Name: establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Yazarlar Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He ve Batbileg Bor'a yararlı tartışmalar ve bakteri suşları sağladıkları için teşekkür etmek istiyor. Susan Yost ve Jessica Woods'a mikrobiyal teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü tarafından R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) ve T32 DE007327 (AJC) ödül numaraları altında desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Bu protokol geliştirilirken IRB onayı aranarak onaylanmıştır (#14-10) ve tüm konulardan bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
1. Hazırlık
<ol><li>İnsan deneklerle çalışırken, gerekli IRB onayını ve bilgilendirilmiş onayı alın.</li>
	<li>Erken sabit faza büyümek için yeterli zamana sahip konak bakteri kültürlerine başlayın. Örneğin, 2-5 mL triptik soya suyunu% 0.1 maya özü eksik (TSBY) ile Arachnia propionica ile aşılayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Filtre tutucuları paletli 0,2 μm filtre membranıyla monte edin. Montajı folyoya sarın ve otomatik olarak kaplayarak sterilize edin.</li>
	<li>Santrifüj tüplerini ve kapak montajlarını sterilize edin.</li>
</ol>2. Oral bakteri örneği alın
NOT: Birçok oral örnek Saccharibacteria (örneğin tükürük, bademcik sürüntüleri, dil kazıma) diş plağı rutin olarak en başarılı olanıdır.
<ol><li>Steril bir kağıt noktası, Gracey curette kullanarak bir plak kazıma alın veya kendi kendine örnekleme yapıyorsanız steril bir kürdan veya pipet ucu kullanın. Planı maksimal geri kazanım seyreltici (MRD, %0,85 NaCl, %0,1 pepton) veya PBS gibi uygun bir tampona aktarın. Hemen işlenmezse, numuneyi devam etmeye hazır olana kadar buzda tutun.</li>
	<li>Diş plağını MRD tamponunda, küçük bir pipet ucu ile girdaplama ve pipetleme kombinasyonu kullanarak kuvvetli bir şekilde yeniden depolayın.</li>
	<li>Ek 9 mL MRD arabelleğine yeniden sulanmış plak örneği ekleyin.</li>
</ol>3. Oral numuneden filtrat hazırlayın
<ol><li>Aseptik tekniği kullanarak steril bir filtre tertibatı çözün. İpliklerin düzgün takıldığından ve cihazın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için çeyrek dönüşü açın ve filtre tutucuyu yeniden genişletin. Bir şırıng kullanarak, 10 mL MRD tamponunu aparattan geçirerek zarı yıkayın. Filtre tutucudan sıvı sızarak bu adımda yanlış montaj ortaya çıkar. Sızıntı meydana gelirse, başka bir steril filtre tertibatı edinin ve yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Örneği yıkanmış filtreye uygulayın. Pistonu bir şırınnadan çıkarın ve filtre cihazına takın. Şimdi 10 mL MRD tamponunda olan dağınık diş örneğini bir şırınna dökün ve filtreye yükleyin.</li>
	<li>Filtratı yakalamak için filtre cihazının altına steril bir santrifüj tüpü yerleştirin, ardından numuneyi filtreden geçirmek için pistona hafif basınç uygulayın.</li>
	<li>Membranı yıkamak için işlemi 10 mL daha MRD tamponu ile tekrarlayın ve akışı filtrelenmiş numuneyle aynı tüpte toplayın. Aseptik olarak tüpü kapla.</li>
</ol>4. Saccharibacteria hücrelerini santrifüjleme ile konsantre edin
<ol><li>Tüp ve kapak üzerinde bir oryantasyon işareti yapın ve tüpü üst taraftaki işaretle birlikte yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeden oluşan pelet genellikle görünmezdir. İşaretleme, santrifüjleme yapıldığında ve tüp santrifüjden çıkarıldığında Saccharibacteria hücrelerinin peletinin nerede bulunduğunu belirlemeye yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Numuneleri 60.000 x g'da 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj edin. NOT: Bu kuvvet ve zaman tüm Saccharibacteria hücrelerini peletmek için yeterlidir. Bununla birlikte, Saccharibacteria hücreleri en azından 20.000 x g'da20 dakika kadar kısa bir süre santrifüjleme ile kısmen peletlenebilir.</li>
	<li>Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Peletin tüpün üst tarafında tutularak sıvıyı tüpten dökün.</li>
	<li>Genellikle görünmez peletin 1-2 mL MRD tamponunda güçlü girdap ile yeniden depolansın.</li>
</ol>5. Ev sahibi kültürlere Saccharibacteria ile zenginleştirilmiş filtrat bulaştırın
<ol><li>2 mL uygun büyüme ortamını (örneğin, TSBY, BHI, vb.) tüplere ayırarak kültür tüpleri hazırlayın.</li>
	<li>Her tüpe 200 μL konak organizma kültürü ekleyin. Her tüpe 100-200 μL resüspended, filtrelenmiş numune ekleyin.</li>
	<li>Kombine numuneleri konak organizma için uygun şekilde kuluçkaya yatırın (örneğin, 37 °C, A. propionicaiçin aerobik bir atmosferde).</li>
