Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Författarna vill tacka Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He och Batbileg Bor för hjälpsamma diskussioner och för att de tillhandahåller bakteriestammar. Vi tackar Susan Yost och Jessica Woods för mikrobiell teknisk hjälp. Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) och T32 DE007327 (AJC). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.

Vid utarbetandet av detta protokoll söktes och godkändes IRB-godkännande (#14-10) och informerat samtycke erhölls från alla ämnen.
1. Förberedelse
<ol><li>När du arbetar med människor, få nödvändigt IRB-godkännande och informerat samtycke.</li>
	<li>Starta kulturer av värdbakterier med tillräckligt med tid för att växa till tidig stationär fas. Till exempel inokulera 2-5 ml tryptika sojabuljong med 0,1% jästextrakt tillsatt (TSBY) med Arachnia propionica och inkubera vid 37 °C i 24 timmar.</li>
	<li>Montera filterhållare med spåretsat filtermembran på 0,2 μm. Linda in enheten i folie och sterilisera genom autoklavering.</li>
	<li>Sterilisera centrifugrör och lockenheter.</li>
</ol>2. Ta prover av orala bakterier
OBS: Medan många orala prover innehåller Saccharibacteria (t.ex. saliv, svabbprover av tonsiller, tungaskrapningar) är tandplack rutinmässigt den mest framgångsrika.
<ol><li>Ta en plackskrapning med en steril papperspunkt, Gracey curette, eller, om du självprovar, använd en steril tandpetare eller pipettspets. Överför plack till en lämplig buffert, såsom maximal återhämtningsspädning (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% pepton) eller PBS. Om provet inte bearbetas omedelbart, håll provet på is tills det är klart att fortsätta.</li>
	<li>Återanvänd tandplack kraftigt i MRD-buffert med en kombination av virvel och pipetting med en liten rörspets.</li>
	<li>Tillsätt återanvändda plackprover till ytterligare 9 ml MRD-buffert.</li>
</ol>3. Förbered filtrate från oralt prov
<ol><li>Använd aseptisk teknik och packa upp en steril filterenhet. Lossa en kvarts varv och sätt tillbaka filterhållaren för att vara säker på att gängorna är ordentligt inkopplade och att apparaten är ordentligt stängd. Tvätta membranet med en spruta genom att skicka 10 ml MRD-buffert genom apparaten. Felaktig montering avslöjas i detta steg genom att vätska läcker ut ur filterhållaren. Om läckage uppstår, skaffa en annan steril filterenhet och upprepa tvättsteget.</li>
	<li>Applicera provet på det tvättade filtret. Ta bort kolven från en spruta och fäst den på filterapparaten. Häll det spridda tandprovet, nu i 10 ml MRD-buffert, i en spruta och ladda det på filtret.</li>
	<li>Placera ett sterilt centrifugeringsrör under filterapparaten för att fånga filtratet och tryck sedan på kolven för att trycka provet genom filtret.</li>
	<li>Upprepa proceduren med ytterligare 10 ml MRD-buffert för att tvätta membranet och samla in genomflödet i samma rör som det filtrerade provet. Kapa röret aseptiskt.</li>
</ol>4. Koncentrera Saccharibacteria celler genom centrifugation
<ol><li>Gör ett orienteringsmärke på röret och locket och placera röret i en höghastighetscentrifug med märket på ovansidan. Pelleten som bildas av centrifugation är vanligtvis osynlig. Märkningen hjälper till att avgöra var pelleten av Saccharibacteria-celler är placerad när centrifugering är klar och röret avlägsnas från centrifugen.</li>
	<li>Centrifugera proverna vid 60 000 x g i 1 timme vid 4 °C. OBS: Denna kraft och tid är tillräcklig för att pelleta alla Saccharibacteria celler. Saccharibacteria celler kan dock åtminstone delvis pelleteras genom centrifugering i så lite som 20 min vid 20,000 x g.</li>
	<li>Ta försiktigt bort rören från centrifug. Häll ut vätskan från röret och håll pelleten på rörets övre sida.</li>
	<li>Återanvänd den vanligtvis osynliga pelleten i 1-2 ml MRD-buffert genom kraftig virvel.</li>
</ol>5. Infektera värdkulturer med Saccharibacteria-berikat filtrat
<ol><li>Förbered odlingsrör genom att alikvotera 2 ml lämpligt tillväxtmedier (t.ex. TSBY, BHI osv.) i rör.</li>
	<li>Tillsätt 200 μL över natten kultur av värdorganismer till varje rör. Tillsätt 100-200 μL återanvänd, filtrerat prov till varje rör.</li>
	<li>Inkubera kombinerade prover som är lämpliga för värdorganismen (t.ex. 37 °C, i en aerob atmosfär för A. propionica).</li>
