Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il laboratorio Whelan per aver generosamente fornito il virus VSV-S-eGFP utilizzato in questo protocollo (descritto in Case et al. 2020). Ringraziamo anche i dottori Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e il team) per aver raccolto i campioni di sangue del paziente (ID protocollo REB 20200371-01H). Gli autori rivelano di aver ricevuto il seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e / o la pubblicazione di questo articolo: Questo lavoro è stato finanziato dal generoso sostegno della Ottawa Hospital Foundation e una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research (# 448323) e una sovvenzione veloce dalla fondazione Thistledown per la scienza COVID-19 a C.S.I. T.R.J. è finanziata da una borsa di studio per laureati dell'Ontario e da una borsa di studio Mitacs del cluster. JP è finanziato da una borsa di studio Del cluster Mitacs. T.A. è finanziato da una CIHR Banting Fellowship. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio.

1. Cellule di placcatura (Giorno 1) per la produzione e la quantificazione dello pseudovirus SARS-CoV-2
<ol><li>Preparazione per la coltura tissutale<ol>
<li>Warm 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (opzionale); e 0,25% di acido tetraacetico tripsina-etilendiammina (EDTA) a 37 °C a bagnomaria per circa 15 minuti.</li>
		<li>Disinfettare una cappa di coltura di tessuto con il 70% di eta...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

Il metodo qui descritto può essere adattato per adattarsi a diversi ambienti di laboratorio e risorse, se necessario. È importante sottolineare che la principale limitazione di questo protocollo è la necessità di uno spazio di livello 2 di contenimento e di una cappa di coltura tissutale. L'applicazione di un virus a RNA replicante pseudotipizzato con il picco SARS-CoV-2, come VSV-S-eGFP, è una formidabile alternativa al virus SARS-CoV-2, che richiede un'area di lavoro di livello 3 di contenimento, ma può rimanere ...

A dicembre 2019 è stato identificato un nuovo coronavirus, che ora conosciamo come SARS-CoV-2, l'agente eziologico della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 è un betacoronavirus appartenente alla famiglia Coronaviridae. Questi virus avvolti comprendono un ampio genoma di RNA a senso positivo e sono responsabili di infezioni respiratorie e intestinali sia nell'uomo che negli animali2. A partire da maggio 2021 ci sono stati più di 157 milioni di casi segnalati di COVID-19 a livello globale e oltre 3,2 milioni di decessi3. Lo sviluppo di un vaccino efficace è diventato l'obiettivo primario dei ricercatori di tutto il mondo con almeno 77 vaccini preclinici in fase di studio e 90 attualmente in fase di sperimentazione clinica4.
I coronavirus codificano quattro proteine strutturali tra cui la proteina spike (S), il nucleocapside (N), la proteina dell'involucro (E) e la proteina di membrana (M). L'ingresso di SARS-CoV-2 richiede l'interazione del dominio di legame del recettore (RBD) di S con il recettore dell'ospite, l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) e la successiva fusione di membrana a seguito della scissione proteolitica da parte della proteasi della serina cellulare dell'ospite, proteasi transmembrana serina2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . L'immunodominanza umorale della proteina S di SARS-CoV è stata precedentemente riportata ed è stata ora dimostrata anche per SARS-CoV-211,12,13. Infatti, le risposte anticorpali neutralizzanti contro S sono state rilevate nel siero convalescente da pazienti con SARS-CoV 24 mesi dopo l'infezione14, evidenziando il loro ruolo critico nella risposta immunitaria a lungo termine. La proteina S è stata identificata come un bersaglio vaccinale promettente ed è quindi diventata un componente chiave della maggior parte dei vaccini in fase di sviluppo15,16.
Mentre la rapida rilevazione di anticorpi neutralizzanti è un aspetto critico dello sviluppo del vaccino, può anche far luce sul tasso di infezione e sorveglianza siero-epidemiologica nelle aree colpite17. Un VSV competente per la replicazione pseudotipizzato con la glicoproteina SARS-CoV-2 S, al posto della glicoproteina VSV wild-type, per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 in contesti di livello di biosicurezza 2 è stato gentilmente donato da Whelan e colleghi18. Il vsV expressing spike (VSV-S) sarà utilizzato per determinare la risposta anticorpale neutralizzante contro la proteina spike SARS-CoV-2. Poiché il VSV-S utilizzato qui esprime anche una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), i focolai di eGFP possono essere rilevati entro 24 ore per quantificare l'infezione, mentre la formazione della placca può richiedere da 48 a 72 ore. Riassunto qui è un protocollo semplice ed efficace per determinare la capacità del siero del paziente convalescente di neutralizzare l'infezione da VSV-S-eGFP. Questo metodo può anche essere facilmente adattato per interrogare altre potenziali terapie che mirano a interrompere l'interazione ospite-virale della proteina SARS-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