	<li>Yeni bir tüpte 200 μL ikili kültürü 2 mL taze büyüme ortamına aktararak hücreleri iki ila üç günde bir aktarın. Geçişli kültürlerin büyüme göstermediği görülürse (yani, kültürün bulanıklığı / optik yoğunluğu taze ortama geçtikten sonra artmaz) Saccharibacteria tüm konak organizmayı ezici veya öldürebilir. Bunu düzeltmek için, hücreleri geçirirken 200 μL enfekte olmayan konak kültürü ekleyin. En az 5 pasaj için tekrarlayın.</li>
</ol>6. PCR ile enfeksiyonu onaylayın
<ol><li>5 pasajdan sonra PCR ile enfeksiyonu onaylayın. Beş pasaj, büyümeyen Saccharibacteria hücrelerinin 25 pcr döngüsü kullanılarak algılama sınırının ötesinde tükenmesini sağlayacaktır.</li>
	<li>Bir PCR mastermix hazırlayın. Önerilen bir tarif aşağıdaki gibidir, ihtiyaç duyulan her tüp için 12,5 μL 2x PCR tamponu hazırlayın, 0,75 μL 10 μM İleri astar (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 10μM Ters astar (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 ve 9 μL su. Girdapla karıştırın.</li>
	<li>Aliquot 24 μL mastermiks 0.2 mL PCR tüpüne. PCR reaksiyona 1 μL Saccharibacteria bulaşmış kültür ekleyin. Tüpü bir termosikleme içine yerleştirin ve aşağıdaki protokolü gerçekleştirin: İlk denatürasyon 95 °C 5 dakika, 25 döngü 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s, son uzama 72 °C 2 dakika, sonra 4 °C'de son tutma.</li>
	<li>PCR ürünlerini % 1 agarose jelde yükleyin ve çalıştırın. ~600 bazlı bir grup Saccharibacteria'nın varlığını gösterecektir.</li>
</ol>7. Saflık olup olmadığını kontrol edin ve kirletici organizmaları çıkarın
<ol><li>Saccharibacteria'nın kokültürünü konak organizmanın büyümesi için yeterli besin agarı üzerine kaplayarak pozitif kültürlerin saflığını onaylayın. Kültürün steril tamponda (örneğin MRD veya PBS) 10 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve bir agar plakasına 100 μL yayın. Agar plakasında yaklaşık 20-200 koloninin büyüyeceği şekilde seyreltmeler gerçekleştirin.</li>
	<li>Kültürü uygun büyüme koşullarında kuluçkaya yatırın ve kirletici organizmalar için gözlemleyin. NOT: Axenik Sakkaribakteri kolonileri hiç gözlenmemiştir, bu nedenle bu plakalarda sadece konak organizmanın büyüdüğü gözlenir. Birden fazla koloni tipi genellikle kirlenmeyi gösterir. Kontaminasyon meydana gelirse, kültür istenmeyen kirleticileri gidermek için yeniden filtrelenmeli ve taze konakçıya yeniden aşılanmalıdır.</li>
	<li>Bazen iki Saccharibacteria türünün aynı konağı enfekte ettiği çift enfeksiyon meydana gelir. Saccharibacteria türlerini ayırmak için, 20 μL steril PBS'de tek tek kolonileri yeniden kullanın ve Saccharibacteria enfeksiyonu olan kolonileri tespit etmek için PCR reaksiyonunda 1 μL süspansiyon kullanın.</li>
	<li>İkili bir kültür başlatmak için büyüme ortamına olumlu sonuç veren askıya almaları aktarın. Başarı oranı, kültürdeki her Saccharibacteria türünün titrekliğine bağlı olacaktır. Yayılma için enfekte bir koloni bulmak için 50'den fazla koloniyi taramak gerekebilir.</li>
</ol>8. Kültürlerin depolanmasını
<ol><li>Bir gecede yeterli hacimde (10-50 mL) ikili bir kültür büyütün.</li>
	<li>Santrifüjleme ile pelet hücreleri (10 dakika boyunca 4.000 x g). NOT: Saccharibacteria hücreleri konağın daha büyük, daha ağır hücrelerine bağlanacağı ve onlarla peletileceği için burada yüksek hızlı santrifüjleme gerekli değildir.</li>
	<li>Hücreleri kriyoprotektantta yeniden biriktirin. %5 DMSO veya %20 gliserol ile desteklenmiş büyüme ortamı genellikle yeterlidir. Konak organizmanın kriyoprotektör ortamla uyumlu olduğundan emin olun (örneğin, A. propionica büyümesi gliserol tarafından inhibe edilir ve dondurulmuş stoklar canlanmayabilir). Stokların donmada hayatta kalabilmesini sağlamak için enfekte olmayan bir konak kültürünün canlılığını kriyoprotektant ile test edin.</li>
	<li>Hücre peletini aynı kültür hacminde (10-50 mL) yeniden dirildi. Etiketli cryovials içine Aliquot 0.5 mL. Hücre kültürlerini -80 °C'de dondurun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), 00012 (2011).</li><li>Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+gen.+nov.,+sp.+nov.,+a+human+intestinal+mucin-degrading+bacterium.">Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).</li><li>Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinivorans+hirudinis+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+anaerobic,+mucin-degrading+bacterium+isolated+from+the+digestive+tract+of+the+medicinal+leech+Hirudo+verbana.">Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).</li><li>Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+system+regulates+hemin+acquisition+in+porphyromonas+gingivalis.">A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis.</a> PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).</li><li>Martin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+growth+media+for+oral+bacteria.">New growth media for oral bacteria.</a> Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).