	<li>Passage cellerna varannan till var tredje dag genom att överföra 200 μL binär kultur till 2 ml färskt tillväxtmedium i ett nytt rör. Om det verkar som om de passagede kulturerna inte visar någon tillväxt (dvs. kulturens grumlighet / optiska densitet ökar inte efter passage i färska medier) kan Saccharibacteria vara överväldigande eller döda alla värdorganismer. För att åtgärda detta, tillsätt 200 μL oinfekterad värdkultur när du passar cellerna. Upprepa i minst 5 passager.</li>
</ol>6. Bekräfta infektion med PCR
<ol><li>Efter 5 passager, bekräfta infektion med PCR. Fem passager kommer att säkerställa att än någon icke-växande Saccharibacteria celler har utarmats utöver detektionsgränsen med hjälp av 25 cykler pcr.</li>
	<li>Förbered en PCR mastermix. Ett föreslaget recept som använder är följande, för varje rör som behövs, förbereda 12,5 μL 2x PCR-buffert, 0,75 μL 10 μM Framåtprimer (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 0 Reverse primer (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 och 9 μL vatten. Blanda genom att virvla.</li>
	<li>Aliquot 24 μL mastermix i ett 0,2 ml PCR-rör. Tillsätt 1 μL saccharibacteria-infekterad kultur till PCR-reaktionen. Placera röret i en termocyklist och utför följande protokoll: Initial denaturation 95 °C i 5 min, 25 cykler på 95 °C för 30 s, 60 °C för 30 s, 72 °C för 30 s, slutlig förlängning vid 72 °C i 2 min och sedan slutligt håll vid 4 °C.</li>
	<li>Ladda och kör PCR-produkterna i en 1% agarose gel. Ett band med ~600 baser indikerar närvaron av Saccharibacteria.</li>
</ol>7. Kontrollera renheten och avlägsna förorenande organismer
<ol><li>Bekräfta renheten hos positiva kulturer genom att plätera kokulturen av Saccharibacteria på näringsagar som är tillräcklig för värdorganismens tillväxt. Utför en 10-faldig seriell utspädning av kulturen i steril buffert (t.ex. MRD eller PBS) och sprid 100 μL på en agarplatta. Utför utspädningar så att det kommer att finnas cirka 20-200 kolonier som växer på agarplattan.</li>
	<li>Inkubera kulturen under lämpliga tillväxtförhållanden och observera för förorenande organismer. OBS: Axenic Saccharibacteria kolonier har aldrig observerats, så endast värdorganismen observeras växa på dessa plattor. Mer än en kolonityp indikerar vanligtvis förorening. Om kontaminering skulle inträffa bör kulturen filtreras om för att avlägsna de oönskade föroreningarna och återinokeras till färsk värd.</li>
	<li>Ibland uppstår en dubbel infektion, där två Saccharibacteria-arter infekterar samma värd. För att separera saccharibacteria-arten, återanvänd enskilda kolonier i 20 μL steril PBS och använd 1 μL suspension i en PCR-reaktion för att upptäcka kolonier med Saccharibacteria-infektioner.</li>
	<li>Överför suspensionerna som gav ett positivt resultat till tillväxtmedium för att starta en binär kultur. Framgångsgraden beror på titern för varje Saccharibacteria-art i kulturen. Det kan vara nödvändigt att screena mer än 50 kolonier för att hitta en infekterad för spridning.</li>
</ol>8. Lagring av kulturer
<ol><li>Odla en binär kultur med tillräcklig volym (10-50 ml) över natten.</li>
	<li>Pelletsceller genom centrifugering (4 000 x g i 10 min). OBS: Höghastighetscentrifugation är inte nödvändig här eftersom Saccharibacteria-celler kommer att fästas på de större, tyngre cellerna i värden och kommer att pelletsa med dem.</li>
	<li>Återanvänd celler i kryoprotectant. Tillväxtmedier kompletterade med antingen 5% DMSO eller 20% glycerol är vanligtvis tillräckligt. Se till att värdorganismen är kompatibel med kryoprotektiva medier (t.ex. tillväxt av A. propionica hämmas av glycerol och frysta lager kanske inte återupplivas). Testa livskraften hos en oinfekterad värdkultur med kryoprotekter för att säkerställa att bestånden kan överleva frysning.</li>
