Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Whelanラボは、このプロトコルで使用されるVSV-S-eGFPウイルスを寛大に提供してくれたことに感謝します(Case et al. 2020で説明)。また、患者の血液サンプル(REBプロトコルID 20200371-01H)を収集したビル・キャメロン博士とユタポーン・コーワン博士(およびチーム)に感謝します。著者らは、この記事の研究、著者、および/または出版物に対する次の財政支援の受領を開示する:この研究は、オタワ病院財団からの寛大な支援とカナダ保健研究所(#448323)からの助成金とCOVID-19科学のためのシスルダウン財団からのファストグラントからC.S.I.T.R.J.への迅速な助成金によって資金提供されましたJPは、クラスターMitacsフェローシップによって資金提供されています。T.A.はCIHRバンティング・フェローシップによって資金提供を受けています。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。

1. SARS-CoV-2擬似ウイルスの製造および定量のためのめっき細胞(1日目)
<ol><li>組織培養の準備<ol>
<li>暖かい1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS);10%胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(オプション)を含むDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)。約15分間水浴中に0.25%トリプシンエチレン酢酸(EDTA)から37°Cまで。</li>
		<li>70%エタノールで組織培養フードを消毒し、必要に応じて組織培養?...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

ここで説明する方法は、必要に応じてさまざまなラボ環境やリソースに合わせて調整できます。重要なことに、このプロトコルの主な制限は、封じ込めレベル2空間および組織培養フードの必要性である。VSV-S-eGFPのようなSARS-CoV-2スパイクを擬似型複製するRNAウイルスの適用は、封じ込めレベル3の作業領域を必要とするSARS-CoV-2ウイルスに代わる手ごわい代替手段であるが、一部のグループで?...

2019年12月、コロナウイルスの新しいコロナウイルスが同定され、コロナウイルス病2019(COVID-19)1の原因物質であるSARS-CoV-2と知られています。SARS-CoV-2はコロナビリダ科に属するベタコロナウイルスである。これらのエンベロープウイルスは、大きな陽性感覚RNAゲノムを含み、ヒトおよび動物両方における呼吸器および腸感染症の原因である2。2021年5月時点で、世界中で1億5,700万人以上のCOVID-19の症例が報告されており、320万人以上が死亡しています。効果的なワクチンの開発は、少なくとも77の前臨床ワクチンを調査中で、90は現在臨床試験を受けている世界中の研究者の主要な目標となっています4.
コロナウイルスは、スパイクタンパク質(S)、ヌクレオキャプシド(N)、エンベロープタンパク質(E)、膜タンパク質(M)を含む4つの構造タンパク質をコードする。SARS-CoV-2の侵入には、Sの受容体結合ドメイン(RBD)と宿主受容体、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)、および宿主細胞セリンプロテアーゼによるタンパク質分解性切断後の膜融合、トランス膜プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)5、6、7、8、9、100との相互作用が必要です。.SARS-CoVのSタンパク質の液性免疫優位性は、以前に報告されており、SARS-CoV-211、12、13についても示されています。実際、Sに対する中和抗体応答は、感染24ヶ月後のSARS-CoV患者から回復血清中に検出されており、長期的な免疫応答におけるそれらの重要な役割を強調している。Sタンパク質は有望なワクチン標的として同定されており、開発中のほとんどのワクチンの重要な成分となっています15,16.
中和抗体の迅速な検出はワクチン開発の重要な側面であるが、影響を受けた領域における感染率および血清疫学的サーベイランスの速度に光を当てる可能性もある17。SARS-CoV-2 S糖タンパク質を擬似型の複製能力VSVは、野生型VSV糖タンパク質の代わりに、バイオセーフティレベル2の設定でSARS-CoV-2感染を研究するために、Whelanと同僚18によって親切に寄贈された。VSV発現スパイク(VSV-S)は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体応答を決定するために利用される。ここで使用されるVSV-Sは増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するので、eGFP病巣は感染を定量化するために24時間以内に検出され、プラーク形成には48〜72時間かかることがあります。ここに要約すると、VSV-S-eGFP感染を中和する回復期の患者血清の能力を決定するための簡単で効果的なプロトコルがあります。この方法はまた、SARS-CoV-2 Sタンパク質の宿主とウイルスの相互作用を妨害することを目的とする他の潜在的な治療を尋問するために容易に適応され得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるCOVID-19パンデミックが進化し続ける中、ウイルスに対する中和抗体の存在が将来の感染に対する保護を提供することが明らかになりました。したがって、有効なCOVID-19ワクチンの作成と翻訳が前例のないスピードで続く中、SARS-CoV-2に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法の開発は、以前に感染した個人と予防接種を受けた個人の両方に対する感染に対する長期的な保護を決定するためにますます重要になります。本論文では、最近COVID-19から回復した患者から回復血清中中和抗体の存在を測定するために、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を擬似型にしたウイルス性口内炎ウイルス(VSV)を用いた高スループットプロトコルについて説明する。複製擬型ウイルスを使用すると、SARS-CoV-2 処理に必要な封じ込めレベル 3 の機能が不要になり、このプロトコルは事実上すべてのコンテインメント レベル 2 ラボにアクセスできます。96 ウェル形式を使用すると、短いターンアラウンドタイム 24 時間で多くのサンプルを同時に実行できます。

