Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

نود أن نشكر مختبر ويلان على توفير فيروس VSV-S-eGFP المستخدم في هذا البروتوكول بسخاء (الموصوف في الحالة وآخرون 2020). نشكر أيضا الدكتورين بيل كاميرون وجوثابورن كوان (والفريق) لجمع عينات دم المريض (معرف بروتوكول REB 20200371-01H). يكشف المؤلفون عن تلقي الدعم المالي التالي للبحث والتأليف و / أو نشر هذه المقالة: تم تمويل هذا العمل من الدعم السخي من مؤسسة مستشفى أوتاوا ومنحة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (#448323) ومنحة سريعة من مؤسسة Thistledown للعلوم COVID-19 إلى C.S.I. T.R.J. يتم تمويلها من منحة أونتاريو للدراسات العليا وزمالة Mitacs العنقودية. يتم تمويل JP من قبل زمالة Mitacs العنقودية. T.A. ممولة من زمالة CIHR Banting. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة.

1. خلايا الطلاء (اليوم 1) لإنتاج وتحديد كمي من الفيروس الزائف سارس-CoV-2
<ol><li>التحضير زراعة الأنسجة<ol>
<li>دافئ 1x دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS); دولبيكو النسر المعدل المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقدية (اختياري)؛ و 0.25٪ من حمض التتراكسيتيك تريبسين-إيثي...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

ويمكن تكييف الطريقة الموصوفة هنا لتناسب بيئات المختبر وموارده المختلفة حسب الحاجة. الأهم من ذلك، القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو ضرورة وجود مستوى الاحتواء 2 الفضاء والأنسجة غطاء محرك السيارة. إن تطبيق فيروس الحمض النووي الريبي المستنسخ الزائف مع ارتفاع السارس-CoV-2، مثل VSV-S-eGFP، هو بديل هائ...

في ديسمبر 2019 ، تم تحديد فيروس كورونا الجديد ، والذي نعرفه الآن باسم SARS-CoV-2 ، العامل المسبب لمرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19)1. سارس-كوف-2 هو فيروس بيتاكورونا ينتمي إلى عائلة كورونافيريداي. هذه الفيروسات المغلفة تضم جينوم الحمض النووي الريبي كبير إيجابي الإحساس وهي مسؤولة عن التهابات الجهاز التنفسي والأمعاء في كل من البشر والحيوانات2. وحتى مايو 2021، تم الإبلاغ عن أكثر من 157 مليون حالة إصابة ب COVID-19 على مستوى العالم وأكثر من 3.2 مليون حالة وفاة3. أصبح تطوير لقاح فعال الهدف الرئيسي للباحثين في جميع أنحاء العالم مع ما لا يقل عن 77 لقاحا قبل السريري قيد التحقيق و90 يخضع حاليا لتجارب سريرية4.
الفيروسات التاجية ترميز أربعة بروتينات الهيكلية بما في ذلك البروتين ارتفاع (S), nucleocapsid (N), بروتين المغلف (E), وبروتين الغشاء (M). دخول سارس-CoV-2 يتطلب التفاعل بين المجال مستقبلات ملزمة (RBD) من S مع مستقبلات المضيف, أنزيم تحويل الأنجيوتنسين الإنسان 2 (hACE2), وانصهار الغشاء اللاحقة بعد انشقاق بروتيوليتيك بواسطة بروتياز سيرين الخلوية المضيفة, transmembrane protease سيرين 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . وقد تم الإبلاغ سابقا عن المناعية الفكاهية للبروتين S من السارس-CoV وقد ثبت الآن أيضا للسارس-CoV-211,12,13. في الواقع ، تم الكشف عن تحييد استجابات الأجسام المضادة ضد S في مصل النقاهة من مرضى السارس -CoV بعد 24 شهرا من العدوى14، مما يسلط الضوء على دورهم الحاسم في الاستجابة المناعية على المدى الطويل. وقد تم تحديد البروتين S كهدف لقاح واعدة، وبالتالي أصبح عنصرا رئيسيا في معظم اللقاحات قيد التطوير15،16.
وفي حين أن الكشف السريع عن تحييد الأجسام المضادة جانب حاسم من جوانب تطوير اللقاح، فإنه قد يلقي الضوء أيضا على معدل العدوى والمراقبة المصلية الوبائية في المناطق المتضررة17. النسخ المتماثل المختصة VSV الزائفة مع السارس-CoV-2 S glycoprotein, بدلا من البروتين البروتيني VSV البرية من نوع, لدراسة عدوى السارس-CoV-2 في إعدادات مستوى السلامة البيولوجية 2 تبرعت بلطف من قبل ويلان وزملاء العمل18. سيتم استخدام VSV التعبير عن ارتفاع (VSV-S) لتحديد استجابة الأجسام المضادة تحييد ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2. كما VSV-S المستخدمة هنا يعبر أيضا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (eGFP), قد يتم الكشف عن بؤر eGFP في غضون 24 ساعة لقياس العدوى, في حين أن تشكيل البلاك يمكن أن يستغرق 48 إلى 72 ساعة. ملخص هنا هو بروتوكول بسيط وفعال لتحديد قدرة مصل المريض النقاهة لتحييد العدوى VSV-S-eGFP. ويمكن أيضا تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستجواب العلاجات المحتملة الأخرى التي تهدف إلى تعطيل التفاعل الفيروسي المضيف للبروتين سارس-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