</li><li>Vartoukian, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+'unculturable'+oral+bacteria,+facilitated+by+community+culture+and+media+supplementation+with+siderophores.">In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores.</a> Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).</li><li>Strandwitz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-modulating+bacteria+of+the+human+gut+microbiota.">GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota.</a> Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).</li><li>Hug, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+of+the+tree+of+life.">A new view of the tree of life.</a> Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).</li><li>Castelle, C. J., Banfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+new+microbial+groups+expand+diversity+and+alter+our+understanding+of+the+tree+of+life.">Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life.</a> Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+human-associated+TM7+phylotype+reveals+a+reduced+genome+and+epibiotic+parasitic+lifestyle.">Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).</li><li>Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+candidate+division+TM7,+a+recently+recognized+major+lineage+of+the+domain+Bacteria+with+no+known+pure-culture+representatives.">Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).</li><li>Brinig, M., Lepp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+bacteria+of+division+TM7+in+human+subgingival+plaque+and+their+association+with+disease.">Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease.</a> Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+obtained+by+culturing+saccharibacteria+with+their+bacterial+hosts.">Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts.</a> Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).</li><li>Bor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+physiological+characterization+of+the+epibiotic+interaction+between+TM7x+and+its+basibiont+actinomyces.">Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces.</a> Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).</li><li>Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+plaque+development+on+defined+streptococcal+surfaces.">Dental plaque development on defined streptococcal surfaces.</a> Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).</li><li>Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+candidate+phyla+radiation+Saccharibacteria+(TM7)+bacteria+in+coculture+with+bacterial+hosts.">Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts.</a> Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).</li><li>Cross, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics.">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li><li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla.">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Plak filtreleme ve konak organizmaların saf kültürlerine uygulama yöntemimiz büyük ölçüde ilk kültürlü Saccharibacteria, 'Nanosynbacter lyticus' suşu TM7x11 , 14,15üzerindeki önceki gözlemlere dayanmaktadır. Küçük hücre büyüklüğü göz önüne alındığında, bir filtre kullanılarak diş plağından ayrılabileceklerini ve santrifüjleme ile konsantre olabileceklerini bulduk. İkincisi, bu organizmalar parazit olarak yaşadıklarından, bu hücrelere saf konak kültürleri sağlamak, bir simbiyoz içine girmelerine ve ikili kültürler olarak büyümelerine izin verecektir.
Bu yöntemin bir avantajı, zenginleştirme kültürü veya seçici baskı gerektirmemesidir. 'Nanosynbacter lyticus' suşu TM7x, streptomisin seçici bir ajan olarak kullanılarak zenginleştirme kültüründen kültürlenmiştir, bu da sıralamanın Saccharibacteria için zenginleştirmede etkili olacağını öne sürmüştür. Tesadüfen, 'Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, streptomisin16'yakarşı dirençli olduğu bilinmektedir. Antibiyotiklerin seçici bir ajan olarak kullanılması, konak organizmanın büyümesini de engelleyebilir ve bu da Saccharibacteria'nın büyümesini önler.
Zenginleştirme kültürlerini kullanmanın daha büyük bir sorunu, hızlı büyüyen organizmaların ilgi çekici organizmaları hızla yerinden edecek olmasıdır. Örneğin, ağız boşluğunda, Streptococcus türleri hızlı bir şekilde büyüyebilir ve büyüme ortamında şeker varsa, ortamı asitleştirmek için yeterli asit üretebilir ve ilgi çekici organizmalara karşı daha fazla seçim yapabilir. Zenginleştirme kültüründen ve seçici antibiyotiklerden kaçınarak, yöntemimiz, bu diğer yöntemlerin komplikasyonları olmadan daha geniş bir Saccharibacteria ve potansiyel konaklara uygulanabilecek genel bir yaklaşım sağlar.
