Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Vi vil takke Whelan lab for sjenerøst å gi VSV-S-eGFP-viruset som brukes i denne protokollen (beskrevet i Case et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for å samle inn pasientblodprøvene (REB-protokoll-ID 20200371-01H). Forfatterne avslører mottak av følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskap og / eller publisering av denne artikkelen: Dette arbeidet ble finansiert av den sjenerøse støtten fra Ottawa Hospital Foundation og et stipend fra Canadian Institutes of Health Research (#448323) og et Fast Grant fra Thistledown-stiftelsen for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansiert av et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs fellowship. JP er finansiert av en klynge Mitacs fellowship. T.A. er finansiert av et CIHR Banting Fellowship. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien.

1. Plating celler (dag 1) for produksjon og kvantifisering av SARS-CoV-2 pseudovirus
<ol><li>Forberedelse for vevskultur<ol>
<li>Varm 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (valgfritt); og 0,25% trypsin-etylendiamin tetraacetic acid (EDTA) til 37 °C i et vannbad i ca. 15 min.</li>
		<li>Desinfiser en vevskulturhette med 70% etanol, og plasser vevskulturretter, Pasteur pipetter og serologiske pipetter ...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

Metoden som beskrives her, kan tilpasses ulike laboratoriemiljøer og ressurser etter behov. Viktigst, hovedbegrensningen av denne protokollen er nødvendigheten av en inneslutning nivå 2 plass og vev kultur hette. Anvendelsen av et replikering av RNA-virus pseudotypet med SARS-CoV-2-spissen, for eksempel VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-viruset, som krever et inneslutningsnivå 3 arbeidsområde, men kan forbli en begrensning for noen grupper. Alle andre trinn som er beskrevet her, er ganske fleks...

I desember 2019 ble det identifisert et nytt koronavirus, som vi nå kjenner som SARS-CoV-2, årsaksmiddelet til koronavirussykdommen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er et betacoronavirus som tilhører Coronaviridae-familien. Disse innkapslede virusene utgjør et stort positivt RNA-genom og er ansvarlige for luftveis- og tarminfeksjoner hos både mennesker og dyr2. Per mai 2021 har det vært mer enn 157 millioner rapporterte tilfeller av COVID-19 globalt og mer enn 3,2 millioner dødsfall3. Utviklingen av en effektiv vaksine har blitt det primære målet for forskere over hele verden med minst 77 prekliniske vaksiner under undersøkelse og 90 som for tiden gjennomgår kliniske studier4.
Koronavirus koder fire strukturelle proteiner, inkludert piggproteinet (S), nukleocapsid (N), konvoluttprotein (E) og membranproteinet (M). Oppføring av SARS-CoV-2 krever interaksjon av reseptorbindingsdomenet (RBD) til S med vertsreseptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og påfølgende membranfusjon etter proteolytisk spalting av vertscelle serinprotease, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9, 10,10 . Humoral immunodominans av S-proteinet til SARS-CoV har tidligere blitt rapportert og har nå også blitt vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk har nøytraliserende antistoffresponser mot S blitt påvist i rekonvalesent serum fra SARS-CoV-pasienter 24 måneder etter infeksjon14, og fremhever deres kritiske rolle i den langsiktige immunresponsen. S-proteinet har blitt identifisert som et lovende vaksinemål og har dermed blitt en nøkkelkomponent i de fleste vaksiner under utvikling15,16.
Mens den raske påvisning av nøytraliserende antistoffer er et kritisk aspekt av vaksineutvikling, kan det også belyse infeksjonshastigheten og seroepidemiologisk overvåking i berørte områder17. En replikasjons-kompetent VSV pseudotypet med SARS-CoV-2 S glykoprotein, i stedet for wild-type VSV glykoprotein, for å studere SARS-CoV-2 infeksjon i biosikkerhet nivå 2 innstillinger ble vennlig donert av Whelan og medarbeidere18. VSV uttrykker spike (VSV-S) vil bli brukt til å bestemme nøytraliserende antistoff respons mot SARS-CoV-2 spike protein. Ettersom VSV-S som brukes her også uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP-foci påvises innen 24 timer for å kvantifisere infeksjon, mens plakkdannelse kan ta 48 til 72 timer. Oppsummert her er en enkel og effektiv protokoll for å bestemme evnen til rekonvalesens pasientserum for å nøytralisere VSV-S-eGFP-infeksjon. Denne metoden kan også enkelt tilpasses for å forhøre andre potensielle terapeutiske behandlinger som tar sikte på å forstyrre den verts-virale interaksjonen mellom SARS-CoV-2 S-protein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