	<li>Återanvänd cellpellet i samma kulturvolym (10-50 ml). Alikvot 0,5 ml i märkta kryovialer. Frys cellkulturer vid -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+gen.+nov.,+sp.+nov.,+a+human+intestinal+mucin-degrading+bacterium.">Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).</li><li>Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinivorans+hirudinis+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+anaerobic,+mucin-degrading+bacterium+isolated+from+the+digestive+tract+of+the+medicinal+leech+Hirudo+verbana.">Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).</li><li>Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+system+regulates+hemin+acquisition+in+porphyromonas+gingivalis.">A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis.</a> PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).</li><li>Martin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+growth+media+for+oral+bacteria.">New growth media for oral bacteria.</a> Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).</li><li>Vartoukian, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+'unculturable'+oral+bacteria,+facilitated+by+community+culture+and+media+supplementation+with+siderophores.">In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores.</a> Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).</li><li>Strandwitz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-modulating+bacteria+of+the+human+gut+microbiota.">GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota.</a> Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).</li><li>Hug, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+the+tree+of+life.">A new view of the tree of life.</a> Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).</li><li>Castelle, C. J., Banfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+new+microbial+groups+expand+diversity+and+alter+our+understanding+of+the+tree+of+life.">Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life.</a> Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+human-associated+TM7+phylotype+reveals+a+reduced+genome+and+epibiotic+parasitic+lifestyle.">Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).</li><li>Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+candidate+division+TM7,+a+recently+recognized+major+lineage+of+the+domain+Bacteria+with+no+known+pure-culture+representatives.">Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).</li><li>Brinig, M., Lepp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+bacteria+of+division+TM7+in+human+subgingival+plaque+and+their+association+with+disease.">Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+obtained+by+culturing+saccharibacteria+with+their+bacterial+hosts.">Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts.</a> Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+physiological+characterization+of+the+epibiotic+interaction+between+TM7x+and+its+basibiont+actinomyces.">Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces.</a> Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).</li><li>Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+plaque+development+on+defined+streptococcal+surfaces.">Dental plaque development on defined streptococcal surfaces.</a> Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).</li><li>Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+candidate+phyla+radiation+Saccharibacteria+(TM7)+bacteria+in+coculture+with+bacterial+hosts.">Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts.</a> Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).</li><li>Cross, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Vår metod att filtrera plack och applicera den på rena kulturer av värdorganismer är till stor del baserad på tidigare observationer på den första odlade Saccharibacteria, "Nanosynbacter lyticus stam TM7x11,14,15. Med tanke på den lilla cellstorleken drog vi slutsatsen att de kunde separeras från tandplack med hjälp av ett filter och koncentreras med centrifugation. För det andra, eftersom dessa organismer lever som parasiter, skulle förutsatt att dessa celler rena kulturer av värdar skulle göra det möjligt för dem att gå in i en symbios och växa som binära kulturer.
En fördel med denna metod är att den inte kräver en anrikningskultur eller selektivt tryck. Nanosynbacter lyticus stam TM7x odlades från en anrikningskultur med streptomycin som selektivt medel, vilket sekvensering hade föreslagit skulle vara effektivt för berikning för Saccharibacteria. Slumpartat är värden för 'Nanosynbacter lyticus ' Schaalia odontolytica, känd för att vara resistent mot streptomycin16. Att använda antibiotika som selektivt medel skulle också kunna hindra värdorganismen från att växa, vilket i sin tur skulle förhindra tillväxten av Saccharibacteria.