Burada sunulan yöntemin önünde bazı engeller bulunmaktadır. İlk olarak, bu yöntem Saccharibacteria'nın ikili bir kültürde yaşadığını varsayar. Etkinliklerini ölçmek için trinary veya üçlü kültür kombinasyonlarını test etmedik, ancak tek bir konak organizmanın sağlayamadığı büyüme faktörleri gerektiren muhtemel Sakkarakteri vardır. Saccharibacteria'nın büyümesini destekleyebilecek geniş ağız bakteri kombinasyonlarını test etmek göz korkutucu bir iş olacaktır. İkinci olarak, yöntem tüm Saccharibacteria'nın 0,2 μm filtreden geçecek kadar küçük olduğunu varsayar. Diğer Saccharibacteria inanılandan daha büyük olabilir ve filtre bu organizmalara karşı seçiyor olabilir. Daha büyük gözenek boyutuna sahip bir filtre kullanılabilir, ancak bu, enfekte olmuş ortak kültüre daha fazla istenmeyen oral bakteriye izin verme riskiyle karşı karşıyadır. Son olarak, daha önce yayınlanmış olanların dışında konak türleri bulmak çok zordur. Şimdiye kadar, tek başarılı konakçı actinomyces, Schaalia, Arachnia ve Selülosimicrobiumcins türleridir, phylum Actinobacteria15,17,18'intüm üyeleri. Ancak, bu konaklar sadece belirli Saccharibacteria'nın büyümesini destekler. Daha fazla Saccharibacteria türünü kültüre etmek için, daha birçok konak keşfedilmelidir.
Burada sunulan yöntemin Saccharibacteria ve diğer CPR organizmalarının gelecekteki araştırmalarına yardımcı olacağını umuyoruz. Metasagenomik dizileme, bu organizmaların da küçük genomlara sahip olduğunu ve symbiont olduğundan şüphelenildiğini veya metabolitler ve hayatta kalmaları için kritik olan diğer faktörleri sağlamak için yerel mikrobiyal topluluğa güvendiklerinden şüphelenilmelerini önermektedir19. Benzer bir filtreleme stratejisi, bu organizmaları yeterince küçük olmaları ve konak organizmalarının kültürlenebilmesi koşuluyla izole etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan yöntemler, laboratuvar kültürünün güçlü araçlarını bu büyük ve çeşitli bakteri grubuna getirmenin ilk adımıdır.

Yeni bakteri türlerinin kült haline getirilmesi ve laboratuvara getirilmesi, güçlü deneylerin fizyolojilerini ve mikrobiyal topluluklarındaki daha geniş etkileşimlerini daha iyi anlamalarını sağlar. Bu soruları sorgulamanın kültürsüz yöntemleri (örneğin, "meta-omiks") olsa da, çeşitli mikrobiyal popülasyonların karmaşık etkileşimleri, tek değişkenleri birbirinden ayırmayı ve anlamlı sonuçlara ulaşmayı zorlaştırır. Bakterileri kültleştirmenin birçok faydası olsa da, bir bakteriyi izole etmenin ve saf kültürde yetiştirmenin birçok potansiyel engeli vardır. Potansiyel spesifik büyüme gereksinimleri arasında pH, oksijen gerginliği, vitaminler, büyüme faktörleri, sinyal molekülleri ve hatta büyümeyi ortaya çıkarmak için doğrudan hücre teması1bulunur. Bununla birlikte, spesifik auxotrophies'in yeni bakteri türlerini kültlemede birincil caydırıcı olduğuna inanılmaktadır. Standart medya formülasyonları, belirli vitaminler veya karbon kaynakları gibi kültürsüz bakterilerin gerektirdiği birçok besin maddesinden yoksundir. Bu eksik moleküller, kültürsüz bakterilerin fizyolojisi için anahtar olabilir ve genellikle mikrobiyal topluluktaki başka bir organizma veya konak organizma tarafından sağlanır. Örneğin, mücinler gibi karmaşık karbonhidratlar hayvan konakçıları tarafından sağlanabilir. Bunları medyaya eklemek, Akkermansia muciniphila ve Mucinivorans hirudinis 2,3,4dahil olmak üzere hayvan bağırsaklarından birkaç bakterinin yetiştirilmesine izin etti. Birçok patojenik bakteri, oral patojen Porphyromonas gingivalis5de dahil olmak üzere hayvan hücrelerinde hemin'e bağlı demir kullanma yeteneğini geliştirmüştür. Laboratuvarda, Porphyromonas ve diğer organizmaların büyümesi, hemin6ilavesi ile uyarılabilir.
