Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Vi vil gerne takke Whelan-laboratoriet for generøst at levere VSV-S-eGFP-virus, der anvendes i denne protokol (beskrevet i sag et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for at indsamle patientens blodprøver (REB protokol ID 20200371-01H). Forfatterne afslører modtagelsen af følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskab og / eller offentliggørelse af denne artikel: Dette arbejde blev finansieret af den generøse støtte fra Ottawa Hospital Foundation og et tilskud fra canadian Institutes of Health Research (# 448323) og et Fast Grant fra Thistledown foundation for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansieret af et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs stipendium. JP er finansieret af en klynge Mitacs stipendium. T.A. er finansieret af en CIHR Banting Fellowship. Vi vil også gerne takke alle de personer, der deltog og donerede deres blodprøver til denne undersøgelse.

1. Platingceller (dag 1) til produktion og kvantificering af SARS-CoV-2 pseudovirus
<ol><li>Forberedelse til vævskultur<ol>
<li>Varm 1x Dulbeccos fosfat-buffered saltvand (DPBS); Dulbeccos Modificerede Eagle Medium (DMEM), der indeholder 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (valgfrit); og 0,25 % trypsin-ethylendiamin tetraacetsyre (EDTA) til 37 °C i et vandbad i ca. 15 min.</li>
		<li>Desinficer en vævskultur hætte med 70% ethanol, og læg vævskultur retter, Pasteur pipetter, og serologiske p...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

Den metode, der er beskrevet her, kan tilpasses til forskellige laboratoriemiljøer og ressourcer efter behov. Vigtigere, den vigtigste begrænsning af denne protokol er nødvendigheden af en indeslutning niveau 2 rum-og væv kultur hætte. Anvendelsen af en replikerende RNA-virus, der er pseudotype med SARS-CoV-2-spiken, såsom VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-virus, som kræver et indeslutningsniveau 3-arbejdsområde, men kan forblive en begrænsning for nogle grupper. Alle andre trin, der er bes...

I december 2019 blev der konstateret en ny coronavirus, som vi nu kender som SARS-CoV-2, der er årsagsmidlet til coronavirussen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er en betacoronavirus, der tilhører Coronaviridae-familien. Disse indhyllede vira omfatter et stort RNA-genom med positiv sans og er ansvarlige for luft- og tarminfektioner hos både mennesker og dyr2. I maj 2021 har der været mere end 157 millioner rapporterede tilfælde af covid-19 globalt og mere end 3,2 millioner dødsfald3. Udviklingen af en effektiv vaccine er blevet det primære mål for forskere over hele kloden med mindst 77 prækliniske vacciner under undersøgelse og 90 i øjeblikket gennemgår kliniske forsøg4.
Coronavirusser koder fire strukturelle proteiner, herunder spikeproteinet (S), nukleocapsid (N), konvolutprotein (E) og membranproteinet (M). Indtastning af SARS-CoV-2 kræver interaktion mellem det receptorbindende domæne (RBD) i S med værtsreceptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og efterfølgende membranfusion efter proteolytisk kavalergang ved værts cellulær serineprotease, transmembran protease serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humoristisk immundominanceans af S-proteinet af SARS-CoV er tidligere blevet rapporteret og er nu også blevet vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk er neutraliserende antistofresponser mod S blevet påvist i rekonvalescent serum fra SARS-CoV-patienter 24 måneder efter infektion14, hvilket fremhæver deres kritiske rolle i det langsigtede immunrespons. S-proteinet er blevet identificeret som et lovende vaccinemål og er således blevet en nøglekomponent i de fleste vacciner under udvikling15,16.
Mens den hurtige påvisning af neutraliserende antistoffer er et kritisk aspekt af vaccineudviklingen, kan det også kaste lys over infektionsraten og sero-epidemiologisk overvågning i påvirkede områder17. En replikation-kompetent VSV pseudotyped med SARS-CoV-2 S glycoprotein, i stedet for den vilde type VSV glycoprotein, at studere SARS-CoV-2 infektion i biosikkerhed niveau 2 indstillinger blev venligt doneret af Whelan og kolleger18. VSV udtrykke spike (VSV-S) vil blive udnyttet til at bestemme neutralisere antistofrespons mod SARS-CoV-2 spike protein. Da VSV-S, der anvendes her, også udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP foci påvises inden for 24 timer for at kvantificere infektion, mens plaquedannelse kan tage 48 til 72 timer. Sammenfattet her er en enkel og effektiv protokol til at bestemme evnen til rekonvalescent patient serum til at neutralisere VSV-S-eGFP infektion. Denne metode kan også let tilpasses til at afhøre andre potentielle terapeutiske midler, der har til formål at forstyrre værts-viral interaktion af SARS-CoV-2 S protein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

