Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

우리는 관대이 프로토콜에 사용되는 VSV-S-eGFP 바이러스를 제공 Whelan 실험실감사 (케이스 외. 2020에 설명). 우리는 또한 환자 혈액 샘플을 수집한 빌 카메론 박사와 주타포르 코완 (및 팀)에게 감사드립니다 (REB 프로토콜 ID 20200371-01H). 저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판에 대한 다음과 같은 재정적 지원의 수신을 공개합니다: 이 작품은 오타와 병원 재단의 관대 한 지원과 캐나다 보건 연구 원 (#448323)의 보조금과 COVID-19 과학을위한 엉겅퀴 재단의 빠른 보조금에 의해 조달되었으며, 온타리오 대학원 장학금 및 미택 펠로우십에 자금을 지원합니다. JP는 클러스터 미탁스 펠로우십에 의해 지원됩니다. T.A.는 CIHR 반팅 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다.

1. SARS-CoV-2 의사 바이러스의 생산 및 정량화를 위한 도금 세포(1일)
<ol><li>조직 배양 준비<ol>
<li>따뜻한 1x 덜벡코의 인산염 완충식식(DPBS); 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/연쇄절제술(선택 사항)을 함유하고 있습니다. 및 약 15분 동안 수조에서 37°C까지 트립신-에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA)을 0.25% 하였다.</li>
		<li>70% 에탄올로 조직 배양 후드를 소독하고...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

여기에 설명된 방법은 필요에 따라 다양한 실험실 환경과 리소스에 맞게 조정될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜의 주요 한계는 봉쇄 수준 2 공간 및 조직 배양 후드에 대한 필요성이다. VSV-S-eGFP와 같은 SARS-CoV-2 스파이크를 사용하여 가시형RNA 바이러스를 복제하는 응용은, 봉쇄 수준 3 작업 영역을 필요로 하지만, 일부 그룹에 대한 제한으로 남아있을 수 있는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 강력?...

2019년 12월, 새로운 코로나바이러스가 확인되었으며, 현재 코로나바이러스 질환의 원인제인 SARS-CoV-2(COVID-19)1로알고 있다. SARS-CoV-2는 코로나비대 가문에 속하는 베타코로나바이러스입니다. 이러한 봉투바이러스는 큰 양성감지 RNA 게놈을 포함하며 인간과동물2 모두에서 호흡기 및 장 감염에 대한 책임이 있다. 2021년 5월 현재 전 세계적으로 1억 5,700만 건이상의 COVID-19사례가 보고되었으며 320만 명 이상이 사망했다. 효과적인 백신의 발달은 적어도 77의 전임상 백신을 조사하고 90현재 임상 시험을 겪고 있는 전 세계 연구원의 1차 목표가 되었습니다4.
코로나바이러스는 스파이크 단백질(S), 뉴클레오캡시드(N), 봉투 단백질(E), 막 단백질(M)을 포함한 4가지 구조 단백질을 인코딩한다. SARS-CoV-2의 진입은 숙주 수용체와 S의 수용체 결합 도메인(RBD), 인간 혈관신생-변환 효소 2(hACE2), 및 후속 멤브레인 융합다음의 상호 작용이 필요하며, 숙주 세포 세린 프로테제, 트랜스멤브레인 프로테아제 세린 2(TMPRSS2)5,6,7,8,10, 10, 10 . SARS-CoV의 S 단백질의 유머 면역도는 이전에 보고되었으며 현재 SARS-CoV-211,12,13에도대해서도 도시되었다. 실제로, S에 대한 항체 반응을 중화시키는 것은SARS-CoV 환자로부터 24개월 후 SARS-CoV 환자로부터 병영 혈청에서 검출되어 장기 면역 반응에서 중요한 역할을 강조하고 있다. S 단백질은 유망한 백신 표적으로 확인되고 따라서 개발15,16의밑에 대부분의 백신의 핵심 분대가 되었습니다.
중화 항체의 급속한 검출은 백신 발달의 중요한 양상이지만, 또한 영향받은 지역에 있는 감염 및 혈청 역학 감시의 비율에 빛을 비출 수 있습니다17. 생물안전 수준 2 설정에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하기 위해, SARS-CoV-2 S 당단백질 대신 SARS-CoV-2 S 당단백질을 가진 복제 유능한 VSV 가시형은 웰란과동료(18)에의해 친절하게 기증되었다. VSV 발현 스파이크(VSV-S)는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체 반응을 결정하는 데 활용될 것이다. 여기에서 사용되는 VSV-S는 또한 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 표현하기 때문에, eGFP 포시는 감염을 정량화하기 위해 24 시간 이내에 검출 될 수 있지만 플라크 형성은 48 에서 72 h를 취할 수 있습니다. 여기에 요약VSV-S-eGFP 감염을 중화하는 병결 환자 혈청의 능력을 결정하는 간단하고 효과적인 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 SARS-CoV-2 S 단백질의 호스트 바이러스 성 상호 작용을 방해하는 것을 목표로 하는 그밖 잠재적인 치료체를 심문하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 인한 COVID-19 전염병이 계속 진화함에 따라 바이러스에 대한 항체중화의 존재가 향후 감염에 대한 보호를 제공할 수 있다는 것이 명백해지고 있다. 따라서 효과적인 COVID-19 백신의 생성 및 번역이 전례 없는 속도로 계속됨에 따라 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법의 개발은 이전에 감염되고 예방 접종된 개인 모두에 대한 감염에 대한 장기적인 보호를 결정하는 것이 점점 더 중요해질 것이다. 본 논문은 최근 COVID-19에서 회복된 환자로부터 회복세럼에서 항체를 중화시키는 존재를 측정하기 위해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 함께 가시성 성 정맥성 구내염 바이러스(VSV)를 이용한 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 복제 의사유형 바이러스를 사용하면 SARS-CoV-2 처리에 필요한 봉쇄 레벨 3 시설의 필요성을 제거하여 이 프로토콜을 거의 모든 봉쇄 수준 2 실험실에 액세스할 수 있게 합니다. 96웰 형식을 사용하면 24h의 짧은 처리 시간으로 많은 샘플을 동시에 실행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 VSV-S-eGFP 의사 바이러스 감염의 억제를 통해 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 중화 항체를 검출하는 신속하고 효과적인 방법을 간략하게 설명합니다(eGFP 포시의 손실에 의해 정량화 가능). 프로토콜의 회로도 표현은 그림 1에묘사됩니다. 분석이 실행될 때마다 상용화 가능한 항체를 양성 대조군으로 사용하여 분석의 일관성을 보장하는 것이 좋습니다. 여기서, 우리는 I...

