivos excesivamente turbios, puede indicar contaminación por un contaminante de laboratorio u otra pequeña bacteria oral que pudo pasar a través del filtro de 0,2 μm. Campylobacter y Capnocytophaga spp. Esto se puede confirmar enchapando el cultivo y buscando colonias que sean atípicas del organismo huésped seguidas de la secuenciación del ARNr 16S. Si se observa contaminación, el filtrado de estos cultivos a través de un filtro de 0,2 μm suele ser suficiente para eliminar los contaminantes. Las células de saccharibacterias en el filtrado pueden ser concentradas por centrifugación y utilizadas para rein infectar un cultivo de huésped puro.
Otra forma de purificar un cultivo contaminado es recogiendo colonias infectadas de la galjanoplastia de un cultivo infectado. Las colonias de huéspedes infectados a veces se pueden identificar por la forma irregular de la colonia en comparación con las colonias no infectadas (Figura 2B-D). Estas colonias irregulares dependen del título de Saccharibacteria en el cultivo binario y una menor proporción de colonias aparecerá irregular si el título es bajo. Esto puede facilitar la identificación de colonias infectadas, que pueden ser recogidas y utilizadas para iniciar un cultivo binario puro. Si no se ven colonias irregulares en el revestimiento de un cultivo infectado por Saccharibacteria, es posible que el simbionte esté en un título bajo o no cause colonias de forma irregular. En tal caso, las colonias de cribado por PCR con una apariencia normal pueden mostrar infección por Saccharibacteria, pero a una tasa baja (2-10% de todas las colonias).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Figura 1: Resultados típicos de PCR de infecciones por Saccharibacteria de cultivos hospedantes. (A)Un producto de PCR que indica la presencia de Saccharibacteria puede no aparecer con la infección inicial, pero puede aparecer y fortalecerse en pasajes posteriores a medida que el cocultivo se establece. (B)La mayoría de los huéspedes infectados con filtrado enriquecido con Saccharibacteria no apoyarán su crecimiento debido a la especificidad de la simbiosis. En este ejemplo, sólo A. propionica se infectó con éxito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Figura 2:Características de crecimiento de los cultivos infectados con Saccharibacteria. (A)Las curvas de crecimiento de los cultivos infectados y no infectados de A. propionica que muestran un cultivo infectado no crecerán a la misma densidad que el control no infectado y aparecerán menos turbias. (B -D) El revestimiento de cocultivos puede producir colonias irregulares, causadas por infecciones por saccharibateria. Las colonias irregulares disminuirán en proporción en relación con el título de Saccharibacteria en el cocultivo. (B)Huésped con un alto nivel de Sacaribacterias. (C) 10 veces diluido Saccharibacteria (D) Cultivo de huésped no infectado. Las flechas blancas indican ejemplos de colonias irregulares. Barra de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Se demuestra un método para aislar a los miembros difíciles de crecer del nuevo filo bacteriano, Saccharibacteria, mediante el filtrado de la placa dental y el co-cultivo con bacterias huésped.

Establecimiento De Cultivos Binarios Estables De Saccharibacterias Simbióticas De La Cavidad Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Las sacaribacterias son parásitos obligados que requieren co-cultivo con bacterias huésped apropiadas. Como saccharibacterias orales humanas se pueden aislar fácilmente para la mayoría de los individuos que utilizan especies bacterianas huésped conocidas. Este protocolo permitirá a cualquier investigador o laboratorio aislar sus propias cepas en co-cultivo binario.Esta técnica utiliza dispositivos y equipos simples presentes en la mayoría de los laboratorios microbiológicos y se ha utilizado con éxito para cultivar más de 30 aislados que representan seis especies de sacaribacterias. Este protocolo puede ser útil para el aislamiento de otras especies de radiación candidatas seguidas, así como de sacaribacterias de diferentes ambientes y otros mamíferos si se pueden identificar y aislar huéspedes actinobacterianos apropiados. Demostrando el procedimiento estará Andrew Collins, un ex becario postdoctoral en mi laboratorio.Para comenzar, comience los cultivos de bacterias huésped como la aracnia propionica, con tiempo suficiente para que crezcan hasta la fase estacionaria temprana. Para iniciar el cultivo, inocular de dos a cinco mililitros de caldo de soja tríptico que contiene extracto de levadura al 0,1% con aracnia propionica, e incubarlo a 37 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, ensamble los portafiltros con membranas de filtro de 0,2 micrómetros grabadas en orugas.Envuélvalos en papel de aluminio y esterilice por autoclave, junto con tubos de centrífuga y conjuntos de tapas. Esterilizar suministros adicionales en caso de contacto accidental con superficies no estériles. Recoger la placa dental raspando a lo largo de la línea de las encías, utilizando un punto de papel estéril, curette