Son zamanlarda, bakterilerin yeni izolelerini kültlemede birçok atılım, büyümeleri için gerekli olan kültürsüz bakterilere belirli faktörler sağlamak için bir "besleyici" organizma kullanarak birlikte kültleme yoluyla geldi. Vartoukian ve meslektaşları tarafından yapılan zarif bir çalışma, bakteriler tarafından üretilen demir bağlayıcı moleküller olan siderophores'un birkaç yeni oral izolatın büyümesini uyardığını göstermiştir. Pseudomonad türleri tarafından üretilen bir tür siderophoreolan pyoverdines , yeni bir Prevotella türünün büyümesini önemli ölçüde kolaylaştırdığı gösterilmiştir7. Aynı çalışmada, chloroflexi fitülotu için ilk oral izole, ayrıca F. nükleatum'un henüz bilinmeyen bileşik7sağlamak için yardımcı olarak kullanılmasıyla yetiştirildi. Daha yakın zamanda, Ruminococcaceae cinsinden bir bakteri, bacteroides fragilis yardımcı organizma olarak kullanılarak izole edildi8. Daha sonra laboratuvar ortamlarında büyüme için inhibitör bir nörotransmitter olan gama aminobütirik asidin (GABA) gerekli olduğu gösterilmiştir. Besleyici organizmaların kullanılması, kültürlenmemiş bakterilerin büyüdüğü belirli mikroçevreleri taklit etmek için önemli bir strateji olduğunu, büyüme ortamlarını farklı konsantrasyonlarda farklı katkı maddeleri ile sürekli olarak yeniden biçimlendirmekten daha verimli olduğunu kanıtlamıştır.
Kültürsüz bakterilerin en büyük gruplarından biri, birkaç aday bakteriyel phyla9,10'danoluşan monofiletik bir grupolan"Aday Phyla Radyasyonu" (CPR) içindedir. Bu yazıdan dolayı laboratuvarda sadece CPR içindeki Saccharibacteria fitilinin üyeleri başarıyla kültürlenmiştir. İlk izole, 'Nanosynbacter lyticus' suşu TM7x, kültürsüz TM711,12için zenginleşerek tahmin edilen antibiyotik streptomisin kullanılarak izole edildi. Bu çalışmanın önemli bir keşfi, yeni izolatın bakteri konak sahibi Schaalia odontolyticaile doğrudan temas halinde büyüyen bir parazit olarak büyümesi ve mikroskopinin bu parazitlerin ultrasmall bakteriler olduğunu göstermesiydi.
Bu ipuçlarını kullanarak, diş plağı ve diğer oral örnekleri 0,2 μm filtreden geçirerek, filtrattaki hücreleri santrifüjleme ile toplayarak ve aday konak bakteri kültürlerini enfekte etmek için kullanarak ortaklarıyla hızlı bir şekilde Sakkaripteri ikili kokültürleri oluşturmak için bir yöntem tasarladık. Bu yöntem, hızlı büyüyen organizmalarla boğulabilen zenginleştirme kültürlerinden kaçınma avantajına sahiptir. Ayrıca, hedeflenen Saccharibacteria türlerinin veya konaklarının büyümesini durdurabilecek antibiyotik kullanımından kaçınır. Burada gösterilen yöntemi kullanarak, Saccharibacteria fitilinden 32 izolatını başarıyla kültürledik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alphaimager</td>
			<td>Cell Biosciences</td>
			<td>FluorChem HD2</td>
			<td>Or equivalent UV gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211059</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotor 70-Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Rig</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td>Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040025</td>
			<td>Or equivalent thermocycler for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 solution 25mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Control InVitro Glove Box</td>
			<td>Coy Laoratories</td>
			<td>031615</td>
			<td>If needed for microaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-10 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-2 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-20 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-200 micro pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Or other tube suitable for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-Lok Filter&#160; - 47mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (50x) concentrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1332500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td>
			<td>Northeast Laboratory Services</td>
			<td>P1100</td>
			<td>Or other agar plate sufficient for growth of host organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>211825</td>
			<td>Or other growth media suitable for target organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>Coy Laboratories</td>
			<td>032714</td>
			<td>If needed for anaerobic organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing stable binary cultures of symbiotic saccharibacteria from the oral cavity

Birçok bakteri türü standart yöntemler kullanılarak laboratuvarda kültürlenemez ve yeryüzündeki mikrobiyal çeşitliliğin çoğunluğunu incelemek için önemli bir engel oluşturur. Bu kültürsüz bakterileri kültüre etmek için yeni yaklaşımlar gereklidir, böylece araştırmacılar laboratuvarda bulunan güçlü araçları kullanarak fizyolojilerini ve yaşam tarzlarını etkili bir şekilde inceleyebilirler. Aday Phyla Radyasyon (CPR), dünyadaki canlı çeşitliliğinin ~ % 15'ini oluşturan en büyük kültürsüz bakteri gruplarından biridir. Bu grubun ilk izole saccharibacteria phylum bir üyesi oldu, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x bakteri konakçısı, Schaalia odontolytica, suş XH001 ile doğrudan temas halinde bir symbiont olarak yaşayan alışılmadık derecede küçük bir bakteridir. Alışılmadık derecede küçük hücre boyutundan ve simbiyotik bir organizma olarak yaşam tarzından yararlanarak, Saccharibacteria'yı diş plağını hızla kültüre etmek için bir protokol geliştirdik. Bu protokol, diş plağının askıya alınmasının 0,2 μm filtreden nasıl filtrelanacağını, daha sonra toplanan Saccharibacteria hücrelerinin nasıl konsantre olacağını ve konak organizma kültürünün nasıl enfekte olacağını gösterecektir. Ortaya çıkan kokültür, herhangi bir normal bakteri kültürü ve enfeksiyon PCR tarafından doğrulandıkça geçiş yapılabilir. Elde edilen ikili kültür laboratuvarda korunabilir ve gelecekteki deneyler için kullanılabilir. Kontaminasyon bir olasılık olsa da, ikili kültür, konağın daha fazla filtre edilmesi ve yeniden enfekte edilmesi veya ikili kültürün kaplanması ve enfekte koloniler için tarama ile arındırılabilir. Umarız bu protokol diğer örnek türlere ve ortamlara genişletilebilir ve cpr'da daha birçok türün yetiştirilmesine yol açabilir.