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Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

이 방법은 개발 중인 SARS-coronavirus-2 백신과 관련된 더 중요한 질문 중 하나에 응답하는 방법을 제공합니다. 백신은 중화 항체 반응을 유도할 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 봉쇄 레벨 2 시설에서 수행 할 수 있다는 것입니다.또한 비교적 빠르고 저렴하므로 많은 샘플을 한 번에 분석하는 데 적합합니다. 중화 산 성 절차를 시연, 우리는 리카르도 마리우스, 실험실의 수석 기술자와 테일러 제이미슨, MD 박사 과정 학생. DMEM에서 베로 E6 세포를 배양하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10%의 FBS로 보충됩니다.세포를 통과하려면 먼저 PBS 10 밀리리터를 추가하고 부드럽게 접시를 4 ~ 5 번 흔들어 씻어 내십시오. PBS를 흡입한 후 트립신 EDTA 의 3 밀리리터를 추가하고 접시를 흔들어 전체 표면이 섭씨 37도에서 배양하기 전에 덮이도록 하십시오. 세포가 분리되면 10%의 FBS로 보충된 DMEM의 7밀리리터를 추가하여 트립신을 비활성화한 다음, 여러 번 배관하여 세포를 다시 분리합니다.원심분리에 의해 트립신을 제거하고 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하기 전에 세포 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 흡인한다. 계산 후, 각 15센티미터 플레이트에 일곱 번째 세포에 약 1회 10을 추가하고 세포가 100% 컨플루토리될 때까지 1~2일 동안 배양한다. Titering에 대한 VSV 스파이크 EGFP 의사 바이러스를 준비하려면 혈청이없는 DMEM의 12 밀리리터에서 희석 된 주식 바이러스로 감염의 0.01 복합성에서 세포를 감염시 보종한다.바이러스를 추가한 후, 세포를 섭씨 37도에서 1시간, 이산화탄소5%에서 가끔 흔들면 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 2%의 FBS와 20밀리머 힙으로 보충된 신선한 DMEM으로 접종을 한 다음 세포를 섭씨 34도, 이산화탄소 5%로 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 형광 현미경을 사용하여 감염된 세포의 EGFP 발현을 시각화한다.광범위한 세포 병증 효과와 세포 분리가 관찰되면, 배양 상체를 수집하고 원심 분리에 의해 파편을 제거합니다. 여러 동결 해동 주기를 피하기 위해, 영하 80도에서 저장하기 전에 상체를 알리쿼트. 바이러스 성 티터를 결정하기 위해, 6 개의 웰 플레이트에서 베로 E6 세포를 잘 당 다섯 번째 세포에 6 배 10의 파종 밀도로 플레이트하고 하룻밤 동안 배양한다.다음 날, 중간 중형 마이크로리터 900마이크로리터를 7마이크로원심분리관에 추가하고 100마이크로리터의 바이러스 성 육수를 첫 번째 튜브에 추가하여 바이러스 성 육수의 10배 연속 희석 시리즈를 설정합니다. 짧은 소용돌이 후, 각 후속 튜브에 희석 된 바이러스의 100 마이크로 리터를 전송, 각 튜브 사이 소용돌이. 그런 다음 베로 E6 배양 판의 각 웰에서 500 마이크로리터를 마이너스 초10에서 마이너스 7 바이러스 희석으로 대체합니다.