En större fråga om att använda anrikningskulturer är att snabbväxande organismer snabbt kommer att tränga undan organismer av intresse. I munhålan kan till exempel Streptococcus-arter växa snabbt och, om socker finns i tillväxtmediet, producera tillräckligt med syra för att försura mediet, ytterligare välja mot organismer av intresse. Genom att undvika en anrikningskultur och selektiv antibiotika ger vår metod en allmän strategi som kan tillämpas på ett bredare spektrum av Saccharibacteria och potentiella värdar utan komplikationer av dessa andra metoder.
Det finns vissa hinder för den metod som presenteras här. För det första förutsätter denna metod att Saccharibacteria lever i en binär kultur. Vi har inte testat kombinationer av trinary eller ternary kulturer för att mäta deras effektivitet, men det finns sannolikt Saccharibacteria som kräver tillväxtfaktorer som en enda värdorganism inte kan leverera. Att testa de stora kombinationerna av orala bakterier som kan stödja tillväxten av Saccharibacteria skulle vara en skrämmande uppgift. För det andra antar metoden att alla Saccharibacteria är tillräckligt små för att passera genom ett 0,2 μm-filter. Det kan vara så att andra Saccharibacteria är större än man trott och filtret väljer mot dessa organismer. Ett filter med större porstorlek skulle kunna användas, men detta riskerar att släppa in mer oönskade orala bakterier i den infekterade samkulturen. Slutligen är det mycket svårt att hitta värdarter utanför de som redan har publicerats. Hittills är de enda framgångsrika värdarna arter från släktena Actinomyces, Schaalia, Arachnia och Cellulosimicrobium, alla medlemmar av fylum actinobacteria15,17,18. Dessa värdar stöder dock bara tillväxten av specifika Saccharibacteria. För att odla fler arter av Saccharibacteria måste många fler värdar utforskas.
Vi hoppas att den metod som presenteras här kommer att bidra till framtida forskning av Saccharibacteria och andra HLR-organismer. Metagenomisk sekvensering tyder på att dessa organismer också har små genom och misstänks vara symbionter eller förlita sig på det lokala mikrobiella samhället för att leverera metaboliter och andra faktorer som är kritiska för deras överlevnad19. En liknande filtreringsstrategi skulle kunna användas för att isolera dessa organismer, förutsatt att de är tillräckligt små och att deras värdorganismer kan odlas. De metoder som beskrivs här är ett första steg för att föra laboratoriekulturens kraftfulla verktyg till denna stora och mångsidiga grupp bakterier.

Genom att odla nya bakteriearter och föra in dem i laboratoriet kan kraftfulla experiment bättre förstå deras fysiologi och bredare interaktioner inom deras mikrobiella samhälle. Även om det finns kulturfria metoder för att förhöra dessa frågor (t.ex. "meta-omics"), gör de komplexa interaktionerna hos olika mikrobiella populationer det svårt att reta isär enskilda variabler och nå meningsfulla slutsatser. Medan odling av bakterier har många fördelar, finns det många potentiella hinder för att isolera en bakterie och odla den i ren kultur. Potentiella specifika tillväxtbehov inkluderar pH, syrespänning, vitaminer, tillväxtfaktorer, signalmolekyler eller till och med direkt cellkontakt för att framkalla tillväxt1. Man tror dock att specifika auxotroféer är det främsta avskräckande för odling av nya arter av bakterier. Standarda medieformuleringar saknar många näringsämnen som krävs av obrukade bakterier, såsom specifika vitaminer eller kolkällor. Dessa saknade molekyler kan vara nyckeln till de okulverterade bakteriernas fysiologi och tillhandahålls vanligtvis av antingen en annan organism i det mikrobiella samhället eller en värdorganism. Till exempel kan komplexa kolhydrater som muciner tillhandahållas av djurvärdar. Att lägga till dessa till media har gjort det möjligt att odla flera bakterier från djurinälvor, inklusive Akkermansia muciniphila och Mucinivorans hirudinis2,3,4. Många patogena bakterier har utvecklat förmågan att använda järn som är bundet till hemin i djurceller, inklusive den orala patogenen Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan tillväxten av Porphyromonas och andra organismer stimuleras genom tillsats av hemin6.