Saccharibacteria'nın tespiti için PCR, saccharibacteria symbionts sayısının düşüklüğü nedeniyle ilk enfeksiyon kültürlerinde negatif görünebilir (yani, hiçbir ürün görülmez). Bununla birlikte, birkaç pasajdan sonra, kararlı bir enfeksiyonun meydana geldiğini gösteren güçlü bir PCR ürünü görünmelidir (Şekil 1A). Tersine, bazı enfeksiyonlar başlangıçta PCR tarafından pozitif görünecektir, ancak 1-4 pasajdan sonra tespit edilemeyene kadar azalacaktır (gösterilmez). Bu, ilk filtratta çok miktarda Saccharibacteria hücresinin bulunduğunu, ancak geçişle seyreltildiğini ve hiçbirinin konak kültürü ile istikrarlı bir simbiyoz içine giremediğini göstermektedir. Ağız boşluğundan aynı Saccharibacteria filtratı ile birkaç konak türünün test etmek, symbiont-konak etkileşimi çok spesifik olduğu için genellikle düşük bir başarı oranına (Şekil 1B) sahip olacaktır. Bir araştırmacı aynı konağı birkaç farklı konudan filtratlarla da test edebilir. İyi bir konak organizma (Araknia propionica veya Schaalia odontolyticagibi) kullanılırsa, % 50'lik bir başarı oranı beklenebilir.
PCR tarafından test etmek çok önemlidir. Deneyimli araştırmacılar, sadece yanlış pozitifleri bildirmek için mikroskopi ile enfeksiyonu doğrulamaya çalıştılar. Saccharibacteria hücreleri küçüktür ve veziklinler veya düzensiz hücre zarf çıkıntıları arasında ayırt etmek zordur. Birkaç geçitten stabil bir PCR sinyali, başarılı bir enfeksiyonu doğrulamak için anahtardır.
Enfekte kültürler büyüdükçe, normal bulanık büyüme ortaya çıkmalıdır. Simbiyoz kendini kurdukça, enfekte kültürler enfekte olmayan konak organizmaların kültürlerinden daha az bulanık görünecektir (Şekil 2A). Bazı durumlarda, enfekte kültürler tamamen büyümeyi durduruyor ve hiç bulanıklaşmamış gibi görünebilir. Bunun nedeni, Saccharibacteria hücrelerinin konak organizmayı bunalttığı bir enfeksiyon olabilir. Bu kültürlere "taze" (enfekte olmayan) konak eklemek, Saccharibacteria parazitlerinin sürekli büyümesini desteklemek için yeterli bir konak popülasyonu sağlamalıdır.
Aşırı büyüme veya aşırı bulanık kültürler, bir laboratuvar kirleticisi veya 0,2 μm filtreden geçebilen başka bir küçük oral bakteri tarafından kontaminasyona işaret edebilir. Campylobacter ve Capnocytophaga spp. bu deneylerin tipik oral kirleticileridir. Bu, kültürün kapılması ve konak organizmanın atipik kolonilerinin ve ardından 16S rRNA dizilimi ile doğrulanabilir. Kontaminasyon görülürse, bu kültürlerin 0,2 μm filtreden süzgeci genellikle kirleticileri gidermek için yeterlidir. Filtrattaki sakkaribacteria hücreleri santrifüjleme ile konsantre edilebilir ve saf bir konak kültürünü yeniden enfekte etmek için kullanılabilir.
