Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

ברצוננו להודות למעבדת וילן על שסיפקה בנדיבות את נגיף VSV-S-eGFP המשמש בפרוטוקול זה (המתואר במקרה ואח ' 2020). אנו מודים גם לד"ר ביל קמרון וג'ותאפורן קאוון (ולצוות) על איסוף דגימות הדם של המטופל (זיהוי פרוטוקול REB 20200371-01H). המחברים חושפים את קבלת התמיכה הכספית הבאה למחקר, המחבר ו/או הפרסום של מאמר זה: עבודה זו מומנה על ידי תמיכה נדיבה של קרן בית החולים אוטווה ומענק מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (#448323) ומענק מהיר מקרן גדילן למדע COVID-19 ל- C.S.I. T.R.J. ממומן על ידי מלגת בוגרים אונטריו ומלגת Mitacs אשכול. ג'יי.פי ממומן על ידי אחוות מיטקים מקבצי. T.A. ממומן על ידי אחוות CIHR בנטינג. ברצוננו גם להודות לכל האנשים שהשתתפו ותרמו את דגימות הדם שלהם למחקר זה.

1. תאי ציפוי (יום 1) לייצור וכימות של SARS-CoV-2 פסאודווירוס
<ol><li>הכנה לתרבות רקמות<ol>
<li>תמיסת מלח חמה עם חוצץ פוספט (DPBS); מדיום הנשר (DMEM) של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי); ו 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין טטראצטית חומצה (EDTA) עד 37 °C (5 °F) באמבט מים במשך כ 15 דקות.</li>
		<li>מחט?...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מותאמת לסביבות מעבדה ומשאבים שונים לפי הצורך. חשוב לציין, המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא הצורך במכסה המנוע של רמת בלימה ברמה 2 ותרבות רקמות. היישום של שכפול וירוס RNA פסאודוטיפ עם ספייק SARS-CoV-2, כגון VSV-S-eGFP, הוא חלופה אימתנית לנגיף SARS-CoV-2, אשר דורש אזור עבודה ברמת...

בדצמבר 2019 זוהה נגיף קורונה חדש, שכעת אנו מכירים כסארס-CoV-2, הסוכן הסיבתי של מחלת הקורונה 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 הוא נגיף בטאקורונה השייך למשפחת קורונה-וירוס. וירוסים עטופים אלה מהווים גנום RNA גדול בעל חוש חיובי ואחראים לזיהומים בדרכי הנשימה ובמעיים הן בבני אדם והן בבעלי חיים2. נכון למאי 2021 דווחו יותר מ-157 מיליון מקרים מדווחים של COVID-19 ברחבי העולם ויותר מ-3.2 מיליון מקרי מוות3. פיתוח חיסון יעיל הפך למטרה העיקרית של חוקרים ברחבי העולם עם לפחות 77 חיסונים פרה-קליניים תחת חקירה ו -90 עוברים כיום ניסויים קליניים4.
נגיפי קורונה מקודדים ארבעה חלבונים מבניים כולל חלבון ספייק (S), נוקלאוקפסיד (N), חלבון מעטפה (E) וחלבון הממברנה (M). הכניסה של SARS-CoV-2 דורשת אינטראקציה של תחום מחייב הקולטן (RBD) של S עם הקולטן המארח, אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (hACE2), והיתוך ממברנה לאחר מכן בעקבות מחשוף פרוטאוליטי על ידי פרוטאז סרין תאי מארח, סרין פרוטאז transmembrane 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . אימונודומיננטיות הומוריסטית של חלבון S של SARS-CoV דווחה בעבר וכעת הוצגה גם עבור SARS-CoV-211,12,13. ואכן, נטרול תגובות נוגדנים נגד S זוהו בסרום הבראה מחולי SARS-CoV 24 חודשים לאחר זיהום14, המדגיש את תפקידם הקריטי בתגובה החיסונית לטווח ארוך. חלבון S זוהה כיעד חיסון מבטיח ובכך הפך למרכיב מרכזי ברוב החיסונים בפיתוח15,16.
בעוד גילוי מהיר של נוגדנים מנטרלים הוא היבט קריטי של פיתוח חיסון, זה עשוי גם לשפוך אור על קצב ההדבקה ומעקב sero-epidemiologic באזורים מושפעים17. פסאודוטיפדת VSV מוסמכת לשכפול עם גליקופרוטאין SARS-CoV-2 S, במקום גליקופרוטאין VSV מסוג פראי, כדי לחקור זיהום SARS-CoV-2 בהגדרות ברמת בטיחות ביולוגית 2 נתרם בחביבות על ידי וילן ושותפיו לעבודה18. VSV ביטוי ספייק (VSV-S) ישמש כדי לקבוע את תגובת הנוגדנים המנטרלת נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2. כמו VSV-S המשמש כאן גם מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), מוקדי eGFP עשויים להיות מזוהים בתוך 24 שעות כדי לכמת זיהום, בעוד היווצרות פלאק יכול לקחת 48 עד 72 שעות. סיכום כאן הוא פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לקבוע את היכולת של סרום החולה הבראה לנטרל VSV-S-eGFP זיהום. שיטה זו עשויה גם להיות מותאמת בקלות כדי לחקור טיפולים פוטנציאליים אחרים שמטרתם לשבש את האינטראקציה המארחת-ויראלית של חלבון SARS-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