På senare tid har många genombrott i odling av nya isolat av bakterier kommit genom samodling, med hjälp av en "feeder" organism för att ge specifika faktorer till okulturerade bakterier som är nödvändiga för deras tillväxt. En elegant studie av Vartoukian och kollegor visade att siderophores, järnbindande molekyler producerade av bakterier, stimulerade tillväxten av flera nya orala isolat. Pyoverdines, en typ av siderophore produceras av pseudomonadarter, visade sig avsevärt underlätta tillväxten av en ny Prevotella art7. I samma studie odlades det första orala isolatet för fylumkloroflexi, även med F. nucleatum som hjälpare för att tillhandahålla några ännu okända förening7. Mer nyligen isolerades en bakterie från släktet Ruminococcaceae med Bacteroides fragilis som hjälparorganism8. det visades senare att gamma aminosmörsyra (GABA), en hämmande signalsubstans, krävdes för tillväxt på laboratoriemedier. Att använda matarorganismer har visat sig vara en viktig strategi för att efterlikna specifika mikromiljöer där obrukade bakterier växer, och är effektivare än att kontinuerligt omformulera tillväxtmedier med olika tillsatser i olika koncentrationer.
En av de största grupperna av okulturerade bakterier finns i "Candidate Phyla Radiation" (HLR), en monofyletisk grupp av flera kandidatbakterier phyla9,10. Från och med detta skrivande har endast medlemmar av Saccharibacteria fylum inom HLR framgångsrikt odlats i laboratoriet. Det första isolatet," Nanosynbacter lyticus stam TM7x, isolerades med hjälp av antibiotikumet streptomycin, som hade förutspåtts berika för den obrukade TM711,12. En viktig upptäckt av detta arbete var att det nya isolatet växte som en parasit som växer i direkt kontakt med en bakteriell värd, Schaalia odontolytica, och mikroskopi visade att dessa parasiter var ultrasmå bakterier.
Med hjälp av dessa ledtrådar utformade vi en metod för att snabbt etablera binära kokulturer av Saccharibacteria med sina partners genom att filtrera tandplack och andra orala prover genom ett 0,2 μm-filter, samla celler i filtratet genom centrifugation och använda dem för att infektera kulturer av kandidatvärdbakterier. Denna metod har fördelen att undvika anrikningskulturer, som kan överväldigas av snabbväxande organismer. Det undviker också användningen av antibiotika, vilket kan stoppa tillväxten av antingen den riktade Saccharibacteria-arten eller deras värdar. Med hjälp av metoden som demonstreras här har vi framgångsrikt odlat 32 isolat från Saccharibacteria fylum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

Många bakteriearter kan inte odlas i laboratoriet med hjälp av standardmetoder, vilket utgör ett betydande hinder för att studera majoriteten av mikrobiell mångfald på jorden. Nya metoder krävs för att odla dessa okulverterade bakterier så att utredarna effektivt kan studera sin fysiologi och livsstil med hjälp av de kraftfulla verktyg som finns tillgängliga i laboratoriet. Kandidaten Phyla Radiation (HLR) är en av de största grupperna av obrukade bakterier, som omfattar ~15% av den levande mångfalden på jorden. Det första isolatet av denna grupp var en medlem av Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' stam TM7x. TM7x är en ovanligt liten bakterie som lever som symbiont i direkt kontakt med en bakteriell värd, Schaalia odontolytica, stam XH001. Genom att dra nytta av den ovanligt lilla cellstorleken och dess livsstil som en symbiotisk organism utvecklade vi ett protokoll för att snabbt odla Saccharibacteria från tandplack. Detta protokoll kommer att visa hur man filtrerar en suspension av tandplack genom ett 0,2 μm filter, koncentrera sedan de insamlade Saccharibacteria-cellerna och infektera en kultur av värdorganismer. Den resulterande kokulturen kan passeras som alla normala bakteriekultur och infektion bekräftas av PCR. Den resulterande binära kulturen kan upprätthållas i laboratoriet och användas för framtida experiment. Medan förorening är en möjlighet, kan den binära kulturen renas genom antingen ytterligare filtrering och återinfektion av värd, eller genom plätering av binär kultur och screening för infekterade kolonier. Vi hoppas att detta protokoll kan utvidgas till andra provtyper och miljöer, vilket leder till odling av många fler arter i HLR.