Ettersom COVID-19-pandemien forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsetter å utvikle seg, har det blitt tydelig at tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer mot viruset kan gi beskyttelse mot fremtidig infeksjon. Således, etter hvert som opprettelsen og oversettelsen av effektive COVID-19-vaksiner fortsetter med en enestående hastighet, vil utviklingen av raske og effektive metoder for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 bli stadig viktigere for å bestemme langsiktig beskyttelse mot infeksjon for både tidligere infiserte og immuniserte individer. Dette dokumentet beskriver en protokoll med høy gjennomstrømning ved hjelp av vesikulær stomatittvirus (VSV) pseudotypet med SARS-CoV-2 spike protein for å måle tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer i rekonvalesent serum fra pasienter som nylig har kommet seg fra COVID-19. Bruken av et replikerende pseudotypet virus eliminerer nødvendigheten av et anlegg på nivå 3 som kreves for SARS-CoV-2-håndtering, noe som gjør denne protokollen tilgjengelig for praktisk talt alle inneslutningsnivå 2-laboratorier. Bruken av et 96-brønns format gjør det mulig å kjøre mange prøver samtidig med en kort behandlingstid på 24 timer.

Denne protokollen skisserer en rask og effektiv metode for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 S-protein via hemming av VSV-S-eGFP pseudovirusinfeksjon (kvantifiserbar ved tap av eGFP-foci oppdaget). En skjematisk representasjon av protokollen er vist i figur 1. Det anbefales at et kommersielt tilgjengelig antistoff brukes som en positiv kontroll hver gang analysen kjøres for å sikre konsistensen av analysen. Her demonstrerer vi en fortynningskurve ved hjelp av et kommer...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Protokollen som er beskrevet her skisserer en rask og effektiv metode for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 spike protein ved å evaluere evnen til rekonvalesent serumprøver for å hemme infeksjon av et forbedret grønt fluorescerende proteinmerket vesikulær stomatittvirus pseudotyped med spike glykoprotein.

Påvisning av SARS-CoV-2 Nøytraliserende antistoffer ved bruk av fluorescerende avbildning av pseudovirusinfeksjon med høy gjennomstrømning