Kontamine bir kültürü arındırmanın bir başka yolu da enfekte olmuş kolonileri enfekte bir kültürü kaplamaktan toplamaktır. Enfekte konakların kolonileri bazen enfekte olmayan kolonilere kıyasla düzensiz koloni şekli ile tanımlanabilir (Şekil 2B-D). Bu düzensiz koloniler ikili kültürde Saccharibacteria titreye bağlıdır ve titre düşükse kolonilerin daha küçük bir kısmı düzensiz görünecektir. Bu, saf bir ikili kültürü başlatmak için toplanabilen ve kullanılabilen enfekte kolonileri tanımlamayı kolaylaştırabilir. Sakkaripacteria enfekte kültüründen kaplamada düzensiz koloni görülmezse, symbiont'un düşük bir titrede olması veya düzensiz şekilli kolonilere neden olmaması mümkündür. Böyle bir durumda, normal bir görünüme sahip PCR tarama kolonileri Saccharibacteria tarafından enfeksiyon gösterebilir, ancak düşük bir oranda (tüm kolonilerin% 2-10'u).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Şekil 1: Konak kültürlerin Saccharibacteria enfeksiyonlarının tipik PCR sonuçları. (A) Saccharibacteria varlığını gösteren bir PCR ürünü ilk enfeksiyonla görünmeyebilir, ancak kokültür kendini kurdukça sonraki pasajlarda ortaya çıkabilir ve güçlenebilir. (B) Sakkarakteri ile zenginleştirilmiş filtrat ile enfekte olan çoğu konak, simbiyozun özgüllüğü nedeniyle büyümelerini desteklemez. Bu örnekte, yalnızca A. propionica başarıyla enfekte oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Şekil 2: Saccharibacteria enfekte kültürlerinin büyüme özellikleri. (A) Enfekte kültürü gösteren enfekte ve enfekte olmayan A. propionica kültürlerinin büyüme eğrileri, enfekte olmayan kontrolle aynı yoğunluğa büyümeyecek ve daha az bulanık görünecektir. (B-D) Kokültürlerin kaplaması, Saccharibateria enfeksiyonlarının neden olduğu düzensiz koloniler üretebilir. Düzensiz koloniler, kokültürdeki Saccharibacteria titresine göre orantılı olarak azalacaktır. (B) Yüksek düzeyde Saccharibacteria ile ev sahibi. (C) 10 kat seyreltilmiş Saccharibacteria (D) Enfekte olmayan konak kültürü. Beyaz oklar düzensiz koloni örneklerini gösterir. Ölçek çubuğu= 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity at JoVE.com

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Diş plaklarını filtre ederek ve konak bakterilerle birlikte kültleştirerek, saccharibacteria adlı yeni bakteriyel fitülümün yetiştirilmede zor olan üyelerini izole etmek için bir yöntem gösteriyoruz.

Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkarakterinin Kararlı İkili Kültürlerinin Kurulması

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Sakkaribakteri, uygun konak bakterilerle ortak kültür gerektiren zorunlu parazitlerdir. İnsan oral sakkaribacteria bilinen konak bakteri türleri kullanılarak çoğu birey için kolayca izole edilebilir gibi. Bu protokol, herhangi bir araştırmacının veya laboratuvarın ikili ortak kültürde kendi suşlarını izole etmesine izin verecektir.Bu teknik, çoğu mikrobiyolojik laboratuvarda bulunan basit cihazları ve ekipmanları kullanır ve altı sakkaribacteria türünü temsil eden 30'dan fazla izolat kültürü için başarıyla kullanılmıştır. Bu protokol, aday takip edilen diğer radyasyon türlerinin izolasyonu için yararlı olabilir, ayrıca uygun akrebakteri konakçılarının tespit edilip izole edilebilmesi durumunda farklı ortamlardan ve diğer memelilerden sakkaripacteria. Prosedürü gösteren andrew Collins olacak, laboratuvarımda doktora sonrası eski bir adam.Başlamak için, araknia propionica gibi konak bakteri kültürlerine başlayın ve erken sabit faza büyümeleri için yeterli zaman vardır. Kültürü başlatmak için, araknia propionica ile% 0.1 maya özü içeren iki ila beş mililitre triptik soya suyu aşılayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, filtre tutucuları palet kazınmış 0,2 mikrometre filtre membranları ile monte edin.Bunları folyoya sarın ve santrifüj tüpleri ve kapak montajları ile birlikte otomatik olarak sterilize edin. Steril olmayan yüzeylerle yanlışlıkla temas halinde ekstra malzemeleri sterilize edin. Diş eti hattı boyunca kazıyarak, steril bir kağıt noktası, zarif bir curette veya steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak diş plağını toplayın ve MRD veya PBS gibi uygun bir tampona aktarın.Daha fazla ilerlemeye hazır olana kadar numuneyi buzda tutun. Diş plağını küçük bir pipet ucu ile girdap ve pipetleme kombinasyonunu kullanarak güçlü bir şekilde yeniden depolayın, ardından yeniden sulandırılmış plak örneğini dokuz mililitre MRD tamponu içeren bir tüpe ekleyin. Aseptik teknik kullanarak steril bir filtre tertibatı dikkatlice çözün.