ومع استمرار تطور جائحة COVID-19 الناجمة عن الفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2)، أصبح من الواضح أن وجود أجسام مضادة لتحييد الفيروس قد يوفر الحماية من العدوى في المستقبل. وهكذا، ومع استمرار إنشاء وترجمة لقاحات فعالة من نوع COVID-19 بسرعة لم يسبق لها مثيل، فإن تطوير أساليب سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد السارس-CoV-2 سيصبح ذا أهمية متزايدة لتحديد الحماية طويلة الأجل من العدوى لكل من الأفراد المصابين سابقا والمحصنين. تصف هذه الورقة بروتوكولا عالي الإنتاجية باستخدام فيروس التهاب الفم الحويصلات (VSV) الزائف مع بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 لقياس وجود الأجسام المضادة المحايدة في مصل النقاهة من المرضى الذين تعافوا مؤخرا من COVID-19. إن استخدام فيروس زائف التكرار يلغي الحاجة إلى مرفق احتواء من المستوى 3 مطلوب للتعامل مع السارس-CoV-2، مما يجعل هذا البروتوكول في متناول أي مختبر من مستوى الاحتواء 2 تقريبا. استخدام شكل 96 جيدا يسمح للعديد من العينات ليتم تشغيلها في نفس الوقت مع وقت تحول قصير من 24 ساعة.

يحدد هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة للكشف عن تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين سارس-CoV-2 S عن طريق تثبيط عدوى الفيروس الزائف VSV-S-eGFP (قابلة للقياس الكمي عن طريق فقدان بؤر eGFP المكتشفة). يتم تصوير تمثيل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. من المستحسن استخدام الأجسام المضادة المتاحة ت?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

يحدد البروتوكول الموصوف هنا طريقة سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 من خلال تقييم قدرة عينات المصل النقاهة على منع العدوى عن طريق فيروس التهاب الفم الفلوري الأخضر المعزز المسمى بالبروتين المركبات الزائف مع ارتفاع الجليكوبروتين.

الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

وتوفر هذه الطريقة طريقة للإجابة على أحد الأسئلة الأكثر أهمية المتعلقة بلقاحات الفيروس التاجي-2 التي هي قيد التطوير. هل اللقاح قادر على الحصول على استجابة الأجسام المضادة المحايدة؟ والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن القيام به في مرفق من المستوى الثاني للاحتواء.كما أنها سريعة نسبيا وغير مكلفة، مما يجعلها مناسبة تماما لتحليل العديد من العينات في وقت واحد. مما يدل على إجراء حمض تحييد، لدينا ريكاردو ماريوس، وهو فني كبير في المختبر وتايلور جيميسون، وهو طالب دكتوراه دكتوراه. تبدأ بزراعة خلايا Vero E6 في DMEM تكملها 10٪ FBS في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لتمرير الخلايا، أولا غسلها عن طريق إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وهزاز بلطف الطبق أربع إلى خمس مرات. بعد أسبيراتينغ برنامج تلفزيوني، إضافة ثلاثة ملليلتر من EDTA تريبسين والصخور الطبق لضمان أن يتم تغطية السطح بأكمله قبل احتضانه في 37 درجة مئوية. بمجرد انفصال الخلايا، قم بتعطيل التريبسين بإضافة سبعة ملليلترات من DMEM تكملها 10٪ FBS، ثم إعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.إزالة التريبسين عن طريق الطرد المركزي و يستنشق supernatant دون إزعاج بيليه الخلية قبل إعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من DMEM الطازجة. بعد العد، إضافة ما يقرب من مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة إلى كل لوحة 15 سم واحتضان الثقافة لمدة يوم إلى يومين حتى الخلايا هي التقاء 100٪. لإعداد VSV ارتفاع EGFP الزائفة للتيتر، تصيب الخلايا في 0.01 تعدد العدوى مع فيروس الأسهم المخفف في 12 ملليلتر من DMEM خالية من المصل.بعد إضافة الفيروس، احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع هزاز عرضية. في نهاية الحضانة، استبدل الإنكولوم ب DMEM الطازجة المكملة ب 2٪ FBS و 20 كومة ملليمولار، ثم احتضن الخلايا عند 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استخدم مجهر الفلورسنت لتصور تعبير EGFP للخلايا المصابة.بمجرد ملاحظة تأثير اعتلال الخلايا واسعة النطاق وانفصال الخلية، وجمع الثقافة الفائقة وإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي. لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة ، أكوت supernatant قبل التخزين في ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد التيتر الفيروسي، لوحة خلايا Vero E6 في ست لوحات بئر في كثافة البذر من ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر واحتضان بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، قم بإعداد سلسلة تخفيف تسلسلية عشرة أضعاف من المخزون الفيروسي عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي المتوسطة إلى السبعة الصغيرة وإضافة 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي إلى الأنبوب الأول. بعد دوامة قصيرة، نقل 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى كل أنبوب لاحق، دوامة بين كل أنبوب. ثم استبدال supernatant في كل بئر من لوحة الثقافة E6 فيرو مع 500 ميكرولتر من 10 إلى ناقص الثانية إلى 10 إلى تخفيف الفيروسية السابعة ناقص.بعد حضانة لمدة 45 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية مع هزاز بلطف كل 15 دقيقة، واستبدال inoculum مع محلول تراكب واحتضان الخلايا في 34 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. في نهاية الحضانة ، لتصور لويحات عن طريق تلطيخ الكريستال البنفسجي ، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة اثنين من ملليلتر من 0.1 ٪ البنفسجي الكريستال إلى كل بئر. ضع الطبق على الروك لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة قبل غسل كل بئر بلطف مرتين مع PBS.بعد الغسيل الأخير، اسمح للصفائح بالجفاف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل استخدام التركيبة كما هو مبين لحساب تتر الفيروس في كل بئر في وحدات تشكيل البلاك لكل ملليلتر. للوحة الخلايا لإجراء فحص تحييد، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من خلايا Vero E6 إلى كل بئر من لوحة بئر 96 بكثافة ضعفين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر، واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، الحرارة تعطيل عينات مصل المريض ليتم اختبارها في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.ثم إعداد سلسلة تخفيف عشرة أضعاف من عينات مصل المريض في لوحة فارغة 96 زراعة أنسجة البئر عن طريق إضافة ثمانية ميكرولتر من المصل إلى 72 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل مع المضادات الحيوية في كل حسنا من الصف A.Then إضافة 40 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل إلى كل بئر من الصفوف B إلى G و 80 ميكرولتر إلى كل بئر من الصف H.Using ماصة متعددة القنوات 12 جيدا، خلط العينات في الصف A، ثم نقل 40 ميكرولتر من العينة من كل بئر من الصف A إلى كل بئر من الصف B.After خلط، كرر التخفيف لكل صف لاحق من الآبار حتى الصف F.Next، إضافة 40 ميكرولتر من VSV ارتفاع EGFP في 0.05 تعدد العدوى إلى كل بئر في الصفوف من ألف إلى زاي، وتخلط عن طريق الأنابيب أربع إلى خمس مرات قبل احتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة ، يستنشق بعناية الفائق من كل بئر من لوحة ثقافة Vero E6 ونقل 60 ميكرولتر من خليط فيروس الأجسام المضادة من كل بئر من لوحة تخفيف العينة إلى البئر المقابلة للوحة ثقافة الخلية. عندما يتم نقل جميع العينات، ضع لوحة زراعة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة مع هزاز كل 20 دقيقة.بعد اكتمال الحضانة، أضف 140 ميكرولتر من محلول تراكب كاربوكسي ميثيل سيلولوس إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلية ونقل اللوحة إلى حاضنة 34 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة، قم بتصوير اللوحات على صور فلورية آلية بطول موجي 488 نانومتر، واستخدم ميزة العد الآلي للصور لتحديد بؤرة EGFP الفردية. في هذا المثال التمثيلي، تم استخدام الأجسام المضادة المحايدة المتاحة تجاريا ضد مجال ربط مستقبلات الفيروس التاجي-سارس-2 كتحكم إيجابي، إلى جانب IgG كتحكم سلبي.تم حساب تثبيط النسبة المئوية استنادا إلى عدد بؤر EGFP التي تم اكتشافها عن طريق التصوير الفلوري. وقد أظهر تحييد الفيروس الزائف عن طريق عينات المرضى النقاهة التي تم جمعها بعد ثلاثة أشهر تقريبا من عدوى فيروس كورونا-2 أن المرضى في المستشفيات أظهروا زيادة في القدرة على تحييد المرضى مقارنة بأولئك الذين لم يحتاجوا إلى دخول المستشفى. يمكن استخدام هذا الإجراء أيضا لتقييم عوامل الوقاية والعلاج الأخرى COVID-19 التي تهدف إلى منع العدوى الفيروسية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

سريع، متعدد المراسل المزدوج IgG وIgM سارس-CoV-2 تحييد المقايسة لنظام تحليل التدفق متعددة الخرز القائم

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

الكشف عن الأجسام المضادة للمجال الملزمة للمستقبلات من سارس-CoV-2 باستخدام جهاز تقرير حيوي قائم على HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

الفيروسات الزائفة كأداة جزيئية لمراقبة الاستجابات المناعية الخلطية ضد SARS-CoV-2 عن طريق مقايسة التحييد

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...