Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
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Nous tenons à remercier le laboratoire Whelan d’avoir généreusement fourni le virus VSV-S-eGFP utilisé dans ce protocole (décrit dans Case et al. 2020). Nous remercions également les Drs Bill Cameron et Juthaporn Cowan (et leur équipe) d’avoir prélevé les échantillons de sang des patients (ID du protocole REB 20200371-01H). Les auteurs divulguent avoir reçu le soutien financier suivant pour la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : Ce travail a été financé par le généreux soutien de la Fondation de l’Hôpital d’Ottawa et une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (no 448323) et une subvention rapide de la Fondation Thistledown pour la science covid-19 au C.S.I. T.R.J. est financée par une bourse d’études supérieures de l’Ontario et une bourse Mitacs de grappe. JP est financé par une bourse Mitacs de cluster. T.A. est financé par une bourse d’interdiction des IRSC. Nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont participé et donné leurs échantillons de sang pour cette étude.

1. Cellules de placage (Jour 1) pour la production et la quantification du pseudovirus sars-CoV-2
<ol><li>Préparation à la culture tissulaire<ol>
<li>Réchauffez 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco; Le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (facultatif); et 0,25 % d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) à 37 °C au bain-marie pendant environ 15 min.</li>
		<li>Désinfectez une hotte de cul...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

La méthode décrite ici peut être adaptée pour s’adapter à divers environnements et ressources de laboratoire, selon les besoins. Il est important de se tromper que la principale limite de ce protocole est la nécessité d’un espace de confinement de niveau 2 et d’une hotte de culture tissulaire. L’application d’un virus à ARN répliquant pseudotypé avec le pic SARS-CoV-2, tel que VSV-S-eGFP, est une alternative redoutable au virus SARS-CoV-2, qui nécessite une zone de travail de niveau de confinement 3,...

En décembre 2019, un nouveau coronavirus a été identifié, que nous connaissons maintenant sous le nom de SARS-CoV-2, l’agent causal de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)1. Le SARS-CoV-2 est un bêtacoronavirus de la famille des Coronaviridae. Ces virus enveloppés comprennent un grand génome d’ARN à sens positif et sont responsables d’infections respiratoires et intestinales chez l’homme et l’animal2. En mai 2021, plus de 157 millions de cas de COVID-19 ont été signalés dans le monde et plus de 3,2 millions de décès3. Le développement d’un vaccin efficace est devenu l’objectif principal des chercheurs du monde entier avec au moins 77 vaccins précliniques à l’étude et 90 actuellement en cours d’essais cliniques4.
Les coronavirus codent quatre protéines structurelles, dont la protéine de pointe (S), la nucléocapside (N), la protéine d’enveloppe (E) et la protéine membranaire (M). L’entrée du SARS-CoV-2 nécessite une interaction du domaine de liaison au récepteur (RBD) de S avec le récepteur hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2), et la fusion membranaire ultérieure après clivage protéolytique par la sérine protéase cellulaire hôte, la sérine 2 (TMPRSS2) transmembranaire5,6,7,8,9,10 . L’immunodominance humorale de la protéine S du SARS-CoV a déjà été rapportée et a maintenant été démontrée également pour le SARS-CoV-211,12,13. En effet, des réponses d’anticorps neutralisants contre S ont été détectées dans le sérum de convalescence de patients atteints du SRAS-CoV 24 mois après l’infection14,soulignant leur rôle essentiel dans la réponse immunitaire à long terme. La protéine S a été identifiée comme une cible vaccinale prometteuse et est ainsi devenue un composant clé de la plupart des vaccins en cours de développement15,16.
Bien que la détection rapide des anticorps neutralisants soit un aspect critique de la mise au point d’un vaccin, elle peut également faire la lumière sur le taux d’infection et la surveillance séro-épidémiologique dans les zones touchées17. Un VSV compétent en réplication pseudotypé avec la glycoprotéine SARS-CoV-2 S, à la place de la glycoprotéine VSV de type sauvage, pour étudier l’infection par le SARS-CoV-2 dans des contextes de biosécurité de niveau 2 a été gentiment donné par Whelan et ses collègues18. Le pic d’expression vsV (VSV-S) sera utilisé pour déterminer la réponse des anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SARS-CoV-2. Comme le VSV-S utilisé ici exprime également la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), les foyers eGFP peuvent être détectés dans les 24 h pour quantifier l’infection, tandis que la formation de plaque peut prendre de 48 à 72 h. Résumé ici est un protocole simple et efficace pour déterminer la capacité du sérum de patient convalescent à neutraliser l’infection VSV-S-eGFP. Cette méthode peut également être facilement adaptée pour interroger d’autres thérapies potentielles qui visent à perturber l’interaction hôte-viral de la protéine SARS-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