本プロトコルは、VSV-S-eGFP擬ウイルス感染の阻害(検出されたeGFP病巣の喪失によって定量化可能)を介してSARS-CoV-2 Sタンパク質に対する中和抗体を検出するための迅速かつ効果的な方法を概説する。図1に、プロトコルの概略図を示します。市販の抗体は、アッセイが実行されるたびに正のコントロールとして使用して、アッセイの一貫性を確保することが推奨されます。?...

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Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

この方法は、開発中のSARS-コロナウイルス-2ワクチンに関するより重要な質問の1つに答える方法を提供する。ワクチンは中和抗体応答を引き出すことができるか?この手法の主な利点は、格納レベル 2 の施設で行うことができる点です。また、比較的高速で安価で、一度に多くのサンプルを分析するのに適しています。中和酸手順を実証し、研究室のシニア技術者であるリカルド・マリウスとMD博士課程の学生であるテイラー・ジェイミーソンがいます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で10%FBSを補ったDMEMでベロE6細胞を培養することから始めます。細胞を通過するには、まずPBSの10ミリリットルを加えて、皿を4〜5回静かに揺らすことでそれらを洗います。PBSを吸引した後、3ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、37°Cでインキュベートする前に表面全体が覆われているように皿を揺らします。細胞が切り離されたら、10%FBSで補ったDMEMの7ミリリットルを加えることによってトリプシンを非アクティブ化し、数回上下にピペットを作って細胞を再中断する。遠心分離によってトリプシンを除去し、新鮮なDMEMの10ミリリットルで細胞を再懸濁する前に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。計数後、7番目の細胞に約10を各15センチメートルプレートに10回加え、細胞が100%コンフルエントになるまで1〜2日間培養をインキュベートする。VSVスパイクEGFP擬似ウイルスを整えるため、12ミリリットルの無血清DMEMで希釈したストックウイルスに感染する多重度0.01で細胞に感染する。ウイルスを追加した後、摂氏37度で1時間、時折揺れる5%の二酸化炭素をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、接種を2%FBSおよび20ミリモルヒープで補った新鮮なDMEMに置き換え、摂氏34度と5%の二酸化炭素で24時間培養する。翌日、蛍光顕微鏡を用いて、感染した細胞のEGFP発現を可視化する。広範な細胞パシー効果と細胞剥離が観察されたら、培養上清を収集し、遠心分離によって破片を除去する。複数の凍結融解サイクルを避けるために、マイナス80°Cで貯蔵する前に上清をアリクォートする。ウイルス性チターを決定するために、ベロE6細胞を6回のウェルプレートに10〜5番目の細胞の6倍の播種密度でプレートし、一晩インキュベートする。翌日、7つのマイクロ遠心分離管に900マイクロリットルの培地を加え、1番目のチューブに100マイクロリットルのウイルスストックを加えることで、ウイルスストックの10倍のシリアル希釈シリーズを設定しました。短いボルテックスの後、希釈されたウイルスの100マイクロリットルを後続の各チューブに移し、各チューブ間の渦を起分させる。