PCR för påvisande av Saccharibacteria kan verka negativt (dvs. ingen produkt sett) i inledande infektion kulturer på grund av ett lågt antal Saccharibacteria symbionter. Men efter några passager bör en stark PCR-produkt visas som visar att en stabil infektion har inträffat (figur 1A). Omvänt kommer vissa infektioner initialt att verka positiva av PCR, men minska till oidentifierbara efter 1-4 passager (visas inte). Detta indikerar att en stor mängd Saccharibacteria celler var närvarande i den ursprungliga filtrate men späddes ut genom passage och ingen kunde gå in i en stabil symbios med värdkulturen. Testning av flera värdarter med samma Saccharibacteria-filtrat från munhålan kommer vanligtvis att ha en låg framgångsgrad (figur 1B) eftersom symbiont-värdinteraktionen är mycket specifik. En forskare kan också testa samma värd med filtrates från flera olika ämnen. Om en bra värdorganism (som Arachnia propionica eller Schaalia odontolytica) används, kan en framgångsgrad på 50% förväntas.
Testning av PCR är avgörande. Erfarna forskare har försökt bekräfta infektion genom mikroskopi, bara för att rapportera falska positiva. Saccharibacteria cellerna är små och svåra att skilja mellan blåsor eller oregelbundna cell kuvert utbuktningar. En PCR-signal stabil genom flera passager är nyckeln till att bekräfta en framgångsrik infektion.
När de infekterade kulturerna växer bör normal grumlig tillväxt förekomma. När symbiosen etablerar sig kommer infekterade kulturer att verka mindre grumliga än kulturer av oinfekterade värdorganismer (Figur 2A). I vissa fall kan infekterade kulturer verka sluta växa helt och inte bli grumliga alls. Detta kan bero på en infektion där Saccharibacteria cellerna överväldigar värdorganismen. Att lägga till "färsk" (oinfekterad) värd till dessa kulturer bör ge en tillräcklig värdpopulation för att stödja den fortsatta tillväxten av Saccharibacteria parasiter.
Överväxt, eller alltför grumliga kulturer, kan tyda på kontaminering av antingen ett laboratorieföroreningsmedel eller en annan liten oral bakterie som kunde passera genom filtret på 0,2 μm. Campylobacter och Capnocytophaga spp. är typiska orala föroreningar av dessa experiment. Detta kan bekräftas genom att plätera kulturen och leta efter kolonier som är atypiska av värdorganismen följt av 16S rRNA-sekvensering. Om kontaminering ses är filtrering av dessa kulturer genom ett filter på 0,2 μm vanligtvis tillräckligt för att avlägsna föroreningarna. Saccharibacteria celler i filtratet kan koncentreras genom centrifugation och användas för att åter infektera en ren värdkultur.