Alors que la pandémie de COVID-19 causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) continue d’évoluer, il est devenu évident que la présence d’anticorps neutralisants contre le virus peut fournir une protection contre une infection future. Ainsi, alors que la création et la traduction de vaccins efficaces contre la COVID-19 se poursuivent à une vitesse sans précédent, le développement de méthodes rapides et efficaces pour mesurer les anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 deviendra de plus en plus important pour déterminer la protection à long terme contre l’infection des personnes précédemment infectées et immunisées. Cet article décrit un protocole à haut débit utilisant le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) pseudotypé avec la protéine de pointe sars-CoV-2 pour mesurer la présence d’anticorps neutralisants dans le sérum de convalescent de patients récemment guéris de la COVID-19. L’utilisation d’un virus pseudotypé répliquant élimine la nécessité d’une installation de niveau de confinement 3 requise pour la manipulation du SARS-CoV-2, ce qui rend ce protocole accessible à pratiquement n’importe quel laboratoire de niveau de confinement 2. L’utilisation d’un format de 96 puits permet d’exécuter de nombreux échantillons en même temps avec un court délai d’exécution de 24 h.

Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour détecter les anticorps neutralisants contre la protéine SARS-CoV-2 S via l’inhibition de l’infection par le pseudovirus VSV-S-eGFP (quantifiable par la perte de foyers eGFP détectés). Une représentation schématique du protocole est représentée à la figure 1. Il est recommandé d’utiliser un anticorps disponible dans le commerce comme témoin positif chaque fois que le test est effectué pour assurer la cohérence du tes...

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Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Le protocole décrit ici décrit décrit une méthode rapide et efficace pour mesurer les anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 en évaluant la capacité des échantillons de sérum de convalescent à inhiber l’infection par un virus de la stomatite vésiculeuse marqué par une protéine fluorescente verte améliorée pseudotypée avec une glycoprotéine de pointe.

Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Cette méthode permet de répondre à l’une des questions les plus importantes concernant les vaccins SARS-coronavirus-2 en cours de développement. Le vaccin est-il capable de provoquer une réponse d’anticorps neutralisants? Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être effectuée dans une installation de niveau de confinement deux.Il est également relativement rapide et peu coûteux, ce qui le rend bien adapté à l’analyse de plusieurs échantillons à la fois. Pour démontrer la procédure de neutralisation de l’acide, nous avons Ricardo Marius, un technicien principal dans le laboratoire et Taylor Jamieson, un étudiant au doctorat en médecine. Commencez par cultiver des cellules Vero E6 dans du DMEM complété par 10% FBS à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour passer les cellules, lavez-les d’abord en ajoutant 10 millilitres de PBS et en berçant doucement le plat quatre à cinq fois. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine EDTA et secouez le plat pour vous assurer que toute la surface est recouverte avant de l’incuber à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules détachées, désactivez la trypsine en ajoutant sept millilitres de DMEM complétés par 10% FBS, puis resuspendez les cellules en pipetant plusieurs fois.Retirer la trypsine par centrifugation et aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire avant de réutiliser les cellules dans 10 millilitres de DMEM frais. Après le comptage, ajoutez environ une fois 10 à la septième cellule à chaque plaque de 15 centimètres et incubez la culture pendant un à deux jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 100%. Pour préparer le pseudovirus VSV spike EGFP pour le titrage, infecter les cellules à 0,01 multiplicité d’infection avec le virus stock dilué dans 12 millilitres de DMEM sans sérum.Après avoir ajouté le virus, incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec des balancements occasionnels. À la fin de l’incubation, remplacez l’inoculum par du DMEM frais complété par 2% de FBS et des tas de 20 millimolaires, puis incubez les cellules à 34 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, utilisez un microscope fluorescent pour visualiser l’expression EGFP des cellules infectées.Une fois qu’un effet cytopathique étendu et un décollement cellulaire sont observés, collectez le surnageant de culture et éliminez les débris par centrifugation. Pour éviter de multiples cycles de gel-dégel, aliquotez le surnageant avant le stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer le titre viral, plaquez les cellules Vero E6 dans six plaques de puits à une densité d’ensemencement de six fois 10 à la cinquième cellule par puits et incubez pendant la nuit.Le lendemain, mettez en place une série de dilution en série décuplée du stock viral en ajoutant 900 microlitres de milieu à sept tubes de microcentrifugation et en ajoutant 100 microlitres de stock viral au premier tube. Après un bref vortex, transférer 100 microlitres de virus dilué dans chaque tube suivant, en vortexant entre chaque tube. Remplacez ensuite le surnageant dans chaque puits de la plaque de culture Vero E6 par 500 microlitres des dilutions virales 10 à moins seconde à 10 à moins septième.Après une incubation de 45 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire avec un balancement doux toutes les 15 minutes, remplacez l’inoculum par une solution de superposition et incubez les cellules à 34 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. À la fin de l’incubation, pour visualiser les plaques par coloration violette cristalline, lavez les cellules une fois avec du PBS avant d’ajouter deux millilitres de violet cristallin à 0,1% à chaque puits. Placez la plaque sur une bascule pendant environ 20 minutes à température ambiante avant de laver doucement chaque puits deux fois avec du PBS.Après le dernier lavage, laisser sécher les plaques à l’air libre pendant au moins une heure avant d’utiliser la formule indiquée pour calculer le titre du virus dans chaque puits en unités formant de la plaque par millilitre. Pour plaquer les cellules pour un test de neutralisation, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 microlitres de cellules Vero E6 à chaque puits d’une plaque de 96 puits à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, et incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, la chaleur inactive les échantillons de sérum du patient à tester dans un bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, mettez en place une série de dilution décuplée des échantillons de sérum du patient dans une plaque de culture tissulaire vide de 96 puits en ajoutant huit microlitres de sérum à 72 microlitres de DMEM sans sérum avec des antibiotiques dans chaque puits de la rangée A.Ajoutez ensuite 40 microlitres de DMEM sans sérum à chaque puits des rangées B à G et 80 microlitres à chaque puits de la rangée H.À l’aide d’une pipette multicanal à 12 puits, mélanger les échantillons de la rangée A, puis transférer 40 microlitres de l’échantillon de chaque puits de la rangée A à chaque puits de la rangée B.Après le mélange, répéter la dilution pour chaque rangée de puits suivante jusqu’à la rangée F.Ensuite, ajouter 40 microlitres d’EGFP à 0,05 multiplicité d’infection à chaque puits des rangées A à G, et mélanger en pipetant quatre à cinq fois avant d’incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, aspirer soigneusement le surnageant de chaque puits de la plaque de culture Vero E6 et transférer 60 microlitres de mélange de virus d’anticorps de chaque puits de la plaque de dilution de l’échantillon au puits correspondant de la plaque de culture cellulaire. Lorsque tous les échantillons ont été transférés, placez la plaque de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure avec un balancement toutes les 20 minutes.Une fois l’incubation terminée, ajoutez 140 microlitres de solution de superposition de carboxyméthylcellulose à chaque puits de la plaque de culture cellulaire et transférez la plaque dans un incubateur à 34 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, imagez les plaques sur un imageur fluorescent automatisé à une longueur d’onde de 488 nanomètres et utilisez la fonction de comptage automatisé de l’imageur pour quantifier les foyers EGFP individuels. Dans cet exemple représentatif, un anticorps neutralisant disponible dans le commerce contre le domaine de liaison du récepteur de pointe du SRAS-coronavirus-2 a été utilisé comme témoin positif, aux côtés des IgG comme témoin négatif.Le pourcentage d’inhibition a été calculé en fonction du nombre de foyers EGFP détectés par imagerie fluorescente. La neutralisation du pseudovirus par des échantillons de patients convalescents prélevés environ trois mois après l’infection par le SRAS-coronavirus-2 a montré que les patients hospitalisés présentaient une capacité de neutralisation accrue par rapport à ceux qui n’avaient pas besoin d’hospitalisation. Cette procédure peut également être utilisée pour évaluer d’autres agents de prévention et thérapeutiques de la COVID-19 qui visent à bloquer l’infection virale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

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Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

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Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

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