I takt med at COVID-19-pandemien forårsaget af alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsætter med at udvikle sig, er det blevet tydeligt, at tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer mod virusset kan give beskyttelse mod fremtidig infektion. Efterhånden som oprettelsen og oversættelsen af effektive COVID-19-vacciner fortsætter med et hidtil uset tempo, vil udviklingen af hurtige og effektive metoder til måling af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 blive stadig vigtigere for at bestemme langsigtet beskyttelse mod infektion for både tidligere smittede og immuniserede individer. Dette papir beskriver en protokol med høj gennemløb ved hjælp af vesikulær stomatitisvirus (VSV), der er pseudotypen med SARS-CoV-2 spikeproteinet for at måle tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer i rekonvalescent serum fra patienter, der for nylig er kommet sig efter COVID-19. Brugen af en replikerende pseudotypevirus eliminerer behovet for en indeslutningsniveau 3-facilitet, der kræves til SARS-CoV-2-håndtering, hvilket gør denne protokol tilgængelig for stort set ethvert indeslutningsniveau 2-laboratorium. Brugen af et 96-brønds format gør det muligt at køre mange prøver på samme tid med en kort ekspeditionstid på 24 timer.

Denne protokol skitserer en hurtig og effektiv metode til påvisning af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 S protein via hæmning af VSV-S-eGFP pseudovirusinfektion (kvantificerbar ved tab af eGFP foci opdaget). En skematisk repræsentation af protokollen er afbildet i figur 1. Det anbefales, at et kommercielt tilgængeligt antistof anvendes som en positiv kontrol, hver gang analysen køres for at sikre konsistensen af analysen. Her demonstrerer vi en fortyndingskurve ved hjælp af e...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Den protokol, der er beskrevet her skitserer en hurtig og effektiv metode til måling neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 spike protein ved at evaluere evnen af rekonvalescerende serum prøver til at hæmme infektion med en forbedret grøn fluorescerende protein-mærket vesikulær stomatitis virus pseudotypeeret med spike glycoprotein.

