Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

We willen het Whelan-lab bedanken voor het genereus leveren van het VSV-S-eGFP-virus dat in dit protocol wordt gebruikt (beschreven in Case et al. 2020). We bedanken ook Drs. Bill Cameron en Juthaporn Cowan (en team) voor het verzamelen van de bloedmonsters van de patiënt (REB-protocol ID 20200371-01H). De auteurs onthullen de ontvangst van de volgende financiële steun voor het onderzoek, auteurschap en / of publicatie van dit artikel: Dit werk werd gefinancierd door de genereuze steun van de Ottawa Hospital Foundation en een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (# 448323) en een Fast Grant van de Thistledown Foundation for COVID-19 Science aan C.S.I. T.R.J. wordt gefinancierd door een Ontario Graduate Scholarship en cluster Mitacs fellowship. JP wordt gefinancierd door een cluster Mitacs fellowship. T.A. wordt gefinancierd door een CIHR Banting Fellowship. We willen ook alle personen bedanken die hebben deelgenomen en hun bloedmonsters hebben gedoneerd voor deze studie.

1. Plating cellen (Dag 1) voor de productie en kwantificering van SARS-CoV-2 pseudovirus
<ol><li>Voorbereiding op weefselkweek<ol>
<li>Warm 1x Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% Foetaal Runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (optioneel); en 0,25% trypsine-ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) tot 37 °C in een waterbad gedurende ongeveer 15 minuten.</li>
		<li>Desinfecteer een weefselkweekkap met 70% ethanol en plaats indien nodig weefselkweek...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

De hier beschreven methode kan indien nodig worden aangepast aan verschillende laboratoriumomgevingen en -middelen. Belangrijk is dat de belangrijkste beperking van dit protocol de noodzaak is voor een containment niveau 2 ruimte en weefselkweekkap. De toepassing van een replicerend RNA-virus pseudotypeerd met de SARS-CoV-2-piek, zoals VSV-S-eGFP, is een formidabel alternatief voor het SARS-CoV-2-virus, dat een inperkingsniveau 3-werkgebied vereist, maar voor sommige groepen een beperking kan blijven. Alle andere stappen...

In december 2019 werd een nieuw coronavirus geïdentificeerd, dat we nu kennen als SARS-CoV-2, de veroorzaker van coronavirusziekte 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 is een betacoronavirus dat behoort tot de familie Coronaviridae. Deze omhulde virussen bestaan uit een groot positief-zintuigig RNA-genoom en zijn verantwoordelijk voor luchtweg- en darminfecties bij zowel mens als dier2. Vanaf mei 2021 zijn er wereldwijd meer dan 157 miljoen gemelde gevallen van COVID-19 en meer dan 3,2 miljoen sterfgevallen3. De ontwikkeling van een effectief vaccin is het primaire doel geworden van onderzoekers over de hele wereld met ten minste 77 preklinische vaccins die worden onderzocht en 90 die momenteel klinische proeven ondergaan4.
Coronavirussen coderen voor vier structurele eiwitten, waaronder het spike-eiwit (S), nucleocapsid (N), envelope-eiwit (E) en het membraaneiwit (M). Binnenkomst van SARS-CoV-2 vereist interactie van het receptorbindende domein (RBD) van S met de gastheerreceptor, humaan angiotensine-converterend enzym 2 (hACE2) en daaropvolgende membraanfusie na proteolytische splitsing door gastheercellulair serineprotease, transmembraanprotease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humorale immunodominantie van het S-eiwit van SARS-CoV is eerder gemeld en is nu ook aangetoond voor SARS-CoV-211,12,13. Inderdaad, neutraliserende antilichaamresponsen tegen S zijn gedetecteerd in herstellend serum van SARS-CoV-patiënten 24 maanden na infectie14, wat hun kritieke rol in de immuunrespons op lange termijn benadrukt. Het S-eiwit is geïdentificeerd als een veelbelovend vaccindoel en is dus een belangrijk onderdeel geworden van de meeste vaccins in ontwikkeling15,16.
Hoewel de snelle detectie van neutraliserende antilichamen een cruciaal aspect is van de ontwikkeling van vaccins, kan het ook licht werpen op de snelheid van infectie en sero-epidemiologische surveillance in getroffen gebieden17. Een replicatie-competente VSV pseudotype met het SARS-CoV-2 S glycoproteïne, in plaats van het wild-type VSV glycoproteïne, om SARS-CoV-2 infectie in bioveiligheidsniveau 2 instellingen te bestuderen, werd vriendelijk gedoneerd door Whelan en collega's18. VSV expressing spike (VSV-S) zal worden gebruikt om de neutraliserende antilichaamrespons tegen SARS-CoV-2 spike-eiwit te bepalen. Omdat de VSV-S die hier wordt gebruikt ook verrijkt groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengt, kunnen eGFP-foci binnen 24 uur worden gedetecteerd om infectie te kwantificeren, terwijl plaquevorming 48 tot 72 uur kan duren. Hier samengevat is een eenvoudig en effectief protocol om het vermogen van herstellend patiëntenserum te bepalen om VSV-S-eGFP-infectie te neutraliseren. Deze methode kan ook gemakkelijk worden aangepast om andere potentiële therapieën te ondervragen die gericht zijn op het verstoren van de gastheer-virale interactie van SARS-CoV-2 S-eiwit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