Çeyrek dönüşü açın ve dişlerin düzgün bir şekilde takıldığından ve cihazın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için filtre tutucuyu yeniden sıkın. Bir şırınna kullanarak aparattan 10 mililitre MRD tamponu geçirerek zarı yıkayın. Numuneyi yıkanmış filtreye uygulamak için pistonu bir şırınnadan çıkarın ve filtre cihazına takın.Filtratı yakalamak için bu filtre cihazının altına steril bir santrifüj tüpü yerleştirin, ardından dağınık diş örneğini şırınna dökün ve filtreye yükleyin. Ardından numuneyi filtreden geçirmek için pistona hafif basınç uygulayın. Membranı 10 mililitre daha MRD tamponu ile yıkayın ve akışı filtrelenmiş numuneyle aynı tüpte toplayın.Sonra tüpü aseptik olarak kaplayın ve buzda tutun. Santrifüjlemeden sonra hücre peletinin yerini belirlemek için tüp ve kapakta bir yönlendirme işareti yapın. Tüpü üst taraftaki işaretle yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin ve numuneleri dört santigrat derecede bir saat boyunca 60.000 G'de santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, peletı tüpün üst tarafında tutarak süpernatantı dikkatlice dökün. Daha sonra peletı güçlü bir şekilde girdaplayarak bir ila iki mililitre MRD tamponunda yeniden depolar. Tüplere iki mililitre uygun büyüme ortamı alarak kültür tüpleri hazırlayın.Ardından, konak organizmaların 200 mikrolitre geceleme kültürünü ve her tüpe 100 ila 200 mikrolitre yeniden tasarlanmış filtrelenmiş numune ekleyin. Kombine numuneleri konak organizmaya uygun koşullar altında kuluçkaya yatırın. İkili kültürün 200 mikrolitresini yeni bir tüpte iki mililitre taze büyüme ortamına aktararak hücreleri her iki ila üç günde bir aktarın.Geçişli kültürler enfekte olmayan konak kültürünün 200 mikrolitresinde büyüme göstermiyorsa, hücreleri geçirirken aşılanmış tüpleri inkübatöre geri döndürün. PCR master'ın 24 mikrolitresi 0,2 mililitre PCR tüpüne karışır. Sakkaribacteria enfekte kültürünün bir mikroliterinde, tüpü bir Termo çevrimciye yerleştirin.PCR programını metin taslağında açıklandığı gibi ayarlayın. PCR ürünlerini %1 Agros jel üzerine yükleyin ve çalıştırın. Yaklaşık 600 bazlık bir bant sakkaribacteria varlığını doğrulayacaktır.Pozitif kültürlerin saflığını doğrulamak için, steril bir tamponda sakkaripacteria ortak kültürünün 10 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve bir agar plakasına 100 mikrolitre yayın. Kültürü uygun büyüme koşulları altında kuluçkaya yatırın ve kirletici organizmalar için gözlemleyin. Yaklaşık 600 bazlık bir bant sakkaribacteria varlığını doğrulayacaktır.PCR tespiti, sakkaribakteri sisyonlarının az sayıda olduğu için ilk enfeksiyon kültürlerinde negatif görünebilir. Bununla birlikte, birkaç pasajdan sonra, istikrarlı bir enfeksiyonun meydana geldiğini gösteren güçlü bir PCR ürünü görünmelidir. Aynı sakkaribacteria filtratı ile birkaç konak türü test etmek genellikle düşük bir başarı oranına sahip olacaktır.Symbiont konak etkileşimi çok spesifik olduğu için. Enfekte kültürler büyüdükçe, normal bulanık büyüme ortaya çıkmalıdır. Simbiyoz kendini kurdukça, enfekte kültürler enfekte olmayan konak organizmaların kültürlerinden daha az bulanık görünecektir.Kontamine bir kültür, kaplamadan sonra enfekte koloniler seçerek saflaştırılabilir. Enfekte koloniler bazen enfekte olmayan kolonilere kıyasla düzensiz bir koloni şekli ile tanımlanabilir. Düzenli bir koloninin oranı, ikili kültürdeki sakkaribacteria titreye bağlıdır.Titre düşükse, daha az koloni düzensiz görünecektir, bu da enfekte kolonileri seçmeyi ve saf bir ikili kültür başlatmayı kolaylaştırır. Kültürler birkaç pasaj için olumlu görünmeyebilir. Bu yüzden bazı hastalara ihtiyaç duyulacaktır.Ayrıca, kültürün dengesini bozabileceğinden ve sakkaripterinin ölümüne yol açabileceğinden, ikili kültürlerin kirlenmesini düzenli olarak kontrol etmek gerekir. İkili kültür her türlü laboratuvar deneyi için kullanılabilir. Genom dizilimi ve transkriptom analizi için sırasıyla DNA ve RNA çıkarılabilir.Patojenite hayvan modelleri kullanılarak da araştırılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

Oküler Hastalıkları Model kurulması için intravitreal enjeksiyon

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

Yüzey EMG EPP Bileşeni çıkarımı

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Hawaii Bobteylleri Squid Hemocytes Alınması Euprymna scolopes Ve Simbiyotik ve Non-Simbiyotik Bakteriler bağlılık Gözlem

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...