Påvisning af SARS-CoV-2 neutraliserende antistoffer ved hjælp af fluorescerende billeddannelse af pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Denne metode giver en måde at besvare et af de mere vigtige spørgsmål vedrørende sars-coronavirus-2 vacciner under udvikling. Er vaccinen i stand til at fremkalde et neutraliserende antistofrespons? Den største fordel ved denne teknik er, at det kan gøres i en indeslutning niveau to facilitet.Det er også relativt hurtigt og billigt, hvilket gør det velegnet til at analysere mange prøver på én gang. Viser neutraliserende syre procedure, vi har Ricardo Marius, en ledende tekniker i laboratoriet og Taylor Jamieson, en MD ph.d.-studerende. Begynd med at dyrke Vero E6-celler i DMEM suppleret med 10% FBS ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.For at passere cellerne skal du først vaske dem ved at tilføje 10 milliliter PBS og forsigtigt rokke skålen fire til fem gange. Efter at have aspireret PBS, tilsæt tre milliliter trypsin EDTA og rock skålen for at sikre, at hele overfladen er dækket, før inkubation det ved 37 grader Celsius. Når cellerne er løsnet, deaktivere trypsin ved at tilføje syv milliliter AF DMEM suppleret med 10% FBS, derefter genbruge cellerne ved pipetter op og ned flere gange.Fjern trypsinen ved centrifugering og aspirer supernatanten uden at forstyrre cellepillen, før cellerne genoplives i 10 milliliter frisk DMEM. Efter optælling, tilsæt ca. en gang 10 til de syvende celler til hver 15 centimeter plade og inkubere kulturen i en til to dage, indtil cellerne er 100% sammenflyttede. For at forberede VSV spike EGFP pseudovirus til titering, inficere cellerne på 0,01 mangfoldighed af infektion med bestanden virus fortyndet i 12 milliliter serum-fri DMEM.Efter tilsætning af virus, inkubere cellerne i en time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med lejlighedsvis vuggende. I slutningen af inkubationen skal inoculum erstattes med frisk DMEM suppleret med 2% FBS og 20 millimolar dynger, og inkuberer derefter cellerne ved 34 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer. Den næste dag skal du bruge et fluorescerende mikroskop til at visualisere EGFP-udtrykket af de inficerede celler.Når en omfattende cytoppatisk effekt og celleløsning er observeret, indsamle kulturen supernatant og fjerne snavs ved centrifugering. For at undgå flere fryse-optøningscyklusser skal supernatanten aliquots før opbevaring ved minus 80 grader Celsius. For at bestemme den virale titer, plade Vero E6 celler i seks brønd plader ved en såning densitet på seks gange 10 til den femte celler pr brønd og inkubere natten over.Den næste dag, oprette en tidobbelt serie af virusbestanden ved at tilføje 900 mikroliter af medium til syv mikro-centrifuge rør og tilføje 100 mikroliter af viral lager til det første rør. Efter kort hvirvlen overføres 100 mikroliter fortyndet virus til hvert efterfølgende rør, der hvirvler mellem hvert rør. Udskift derefter supernatanten i hver brønd af Vero E6-kulturpladen med 500 mikroliter af 10 til minus sekundet til 10 til minus syvende virale fortyndinger.Efter en 45 minutters inkubation i cellekulturinkubatoren med forsigtigt vuggende hvert 15. minut, erstatte inoculum med en overlejringsopløsning og inkubere cellerne ved 34 grader Celsius med 5% kuldioxid i 48 timer. I slutningen af inkubationen, for at visualisere plaques ved krystal violet farvning, vask cellerne en gang med PBS, før du tilføjer to milliliter på 0,1% krystal violet til hver brønd. Placer pladen på en rocker i ca. 20 minutter ved stuetemperatur, før du forsigtigt vasker hver brønd to gange med PBS.Efter den sidste vask skal pladerne lufttørre i mindst en time, før du bruger formlen som angivet til at beregne virusets titer i hver brønd i plakdannende enheder pr. milliliter. Til pladeceller til en neutraliseringsanalyse skal du bruge en multikanalpipette til at tilføje 100 mikroliter af Vero E6-celler til hver brønd af en 96 brøndplade ved en tæthed på to gange 10 til de femte celler pr. milliliter og inkubere pladen i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den følgende dag inaktiverer varme patient serumprøverne, der skal testes i et 56 grader Celsius vandbad i 30 minutter.Derefter oprette en tidobbelt fortynding serie af patientens serum prøver i en tom 96 brønd væv kultur plade ved at tilføje otte mikroliters af serum til 72 mikroliter af serum-fri DMEM med antibiotika i hver brønd i række A.Derefter tilføje 40 mikroliter af serum-fri DMEM til hver brønd af række B til G og 80 mikroliters til hver brønd af række H.Using en 12 godt multikanal pipette, blande prøverne i række A, derefter overføre 40 mikroliter af prøven fra hver brønd i række A til hver brønd i række B.Efter blanding, gentag fortyndingen for hver efterfølgende række af brønde indtil række F.Next, tilføje 40 mikroliter af VSV spike EGFP på 0,05 multiplicitet af infektion til hver brønd i række A til G, og bland ved pipettering fire til fem gange, før inkubation af pladen i en time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. I slutningen af inkubationen skal supernatanten forsigtigt aspirere supernatanten fra hver brønd af Vero E6-kulturpladen og overføre 60 mikroliters antistofvirusblanding fra hver brønd af prøvefortyndingspladen til cellekulturpladens tilsvarende brønd. Når alle prøverne er blevet overført, skal du placere cellekulturpladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en time med vuggende hvert 20. minut.Når inkubationen er færdig, tilsættes 140 mikroliter af carboxymethylcellulose overlejringsopløsning til hver brønd af cellekulturpladen og overfør pladen til en 34 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator. Efter 24 timer skal du afbilde pladerne på en automatiseret fluorescerende billedtør ved 488 nanometer bølgelængde og bruge billedets automatiske tællefunktion til at kvantificere den enkelte EGFP foci. I dette repræsentative eksempel blev et kommercielt tilgængeligt neutraliserende antistof mod SARS-coronavirus-2 spike receptorbindingsdomænet brugt som en positiv kontrol sammen med IgG som en negativ kontrol.Procenthæmningen blev beregnet på grundlag af antallet af EGFP foci, der blev påvist via fluorescerende billeddannelse. Pseudovirusneutralisering ved rekonvalescerende patientprøver indsamlet cirka tre måneder efter SARS-coronavirus-2-infektion viste, at indlagte patienter udviste en øget neutraliserende kapacitet sammenlignet med dem, der ikke krævede indlæggelse. Denne procedure kan også bruges til at evaluere andre covid-19 forebyggelse og terapeutiske midler, der har til formål at blokere virusinfektion.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation af undslippe varianter af neutraliserende Influenza Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En hurtig, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 neutralisering Assay for en multiplexed perle-baseret Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Påvisning af SARS-CoV-2 receptorbindende domæneantistof ved hjælp af en HiBiT-baseret bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkriptase PCR spytdiagnostisk strategi ved hjælp af open source pipetteringsrobotter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypede vira som et molekylært værktøj til overvågning af humorale immunresponser mod SARS-CoV-2 via neutraliseringsanalyse

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...