elegante, o un palillo de dientes estéril o punta de pipeta, y transferirlo a un tampón adecuado como MRD o PBS.Mantenga la muestra en hielo hasta que esté lista para continuar. Resuspend la placa dental vigorosamente usando una combinación de vórtice y pipeteo con una pequeña punta de pipeta, luego agregue la muestra de placa resuspended a un tubo que contiene nueve mililitros de tampón MRD. Desenvuelva cuidadosamente un conjunto de filtro estéril utilizando la técnica aséptica.Desenrosque un cuarto de vuelta y vuelva a apretar el soporte del filtro para asegurarse de que las roscas estén correctamente enganchados y que el aparato esté cerrado correctamente. Lave la membrana pasando 10 mililitros de tampón MRD a través del aparato, usando una jeringa. Para aplicar la muestra al filtro lavado, retire el émbolo de una jeringa y conéctelo al aparato filtrante.Coloque un tubo de centrífuga estéril debajo de ese aparato de filtro para atrapar el filtrado, luego vierta la muestra dental dispersa en la jeringa y cárguela en el filtro. A continuación, aplique presión ligera al émbolo para empujar la muestra a través del filtro. Lave la membrana con otros 10 mililitros de tampón MRD y recoja el flujo en el mismo tubo que la muestra filtrada.A continuación, tapar el tubo asépticamente, y mantener en el hielo. Haga una marca de orientación en el tubo y la tapa para identificar la ubicación del pellet celular después de la centrifugación. Coloque el tubo en una centrífuga de alta velocidad con la marca en la parte superior y centrifug la muestra a 60, 000 G durante una hora a cuatro grados Centígrados.Después de la centrifugación, vierta cuidadosamente el sobrenadante, manteniendo el pellet en la parte superior del tubo. A continuación, resuspend el pellet en uno a dos mililitros de tampón MRD por vigorosamente vórtice. Prepare los tubos de cultivo alícuotando dos mililitros de medios de crecimiento apropiados en los tubos.Luego, agregue 200 microlitros de cultivo nocturno de organismos huéspedes y de 100 a 200 microlitros de muestra filtrada resuspended a cada tubo. Incubar las muestras combinadas en condiciones apropiadas para el organismo huésped. Pase las células cada dos o tres días transfiriendo 200 microlitros del cultivo binario a dos mililitros de medio de crecimiento fresco en un nuevo tubo.Si los cultivos pasados no muestran crecimiento a 200 microlitros de cultivo huésped no infectado, al pasar las células, devolver los tubos inoculados a la incubadora. Alícuota 24 microlitros de la mezcla maestra de PCR en un tubo de PCR de 0,2 mililitros. En un microlitro de cultivo infectado de sacaribacterias, coloque el tubo en un termocisómetro.Establezca el programa de PCR como se describe en el manuscrito del texto. Cargue y ejecute los productos de PCR en un gel 1%Agros. Una banda de aproximadamente 600 bases confirmará la presencia de sacaribacterias.Para confirmar la pureza de los cultivos positivos, realice una dilución en serie de 10 veces del cocultivo de sacaribacterias en un tampón estéril y extienda 100 microlitros en una placa de agar. Incubar el cultivo en condiciones de crecimiento adecuadas y observar si hay organismos contaminantes. Una banda de aproximadamente 600 bases confirmará la presencia de sacaribacterias.La detección de pcr puede aparecer negativa en las culturas iniciales de la infección debido a un número bajo de simbiontes de las sacaribacterias. Sin embargo, después de algunos pasajes, debe aparecer un producto de PCR fuerte, lo que indica que se ha producido una infección estable. Las pruebas de varias especies hospedadas con el mismo filtrado de sacaribacterias generalmente tendrán una baja tasa de éxito.Como el simbionte interacción del host es muy específico. A medida que los cultivos infectados crecen, debe aparecer un crecimiento turbio normal. A medida que la simbiosis se establece, los cultivos infectados aparecerán menos turbios que los cultivos de organismos huéspedes no infectados.Un cultivo contaminado se puede purificar recogiendo colonias infectadas después del revestimiento. Las colonias infectadas a veces se pueden identificar por una forma de colonia irregular en comparación con las colonias no infectadas. La proporción de colonias regulares depende del título de sacaribacterias en el cultivo binario.Si el título es bajo, menos colonias aparecerán irregulares, lo que facilita la selección de las colonias infectadas y el inicio de un cultivo binario puro. Las culturas pueden no parecer positivas para varios pasajes. Así que algunos pacientes serán necesarios.También es necesario comprobar regularmente la contaminación de los cultivos binarios, ya que esto puede desestabilizar el cultivo y conducir a la muerte de las sacaribacterias. El cultivo binario se puede utilizar para todo tipo de experimentos de laboratorio. El ADN y el ARN se pueden extraer para la secuenciación del genoma y el análisis del transcriptoma, respectivamente.La patogenicidad también se puede investigar utilizando modelos animales.

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