세포 배양 인큐베이터에서 15분마다 부드럽게 흔들리는 배양 후, 접종을 오버레이 용액으로 대체하고 세포를 섭씨 34도에서 48시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 플라크를 시각화하고, 각각 의 2 밀리리터를 0.1%의 크리스탈 바이올렛을 첨가하기 전에 PBS로 세포를 한 번 씻는다. 접시를 실온에서 약 20분 동안 로커에 놓고 PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다.마지막 세척 후, 밀리리터당 플라크 성형 단위로 각 우물에서 바이러스의 티터를 계산하기 위해 지시된 바와 같이 수식을 사용하기 전에 플레이트가 적어도 1시간 동안 공기를 건조하게 한다. 중화 분석용 플레이트 셀에 멀티 채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터를 밀리리터당 5세포에 2배 10의 밀도로 추가하고, 37°C와 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 플레이트를 배양한다. 다음 날, 열은 30 분 동안 섭씨 56도 수조에서 테스트 할 환자 혈청 샘플을 비활성화합니다.그런 다음 항생제로 혈청없는 DMEM72 마이크로 리터에 혈청 8 마이크로 리터를 추가하여 빈 96 개의 잘 조직 배양 플레이트에 환자의 혈청 샘플의 10 배 희석 시리즈를 설정합니다. 행 A.Then 는 각 행 H.를 사용하여 H.12 웰 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 행 B와 80 마이크로 리터에 각 행 B와 80 마이크로 리터에 세럼이없는 DMEM 40 마이크로 리터를 추가합니다. 행 A에 샘플을 혼합한 다음 각 행 A웰에서 각 행 B.After 혼합 후 각 웰에서 샘플의 40 마이크로리터를 각 행 F.Next까지 각 후속 웰에 대한 희석을 반복하고, VV 스파이크 EGFP의 40 마이크로리터를 G행에 각각 의 외래에 0.05 의 복합성으로 추가합니다. 그리고 37섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 접시를 배양하기 전에 4~5회 배관하여 섞는다. 인큐베이션의 끝에서, 베로 E6 배양판의 각 우물에서 상체를 신중하게 흡인시키고, 60 마이크로리터의 항체 바이러스 혼합물을 시료 희석 플레이트의 각 웰에서 세포 배양판의 해당 우물로 이송한다. 모든 시료가 전달되면 세포 배양판을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 1시간 동안 배치하여 20분마다 흔들수 있습니다.인큐베이션이 완료된 후, 140마이크로리터의 카박스티메틸셀룰로오스 오버레이 용액을 세포 배양 판의 각 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 34도 및 이산화탄소 인큐베이터로 옮길 수 있습니다. 24시간 후, 488나노미터 파장에서 자동 형광 이미저에 플레이트를 이미지화하고, 개별 EGFP 포시를 정량화하기 위해 이미서의 자동 계수 기능을 사용합니다. 본 대표적인 예에서, SARS-코로나바이러스-2 스파이크 수용체 결합 도메인에 대하여 상업적으로 이용 가능한 중화 항체는 부정적 대조군으로서 IgG와 함께 양성 대조군으로서 사용되었다.백분율 억제는 형광 화상 진찰을 통해 검출된 EGFP foci의 수에 근거하여 계산되었습니다. SARS-coronavirus-2 감염 후 약 3개월 동안 수집된 병변 환자 샘플에 의한 의사바이러스 중화는 입원 환자가 입원을 필요로 하지 않는 환자에 비해 중화 능력이 증가한 것으로 나타났다. 이 절차는 또한 바이러스 감염을 차단하는 것을 목표로 다른 COVID-19 예방 및 치료 제를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...