Ett annat sätt att rena en förorenad kultur är genom att plocka infekterade kolonier från att plätera en infekterad kultur. Kolonier av infekterade värdar kan ibland identifieras med oregelbunden koloniform jämfört med oinfekterade kolonier (Figur 2B-D). Dessa oregelbundna kolonier är beroende av titern av Saccharibacteria i den binära kulturen och en mindre andel kolonier kommer att visas oregelbundna om titern är låg. Detta kan göra det enkelt att identifiera infekterade kolonier, som kan plockas och användas för att starta en ren binär kultur. Om inga oregelbundna kolonier ses på plätering från en Saccharibacteria infekterad kultur, är det möjligt att symbionten är vid en låg titer eller inte orsakar oregelbundet formade kolonier. I ett sådant fall kan PCR-screeningkolonier med normalt utseende visa infektion av Saccharibacteria, men i låg takt (2-10% av alla kolonier).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Figur 1: Typiska PCR-resultat av Saccharibacteriainfektioner hos värdkulturer. (A) En PCR-produkt som indikerar förekomst av Saccharibacteria kan inte förekomma med den första infektionen men kan förekomma och bli starkare i efterföljande passager när kokulturen etablerar sig. (B) De flesta värdar som smittats med Saccharibacteria-berikat filtrat kommer inte att stödja deras tillväxt på grund av symbiosens specificitet. I det här exemplet var endast A. propionica framgångsrikt smittade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Figur 2: Tillväxtegenskaper hos saccharibacteriainfekterade kulturer. (A) Tillväxtkurvor av infekterade och oinfekterade kulturer i A. propionica som visar infekterad kultur kommer inte att växa till samma densitet som den oinfekterade kontrollen och verka mindre grumlig. (B-D) Plätering av kokulturer kan producera oregelbundna kolonier, orsakade av Saccharibateria-infektioner. Oregelbundna kolonier kommer att minska i proportion till titern av Saccharibacteria i kokulturen. B)Värd med hög saccharibacteria. C)10-faldig utspädd Sackaribacteria(D)Oinfekterad värdkultur. Vita pilar visar exempel på oregelbundna kolonier. Skalbar= 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Vi demonstrerar en metod för att isolera svårodlande medlemmar av den nya bakteriella fylumen, Saccharibacteria, genom att filtrera tandplack och samkultur med värdbakterier.

Etablera stabila binära kulturer av symbiotiska saccharibacteria från munhålan

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Sackaribacteria är obligatoriska parasiter som kräver samkultur med lämpliga värdbakterier. Eftersom mänskliga orala sackaribacteria kan lätt isoleras för de flesta individer med hjälp av kända värdbakterier. Detta protokoll kommer att tillåta alla utredare eller laboratorium att isolera sina egna stammar i binär samkultur.Denna teknik använder enkla enheter och utrustning som finns i de flesta mikrobiologiska laboratorier och har framgångsrikt använts för att odla över 30 isolat som representerar sex arter av sackaribacteria. Detta protokoll kan vara användbart för isolering av andra strålarter som följs av kandidat, liksom sackaribakteri från olika miljöer och andra däggdjur om lämpliga aktinobakteriella värdar kan identifieras och isoleras. Andrew Collins, före detta postdoktor i mitt laboratorium, demonstrerar proceduren.Till att börja med, starta kulturer av värdbakterier som arachnia propionica, med tillräckligt med tid för dem att växa till tidig stationär fas. För att initiera kulturen, inokulera två till fem milliliter tryptisk sojabuljong som innehåller 0,1% jästextrakt med arachnia propionica och inkubera den vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Montera sedan filterhållare med spåretsade 0,2 mikrometer filtermembran.Linda dem i folie och sterilisera genom autoklavering, tillsammans med centrifugrör och kepsenheter. Sterilisera extra förnödenheter vid oavsiktlig kontakt med icke-sterila ytor. Samla tandplack genom att skrapa längs tandköttslinjen, använda en steril papperspunkt, graciös ostett eller en steril tandpetare eller pipettspets och överför den till en lämplig buffert som MRD eller PBS.Håll provet på is tills det är klart att fortsätta. Återanvänd tandplacket kraftigt med hjälp av en kombination av virvel och pipettering med en liten pipettspets och tillsätt sedan det återanvända plackprovet i ett rör som innehåller nio milliliter MRD-buffert. Packa försiktigt upp en steril filterenhet med aseptisk teknik.Lossa en kvarts varv och dra åt filterhållaren igen för att säkerställa att gängorna är ordentligt inkopplade och att apparaten är