Naarmate de COVID-19-pandemie veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) blijft evolueren, is het duidelijk geworden dat de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen tegen het virus bescherming kan bieden tegen toekomstige infecties. Dus, naarmate de creatie en vertaling van effectieve COVID-19-vaccins met een ongekende snelheid doorgaat, zal de ontwikkeling van snelle en effectieve methoden om neutraliserende antilichamen tegen SARS-CoV-2 te meten steeds belangrijker worden om de bescherming op lange termijn tegen infectie te bepalen voor zowel eerder geïnfecteerde als geïmmuniseerde personen. Dit artikel beschrijft een high-throughput protocol met behulp van vesiculaire stomatitis virus (VSV) pseudotyped met het SARS-CoV-2 spike-eiwit om de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen in herstellend serum te meten van patiënten die onlangs zijn hersteld van COVID-19. Het gebruik van een replicerend pseudotyped virus elimineert de noodzaak voor een containment level 3-faciliteit die nodig is voor SARS-CoV-2-behandeling, waardoor dit protocol toegankelijk is voor vrijwel elk containment level 2-lab. Het gebruik van een 96-well formaat maakt het mogelijk om veel samples tegelijkertijd uit te voeren met een korte doorlooptijd van 24 uur.

Dit protocol schetst een snelle en effectieve methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen tegen SARS-CoV-2 S-eiwit via remming van VSV-S-eGFP pseudovirusinfectie (kwantificeerbaar door verlies van gedetecteerde eGFP-foci). Een schematische weergave van het protocol is weergegeven in figuur 1. Het wordt aanbevolen om een in de handel verkrijgbaar antilichaam te gebruiken als een positieve controle telkens wanneer de test wordt uitgevoerd om de consistentie van de test te waar...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Het hier beschreven protocol schetst een snelle en effectieve methode voor het meten van neutraliserende antilichamen tegen het SARS-CoV-2 spike-eiwit door het vermogen van herstellende serummonsters te evalueren om infectie te remmen door een verbeterd groen fluorescerend eiwit-gelabeld vesiculaire stomatitisvirus pseudotyped met spike glycoproteïne.

Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Deze methode biedt een manier om een van de belangrijkere vragen over de SARS-coronavirus-2-vaccins in ontwikkeling te beantwoorden. Is het vaccin in staat om een neutraliserende antilichaamrespons uit te lokken? Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gedaan in een containment niveau twee faciliteit.Het is ook relatief snel en goedkoop, waardoor het zeer geschikt is om veel monsters tegelijk te analyseren. Om de neutraliserende zuurprocedure te demonstreren, hebben we Ricardo Marius, een senior technicus in het laboratorium en Taylor Jamieson, een MD PhD-student. Begin met het kweken van Vero E6-cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Om de cellen te passeren, wast u ze eerst door 10 milliliter PBS toe te voegen en de schaal vier tot vijf keer voorzichtig te wiegen. Voeg na het aanzuigen van de PBS drie milliliter trypsine EDTA toe en laat de schaal schommelen om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak bedekt is voordat je het bij 37 graden Celsius incubeert. Zodra de cellen zich hebben losgemaakt, deactiveert u de trypsine door zeven milliliter DMEM toe te voegen, aangevuld met 10% FBS, en vervolgens de cellen opnieuw opsuspend door meerdere keren op en neer te pipetteren.Verwijder de trypsine door centrifugering en adem het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren voordat u de cellen opnieuw opsuspendeert in 10 milliliter verse DMEM. Voeg na het tellen ongeveer één keer 10 tot de zevende cellen toe aan elke plaat van 15 centimeter en incubeer de cultuur gedurende één tot twee dagen totdat de cellen 100% confluent zijn. Om het VSV spike EGFP pseudovirus voor te bereiden op titering, infecteer de cellen bij 0,01 multipliciteit van infectie met het stamvirus verdund in 12 milliliter serumvrije DMEM.Na het toevoegen van het virus, incubeer de cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met af en toe schommelen. Vervang aan het einde van de incubatie het entmateriaal door verse DMEM aangevuld met 2% FBS en 20 millimolaire hopen en incubeer vervolgens de cellen bij 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Gebruik de volgende dag een fluorescerende microscoop om de EGFP-expressie van de geïnfecteerde cellen te visualiseren.Zodra een uitgebreid cytopathisch effect en celdetachement zijn waargenomen, verzamelt u het kweeksupernatant en verwijdert u het puin door centrifugatie. Om meerdere vries-dooicycli te voorkomen, moet u het supernatant vóór opslag bij min 80 graden Celsius aliquoten. Om de virale titer te bepalen, vero E6-cellen in zes putplaten met een zaaidichtheid van zes keer 10 tot de vijfde cel per put en 's nachts incuberen.Stel de volgende dag een tienvoudige serie seriële verdunningsreeks van de virale voorraad in door 900 microliter medium toe te voegen aan zeven microcentrifugebuizen en 100 microliter virale voorraad toe te voegen aan de eerste buis. Breng na korte vortexing 100 microliter verdund virus over naar elke volgende buis, vortexing tussen elke buis. Vervang vervolgens het supernatant in elke put van de Vero E6-cultuurplaat door 500 microliter van de 10 tot de min seconde tot 10 tot de minus zevende virale verdunningen.Na een incubatie van 45 minuten in de celkweekincubator met zacht schommelen om de 15 minuten, vervang het ent het cellen bij 34 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur. Aan het einde van de incubatie, om de plaques door kristalvioletkleuring te visualiseren, wast u de cellen één keer met PBS voordat u twee milliliter van 0,1% kristalviolet aan elke put toevoegt. Leg de plaat ongeveer 20 minuten op een wip op kamertemperatuur voordat u elke put twee keer voorzichtig wast met PBS.Laat de platen na de laatste wasbeurt ten minste één uur aan de lucht drogen voordat u de formule gebruikt zoals aangegeven om de titer van het virus in elke put in plaquevormende eenheden per milliliter te berekenen. Om cellen te platen voor een neutralisatietest, gebruikt u een meerkanaalspipet om 100 microliter Vero E6-cellen toe te voegen aan elke put van een 96-putplaat met een dichtheid van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag inactiveert de warmte de serummonsters van de patiënt om gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 graden Celsius te worden getest.Stel vervolgens een tienvoudige verdunningsreeks van de serummonsters van de patiënt op in een lege 96 put weefselkweekplaat door acht microliter van het serum toe te voegen aan 72 microliter serumvrije DMEM met antibiotica in elke put van rij A.Voeg vervolgens 40 microliter serumvrije DMEM toe aan elke put van rijen B tot G en 80 microliter aan elke put van rij H.Gebruik een 12-put meerkanaalspipet, meng de monsters in rij A en breng vervolgens 40 microliter van het monster over van elke put van rij A naar elke put van rij B.Herhaal na het mengen de verdunning voor elke volgende rij putjes tot rij F.Voeg vervolgens 40 microliter VSV-spike EGFP met 0,05 multipliciteit van infectie toe aan elke put in rijen A tot en met G; en meng door vier tot vijf keer te pipetteren voordat je de plaat een uur lang incubeert bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Aspirateer aan het einde van de incubatie zorgvuldig het supernatant uit elke put van de Vero E6-cultuurplaat en breng 60 microliter antilichaamvirusmengsel over van elke put van de monsterverdunningsplaat naar de overeenkomstige put van de celkweekplaat. Wanneer alle monsters zijn overgebracht, plaatst u de celkweekplaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende een uur met schommelen om de 20 minuten.Nadat de incubatie is voltooid, voegt u 140 microliter carboxymethylcellulose-overlayoplossing toe aan elke put van de celkweekplaat en breng u de plaat over naar een incubator van 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng na 24 uur de platen in beeld op een geautomatiseerde fluorescerende imager met een golflengte van 488 nanometer en gebruik de geautomatiseerde telfunctie van de imager om de individuele EGFP-foci te kwantificeren. In dit representatieve voorbeeld werd een commercieel beschikbaar neutraliserend antilichaam tegen het SARS-coronavirus-2 spike receptor binding domein gebruikt als een positieve controle, naast IgG als een negatieve controle.De procentuele remming werd berekend op basis van het aantal EGFP-foci gedetecteerd via fluorescerende beeldvorming. Pseudovirusneutralisatie door herstellende patiëntmonsters verzameld ongeveer drie maanden na SARS-coronavirus-2-infectie toonde aan dat gehospitaliseerde patiënten een verhoogde neutraliserende capaciteit vertoonden in vergelijking met degenen die geen ziekenhuisopname nodig hadden. Deze procedure kan ook worden gebruikt om andere COVID-19-preventie en therapeutische middelen te evalueren die gericht zijn op het blokkeren van virale infecties.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Efficiënte SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Speeksel diagnostische strategie met behulp van Open-Source Pipetteerrobots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Gepseudotypeerde virussen als moleculair hulpmiddel om humorale immuunresponsen tegen SARS-CoV-2 te volgen via neutralisatietest

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...