ככל שמגפת COVID-19 הנגרמת על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) ממשיכה להתפתח, התברר כי נוכחות של נטרול נוגדנים נגד הנגיף עשויה לספק הגנה מפני זיהום עתידי. כך, ככל שיצירה ותרגום של חיסוני COVID-19 יעילים יימשכו במהירות חסרת תקדים, פיתוח שיטות מהירות ויעילות למדידת נוגדנים מנטרלים נגד SARS-CoV-2 יהפוך לחשוב יותר ויותר כדי לקבוע הגנה ארוכת טווח מפני זיהום עבור אנשים נגועים בעבר וחיסון. מאמר זה מתאר פרוטוקול תפוקה גבוהה באמצעות וירוס סטומטיטיס ארסי (VSV) פסאודוטיפ עם חלבון ספייק SARS-CoV-2 כדי למדוד את נוכחותם של נוגדנים נטרול בסרום הבראה מחולים שהחלימו לאחרונה מ- COVID-19. השימוש בווירוס פסאודוטיפ משוכפל מבטל את הצורך במתקן בלימה ברמה 3 הנדרש לטיפול SARS-CoV-2, מה שהופך פרוטוקול זה לנגיש כמעט לכל מעבדת בלימה ברמה 2. השימוש בפורמט של 96 באר מאפשר דגימות רבות לרוץ בו זמנית עם זמן תפנית קצר של 24 שעות.

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לאיתור נוגדנים מנטרלים נגד חלבון SARS-CoV-2 S באמצעות עיכוב של זיהום פסאודווירוס VSV-S-eGFP (ניתן לכימות על ידי אובדן מוקדי eGFP שזוהו). ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתואר באיור 1. מומלץ כי נוגדן זמין מסחרית ישמש כשליטה חיובית בכל פעם שההתראה מופעלת כדי ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