ordentligt stängd. Tvätta membranet genom att skicka 10 milliliter MRD-buffert genom apparaten med en spruta. För att applicera provet på det tvättade filtret, ta bort kolven från en spruta och fäst den på filterapparaten.Placera ett sterilt centrifugeringsrör under filterapparaten för att fånga filtratet, häll sedan det dispergerade tandprovet i sprutan och ladda det på filtret. Tryck sedan på kolven för att trycka provet genom filtret. Tvätta membranet med ytterligare 10 milliliter MRD-buffert och samla in flödet i samma rör som det filtrerade provet.Kapa sedan röret aseptiskt och håll på is. Gör ett orienteringsmärke på röret och locket för att identifiera cellpelletens placering efter centrifugation. Placera röret i en höghastighetscentrifug med märket på ovansidan och centrifugera proverna vid 60 000 G i en timme vid fyra grader Celsius.Efter centrifugation, häll försiktigt ut supernaten och håll pelleten på rörets övre sida. Återanvänd sedan pelleten i en till två milliliter MRD-buffert genom att kraftigt virvla. Förbered odlingsrör genom att alikvotera två milliliter lämpligt tillväxtmedier i rören.Tillsätt sedan 200 mikroliter värdorganismer över natten och 100 till 200 mikroliter återanvändet filtrerat prov till varje rör. Inkubera de kombinerade proverna under förhållanden som är lämpliga för värdorganismen. Passage cellerna varannan till var tredje dag genom att överföra 200 mikroliter av den binära kulturen till två milliliter färskt tillväxtmedium i ett nytt rör.Om de passagede kulturerna inte visar någon tillväxt vid 200 mikroliter av oinfekterad värdkultur, när de passar cellerna, returnera inokulerade rör till inkubatorn. Aliquote 24 mikroliter pcr master mix i ett 0,2 milliliter PCR-rör. Placera röret i en termocyklator vid en mikroliter saccharibacteriainfekterad kultur.Ställ in PCR-programmet enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Ladda och kör PCR-produkterna på en 1%Agros gel. Ett band på cirka 600 baser kommer att bekräfta närvaron av sackaribakteri.För att bekräfta renheten hos positiva kulturer, utför en 10-faldig seriell utspädning av samkulturen av saccharibacteria i en steril buffert och sprid 100 mikroliter på en agarplatta. Inkubera kulturen under lämpliga tillväxtförhållanden och observera för kontaminerande organismer. Ett band på cirka 600 baser kommer att bekräfta närvaron av sackaribakteri.PCR detektering kan verka negativa i inledande infektion kulturer på grund av att ett lågt antal saccharibacteria symbionter. Men efter några passager bör en stark PCR-produkt visas, vilket indikerar att en stabil infektion har inträffat. Testning av flera värdarter med samma sackaribacteriafiltrate kommer vanligtvis att ha en låg framgångsgrad.Eftersom den symbionta värdinteraktionen är mycket specifik. När de infekterade kulturerna växer bör normal grumlig tillväxt förekomma. När symbiosen etablerar sig kommer infekterade kulturer att verka mindre grumliga än kulturer av oinfekterade värdorganismer.En förorenad kultur kan renas genom att plocka infekterade kolonier efter plätering. Infekterade kolonier kan ibland identifieras med en oregelbunden koloniform jämfört med oinfekterade kolonier. Andelen av en vanlig koloni beror på titern av sackaribacteria i den binära kulturen.Om titern är låg kommer färre kolonier att verka oregelbundna, vilket gör det enkelt att välja de infekterade kolonierna och starta en ren binär kultur. Kulturer kanske inte verkar positiva för flera passager. Så vissa patienter kommer att behövas.Det är också nödvändigt att regelbundet kontrollera för förorening av binära kulturer, eftersom detta kan destabilisera kulturen och leda till saccharibacterias död. Den binära kulturen kan användas för alla typer av laboratorieexperiment. DNA och RNA kan extraheras för genomsekvensering respektive transkriptomanalys.Patogenicitet kan också undersökas med hjälp av djurmodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

Intravitreal injektion för Etablera Ocular Sjukdomar Modell

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

Utvinning av EPP Component från ytan EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Skaffa hemocyter från Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Och observera att de följer Symbiotiska och icke-symbiotiska bakterier

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Härledning av Stem Mus trofoblasten Celler från Blastocyster

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Strömlinjeformad Rening av Plasmid DNA från Prokaryota kulturer

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...