Mentre la pandemia di COVID-19 causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continua ad evolversi, è diventato evidente che la presenza di anticorpi neutralizzanti contro il virus può fornire protezione contro future infezioni. Pertanto, poiché la creazione e la traduzione di vaccini COVID-19 efficaci continua a una velocità senza precedenti, lo sviluppo di metodi rapidi ed efficaci per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro SARS-CoV-2 diventerà sempre più importante per determinare la protezione a lungo termine contro l'infezione sia per gli individui precedentemente infetti che per quelli immunizzati. Questo documento descrive un protocollo ad alto rendimento che utilizza il virus della stomatite vescicolare (VSV) pseudotipizzato con la proteina spike SARS-CoV-2 per misurare la presenza di anticorpi neutralizzanti nel siero convalescente di pazienti che sono recentemente guariti da COVID-19. L'uso di un virus pseudotipizzato replicante elimina la necessità di una struttura di livello di contenimento 3 necessaria per la gestione di SARS-CoV-2, rendendo questo protocollo accessibile praticamente a qualsiasi laboratorio di livello di contenimento 2. L'uso di un formato a 96 pozzedi consente di eseguire molti campioni contemporaneamente con un breve tempo di consegna di 24 ore.

Questo protocollo delinea un metodo rapido ed efficace per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina SARS-CoV-2 S attraverso l'inibizione dell'infezione da pseudovirus VSV-S-eGFP (quantificabile dalla perdita di focolai eGFP rilevati). Una rappresentazione schematica del protocollo è illustrata nella Figura 1. Si raccomanda di utilizzare un anticorpo disponibile in commercio come controllo positivo ogni volta che viene eseguito il test per garantire la coerenza del test. Qui,...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l'infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.

Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Questo metodo fornisce un modo per rispondere a una delle domande più importanti riguardanti i vaccini SARS-coronavirus-2 in fase di sviluppo. Il vaccino è in grado di suscitare una risposta anticorpale neutralizzante? Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in una struttura di livello due di contenimento.È anche relativamente veloce e poco costoso, il che lo rende adatto all'analisi di molti campioni contemporaneamente. Dimostrando la procedura di neutralizzazione dell'acido, abbiamo Ricardo Marius, un tecnico senior in laboratorio e Taylor Jamieson, uno studente di dottorato MD. Inizia coltivando cellule Vero E6 in DMEM integrate con il 10% di FBS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.Per passare le cellule, prima lavarle aggiungendo 10 millilitri di PBS e dondolando delicatamente il piatto da quattro a cinque volte. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA e scuotere il piatto per assicurarsi che l'intera superficie sia coperta prima di incubarla a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, disattivare la tripsina aggiungendo sette millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS, quindi risospegnare le cellule tubando su e giù più volte.Rimuovere la tripsina per centrifugazione e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare prima di riconsociegnare le cellule in 10 millilitri di DMEM fresco. Dopo il conteggio, aggiungere circa una volta 10 alla settima cellule a ciascuna piastra di 15 centimetri e incubare la coltura per uno o due giorni fino a quando le cellule sono confluenti al 100%. Per preparare lo pseudovirus VSV spike EGFP per il titolo, infettare le cellule a 0,01 molteplicità di infezione con il virus stock diluito in 12 millilitri di DMEM senza siero.Dopo aver aggiunto il virus, incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con occasionali dondoli. Alla fine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con DMEM fresco integrato con 2% FBS e 20 millimolari, quindi incubare le cellule a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, utilizzare un microscopio fluorescente per visualizzare l'espressione EGFP delle cellule infette.Una volta osservato un esteso effetto citopatico e il distacco cellulare, raccogliere il surnatante di coltura e rimuovere i detriti mediante centrifugazione. Per evitare cicli multipli di congelamento-disgelo, aliquotare il surnatante prima della conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per determinare il titolo virale, placcare le cellule Vero E6 in sei piastre di pozzetto ad una densità di semina di sei volte 10 alla quinta cellule per pozzetto e incubare durante la notte.Il giorno successivo, impostare una serie di diluizione seriale di dieci volte dello stock virale aggiungendo 900 microlitri di tubi da media a sette microcentrifughe e aggiungendo 100 microlitri di stock virale al primo tubo. Dopo un breve vortice, trasferire 100 microlitri di virus diluito a ciascun tubo successivo, vorticosamente tra ciascun tubo. Quindi sostituire il surnatante in ogni pozzo della piastra di coltura Vero E6 con 500 microlitri da 10 a meno secondo a 10 a meno settima diluizioni virali.Dopo un'incubazione di 45 minuti nell'incubatore di colture cellulari con dondolo delicatamente ogni 15 minuti, sostituire l'inoculo con una soluzione di sovrapposizione e incubare le cellule a 34 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Alla fine dell'incubazione, per visualizzare le placche mediante colorazione viola cristallina, lavare le cellule una volta con PBS prima di aggiungere due millilitri di viola cristallino allo 0,1% a ciascun pozzetti. Posizionare la piastra su un bilanciere per circa 20 minuti a temperatura ambiente prima di lavare delicatamente ogni pozzetti due volte con PBS.Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare asciugare le piastre all'aria per almeno un'ora prima di utilizzare la formula come indicato per calcolare il titolo del virus in ciascun pozzo in unità di formazione della placca per millilitro. Per impiattare le cellule per un test di neutralizzazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di cellule Vero E6 a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzi ad una densità di due volte 10 alla quinta cella per millilitro e incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, il calore inattiva i campioni di siero del paziente da testare a bagnomaria a 56 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi impostare una serie di diluizione di dieci volte dei campioni di siero del paziente in una piastra di coltura tissutale vuota da 96 pozzi aggiungendo otto microlitri del siero a 72 microlitri di DMEM senza siero con antibiotici in ogni pozzetto della riga A.Quindi aggiungere 40 microlitri di DMEM senza siero a ciascun pozzetto delle file da B a G e 80 microlitri a ciascun pozzetto della riga H.Utilizzando una pipetta multicanale da 12 pozzetti, mescolare i campioni nella riga A, quindi trasferire 40 microlitri del campione da ciascun pozzettimo della riga A a ciascun pozzetti della riga B.Dopo la miscelazione, ripetere la diluizione per ogni successiva fila di pozzetti fino alla riga F.Successivamente, aggiungere 40 microlitri di VSV spike EGFP a 0,05 molteplicità di infezione per ciascun pozzetti nelle righe da A a G, e mescolare pipettando da quattro a cinque volte prima di incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, aspirare accuratamente il surnatante da ciascun pozzettino della piastra di coltura Vero E6 e trasferire 60 microlitri di miscela di virus anticorpali da ciascun pozzettio della piastra di diluizione del campione al corrispondente pozzettimo della piastra di coltura cellulare. Quando tutti i campioni sono stati trasferiti, posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora con dondolo ogni 20 minuti.Al termine dell'incubazione, aggiungere 140 microlitri di soluzione di sovrapposizione di carbossimetilcellulosa a ciascun pozzettino della piastra di coltura cellulare e trasferire la piastra in un incubatore a 34 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, immagina le lastre su un imager fluorescente automatizzato a una lunghezza d'onda di 488 nanometri e utilizza la funzione di conteggio automatico dell'imager per quantificare i singoli focolai EGFP. In questo esempio rappresentativo, un anticorpo neutralizzante disponibile in commercio contro il dominio di legame del recettore spike SARS-coronavirus-2 è stato utilizzato come controllo positivo, insieme a IgG come controllo negativo.L'inibizione percentuale è stata calcolata in base al numero di focolai EGFP rilevati tramite imaging fluorescente. La neutralizzazione dello pseudovirus da parte di campioni di pazienti convalescenti raccolti circa tre mesi dopo l'infezione da SARS-coronavirus-2 ha mostrato che i pazienti ospedalizzati hanno dimostrato una maggiore capacità neutralizzante rispetto a quelli che non hanno richiesto il ricovero in ospedale. Questa procedura può essere utilizzata anche per valutare altri agenti terapeutici e di prevenzione COVID-19 che mirano a bloccare l'infezione virale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualizzazione di SARS-CoV-2 utilizzando l'ibridazione immuno RNA-fluorescenza in situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Efficiente strategia di diagnostica della saliva della PCR quantitativa della trascrittasi inversa SARS-CoV-2 utilizzando robot di pipettaggio open source

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...