שיטה זו מספקת דרך לענות על אחת השאלות החשובות יותר בנוגע לחיסוני SARS-coronavirus-2 בפיתוח. האם החיסון מסוגל לעורר תגובת נוגדנים מנטרלת? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיעשות במתקן בלימה רמה 2.זה גם יחסית מהיר וזול, מה שהופך אותו מתאים לניתוח דגימות רבות בבת אחת. כדי להדגים את הליך החומצה המנטרלת, יש לנו את ריקרדו מריוס, טכנאי בכיר במעבדה ואת טיילור ג'יימיסון, סטודנטית לדוקטורט. התחל על ידי פולחן תאי Vero E6 ב- DMEM בתוספת 10% FBS ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כדי לעבור את התאים, תחילה לשטוף אותם על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS בעדינות נדנדה המנה ארבע עד חמש פעמים. לאחר שאיפה PBS, להוסיף שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA ולטלטל את המנה כדי להבטיח כי פני השטח כולו מכוסה לפני הדגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים התנתקו, בטל את ה- trypsin על-ידי הוספת שבעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS, ולאחר מכן תנתק מחדש את התאים על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים.הסר את טריפסין על ידי צנטריפוגה ושאף את supernatant מבלי להפריע גלולה התא לפני שימוש חוזר את התאים ב 10 מיליליטר של DMEM טרי. לאחר הספירה, להוסיף בערך פעם אחת 10 לתאים השביעיים לכל צלחת 15 ס"מ ולדגירה את התרבות במשך יום עד יומיים עד התאים הם 100% confluent. כדי להכין את VSV ספייק EGFP פסאודווירוס עבור titering, להדביק את התאים ב 0.01 ריבוי של זיהום עם וירוס המלאי מדולל ב 12 מיליליטר של DMEM ללא סרום.לאחר הוספת הנגיף, לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם נדנדה מדי פעם. בסוף הדגירה, להחליף את inoculum עם DMEM טרי בתוספת 2%FBS ו 20 ערימות מילימולר, ולאחר מכן לדגור על התאים ב 34 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. למחרת, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את ביטוי ה- EGFP של התאים הנגועים.לאחר אפקט ציטופתי נרחב ניתוק התא נצפים, לאסוף את התרבות supernatant ולהסיר את הפסולת על ידי צנטריפוגה. כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה מרובים, aliquot supernatant לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את titer הנגיפי, צלחת תאי Vero E6 בשש לוחות באר בצפיפות זריעה של שש פעמים 10 לתאים החמישיים לבאר ודגורה בן לילה.למחרת, הקים סדרת דילול סדרתית פי עשרה של המניה הנגיפית על ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של צינורות מיקרו-צנטריפוגות בינוניים עד שבעה והוספת 100 מיקרוליטרים של מלאי ויראלי לצינור הראשון. לאחר מערבולת קצרה, להעביר 100 microliters של וירוס מדולל לכל צינור עוקב, מערבולת בין כל צינור. לאחר מכן החליפו את הסופר-נט בכל באר של צלחת התרבות Vero E6 ב-500 מיקרוליטרים של ה-10 עד מינוס שניה עד 10 ב- מינוס דילול ויראלי שביעי.לאחר דגירה של 45 דקות באינקובטור תרבית התאים עם נדנדה עדינה כל 15 דקות, החלף את האינקולום בתמיסת כיסוי ודגר את התאים ב 34 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. בסוף הדגירה, כדי לדמיין את הלוחות על ידי כתמים סגול קריסטל, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS לפני הוספת שני מיליליטר של 0.1% סגול קריסטל לכל באר. מניחים את הצלחת על רוקר במשך כ -20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת כל באר בעדינות פעמיים עם PBS.לאחר הכביסה האחרונה, לאפשר את הצלחות לאוורר יבש לפחות שעה אחת לפני השימוש בנוסחה כפי שצוין כדי לחשב את titer של הנגיף בכל באר להרכיב יחידות פלאק למיליליטר. כדי צלחת תאים לבדיקת נטרול, להשתמש pipette רב ערוצי להוסיף 100 microliters של תאי Vero E6 לכל באר של צלחת 96 באר בצפיפות של פעמיים 10 עד התא החמישי למיליליטר, ולדגירה את הצלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, חום להמתת דגימות סרום המטופל להיבדק באמבט מים 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן להגדיר סדרת דילול פי עשרה של דגימות הסרום של המטופל בצלחת תרבית 96 רקמות היטב ריקה על ידי הוספת שמונה microliters של הסרום ל 72 microliters של DMEM ללא סרום עם אנטיביוטיקה בכל באר של שורה A.ואז להוסיף 40 microliters של DMEM ללא סרום לכל באר של שורות B ל- G ו 80 microliters לכל באר של שורה H.Using 12 צינור רב ערוצי היטב, מערבבים את הדגימות בשורה A, ולאחר מכן מעבירים 40 מיקרוליטרים של המדגם מכל באר של שורה A לכל באר של שורה B.לאחר ערבוב, חזור על הדילול עבור כל שורת הבא של הבא עד שורה F.Next, להוסיף 40 microliters של VSV ספייק EGFP ב 0.05 ריבוי של זיהום לכל באר בשורות A עד G, ומערבבים על ידי צנרת ארבע עד חמש פעמים לפני הדגירה של הצלחת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, שאפו בזהירות את supernatant מכל באר של צלחת התרבות Vero E6 ולהעביר 60 microliters של תערובת וירוס נוגדנים מכל באר של צלחת דילול מדגם לבאר המתאימה של צלחת תרבית התא. כאשר כל הדגימות הועברו, למקם את צלחת תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת עם נדנדה כל 20 דקות.לאחר השלמת הדגירה, להוסיף 140 microliters של פתרון כיסוי carboxymethylcellose לכל באר של צלחת תרבית התא ולהעביר את הצלחת 34 מעלות צלזיוס 5% אינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, צלם את הלוחות על תמונה פלואורסצנטית אוטומטית באורך גל של 488 ננומטר, והשתמש בתכונת הספירה האוטומטית של התמונה כדי לכמת את מוקדי ה- EGFP הבודדים. בדוגמה מייצגת זו, נוגדן נטרול מסחרי נגד קולטן ספייק SARS-coronavirus-2 שימש כבקרה חיובית, לצד IgG כשליטה שלילית.עיכוב האחוזים חושב בהתבסס על מספר מוקדי ה- EGFP שזוהו באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. נטרול פסאודווירוס על ידי דגימות חולים הבראה שנאספו כשלושה חודשים לאחר ההדבקה ב-SARS-coronavirus-2 הראה כי חולים מאושפזים הראו יכולת נטרול מוגברת בהשוואה לאלה שלא נזקקו לאשפוז. הליך זה יכול לשמש גם כדי להעריך אחרים COVID-19 מניעה וסוכנים טיפוליים שמטרתם לחסום זיהום ויראלי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

יעיל SARS-CoV-2 כמותי הפוך Transcriptase PCR רוק אסטרטגיה אבחון באמצעות רובוטים צנרת קוד פתוח

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...