次に、ベロE6培養プレートの各ウェルの上清を、マイナス7のウイルス希釈液に対してマイナス秒から10までの10~10の500マイクロリットルに置き換えます。細胞培養インキュベーターで45分間のインキュベーションを行い、15分ごとに穏やかに揺れ動いた後、接種液をオーバーレイ溶液に置き換え、34°Cで細胞を5%の二酸化炭素で48時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、結晶紫色染色によってプラークを可視化し、各ウェルに0.1%の結晶紫色の2ミリリットルを加える前にPBSで細胞を1回洗浄する。プレートを室温で約20分間ロッカーに置き、PBSで2回ずつゆっくりと洗います。最後の洗浄後、プレートが少なくとも1時間空気乾燥してから、示された式を使用して、各ウェルのウイルスの価価をミリリットル当たりのプラーク形成単位で計算するようにします。中和アッセイのために細胞をプレートするには、マルチチャンネルピペットを使用して、1ミリリットル当たり5番目の細胞の2倍から5番目の細胞の密度で96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのベロE6細胞を追加し、37°Cと5%の二酸化炭素でプレートを24時間インキュベートします。翌日、熱は、56°Cの水浴で30分間試験される患者血清サンプルを不活性化する。その後、空の96ウェル組織培養プレートに患者の血清サンプルの10倍希釈シリーズを設定し、血清の8マイクロリットルを72マイクロリットルの無血清DMEMに加え、各ウェルAの各ウェルに抗生物質を加え、40マイクロリットルの無血清DMEMを行BからG、80マイクロリットルの各ウェルに追加します。 行Aでサンプルを混ぜ、行Aの各ウェルから行Bの各ウェルにサンプルの40マイクロリットルを転送し、混合後、行F.Nextまでウェルの後続の各行に希釈を繰り返し、0.05のVSVスパイクEGFPの40マイクロリットルを0.05の多重性で追加します。 37°Cと5%の二酸化炭素で1時間プレートをインキュベートする前に4〜5回ピペットで混ぜます。インキュベーションの終わりに、Vero E6培養プレートの各ウェルから上澄み物を慎重に吸引し、サンプル希釈板の各ウェルから細胞培養板の対応するウェルに60マイクロリットルの抗体ウイルス混合物を移管する。すべてのサンプルが転送されたら、細胞培養プレートを摂氏37度、20分ごとに揺れ動かしながら1時間5%の二酸化炭素を置きます。インキュベーションが完了したら、カルボキシメチルセルロースオーバーレイ溶液140マイクロリットルを細胞培養プレートの各ウェルに加え、プレートを摂氏34度と5%の二酸化炭素インキュベーターに移します。24時間後、488ナノメートル波長の自動蛍光イメージャー上のプレートを画像化し、イメージャーの自動計数機能を使用して個々のEGFP病巣を定量化します。本代表例では、SARS-コロナウイルス-2スパイク受容体結合ドメインに対して市販の中和抗体を陽性対照として用いた、IgGと並んで陰性対照として用いた。阻害率は、蛍光イメージングを介して検出されたEGFP病巣の数に基づいて算出した。SARS-コロナウイルス-2感染後約3ヶ月後に採取された回復期の患者サンプルによる擬似ウイルス中和は、入院を必要としない患者と比較して中和能力の増加を示した。この手順は、ウイルス感染を阻止することを目的とする他のCOVID-19予防および治療剤を評価するためにも使用することができる。

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SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...