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Denne metoden gir en måte å svare på et av de viktigste spørsmålene om SARS-coronavirus-2-vaksinene som er under utvikling. Er vaksinen i stand til å fremkalle en nøytraliserende antistoffrespons? Den største fordelen med denne teknikken er at den kan gjøres i et inneslutningsnivå to anlegg.Det er også relativt raskt og billig, noe som gjør det godt egnet til å analysere mange prøver samtidig. Ved å demonstrere den nøytraliserende syreprosedyren har vi Ricardo Marius, seniortekniker i laboratoriet og Taylor Jamieson, en MD PhD-student. Begynn med å dyrke Vero E6-celler i DMEM supplert med 10% FBS ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For å passere cellene, vask dem først ved å legge til 10 milliliter PBS og forsiktig gynge parabolen fire til fem ganger. Etter å ha aspirert PBS, legg til tre milliliter trypsin EDTA og rock parabolen for å sikre at hele overflaten er dekket før du inkuberer den ved 37 grader Celsius. Når cellene er løsnet, deaktiverer du trypsin ved å legge til syv milliliter DMEM supplert med 10% FBS, og deretter gjenopplive cellene ved å pipettere opp og ned flere ganger.Fjern trypsin ved sentrifugering og aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten før du bruker cellene på nytt i 10 milliliter fersk DMEM. Etter telling legger du til omtrent en gang 10 til de syvende cellene til hver 15 centimeter plate og inkuberer kulturen i en til to dager til cellene er 100% konfluente. For å forberede VSV spike EGFP pseudovirus for titering, infisere cellene ved 0,01 multiplisitet av infeksjon med lagervirus fortynnet i 12 milliliter serumfri DMEM.Etter å ha lagt til viruset, inkuber cellene i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med sporadisk rocking. På slutten av inkubasjonen erstatter du inokulumet med fersk DMEM supplert med 2% FBS og 20 millimolar hauger, og inkuberer deretter cellene ved 34 grader Celsius og 5% karbondioksid i 24 timer. Neste dag, bruk et fluorescerende mikroskop for å visualisere EGFP-uttrykket til de infiserte cellene.Når en omfattende cytopatisk effekt og celleavløsning er observert, samle kulturen supernatant og fjern rusk ved sentrifugering. For å unngå flere fryse-tine sykluser, aliquot supernatant før lagring på minus 80 grader Celsius. For å bestemme den virale titeren, plate Vero E6 celler i seks brønnplater med en sådd tetthet på seks ganger 10 til femte celler per brønn og inkubere over natten.Neste dag, sett opp en ti ganger seriell fortynningsserie av viral lager ved å legge til 900 mikroliter middels til syv mikro-sentrifuge rør og legge til 100 mikroliter viral lager til det første røret. Etter kort virveling, overfør 100 mikroliter fortynnet virus til hvert etterfølgende rør, vortexing mellom hvert rør. Bytt deretter supernatanten i hver brønn på Vero E6 kulturplate med 500 mikroliter av 10 til minus andre til 10 til minus syvende virale fortynning.Etter en 45 minutters inkubasjon i cellekulturinkubatoren med forsiktig gynging hvert 15. På slutten av inkubasjonen, for å visualisere plakkene ved krystallfiolett farging, vask cellene en gang med PBS før du legger til to milliliter 0,1% krystallfiolett til hver brønn. Plasser platen på en rocker i ca. 20 minutter ved romtemperatur før du forsiktig vasker hver brønn to ganger med PBS.Etter siste vask, la platene lufttørke i minst en time før du bruker formelen som angitt for å beregne titeret av viruset i hver brønn i plakkformingsenheter per milliliter. For å plateceller for en nøytraliseringsanalyse, bruk en flerkanals pipette for å legge til 100 mikroliter Vero E6-celler til hver brønn på en 96 brønnplate med en tetthet på to ganger 10 til femte celler per milliliter, og inkubere platen i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Neste dag inaktiverer varmen pasientserumprøvene som skal testes i et 56 grader Celsius vannbad i 30 minutter.Sett deretter opp en ti ganger fortynningsserie av pasientens serumprøver i en tom 96 brønnvevskulturplate ved å legge til åtte mikroliter serum til 72 mikroliter serumfri DMEM med antibiotika i hver brønn av rad A.Tilsett deretter 40 mikroliter serumfri DMEM til hver brønn av rad B til G og 80 mikroliter til hver brønn på rad H.Using a 12 well multichannel pipette, bland prøvene i rad A, og overfør deretter 40 mikroliter av prøven fra hver brønn på rad A til hver brønn på rad B.Etter blanding gjentar du fortynning for hver påfølgende rad med brønner til rad F.Next, tilsett 40 mikroliter VSV spike EGFP ved 0,05 multiplisitet av infeksjon til hver brønn i rad A til G, og bland ved pipettering fire til fem ganger før du inkuberer platen i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. På slutten av inkubasjonen aspirerer du forsiktig supernatanten fra hver brønn på Vero E6-kulturplaten og overfører 60 mikroliter antistoffvirusblanding fra hver brønn av prøvefortynningsplaten til den tilsvarende brønnen på cellekulturplaten. Når alle prøvene er overført, plasser cellekulturplaten på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en time med gynging hvert 20.Etter at inkubasjonen er fullført, tilsett 140 mikroliter karboksymetylcelluloseoverleggsløsning til hver brønn av cellekulturplaten og overfør platen til en 34 grader Celsius og 5% karbondioksidinkubator. Etter 24 timer, bilde platene på en automatisert fluorescerende imager ved 488 nanometer bølgelengde, og bruk den automatiserte tellefunksjonen til imager for å kvantifisere den enkelte EGFP foci. I dette representative eksemplet ble et kommersielt tilgjengelig nøytraliserende antistoff mot SARS-coronavirus-2 spike reseptorbindingsdomenet brukt som en positiv kontroll, sammen med IgG som en negativ kontroll.Prosenthemmingen ble beregnet basert på antall EGFP-foci som ble påvist via fluorescerende avbildning. Pseudovirusnøytralisering ved rekonvalesent pasientprøver samlet inn omtrent tre måneder etter SARS-coronavirus-2-infeksjon viste at innlagte pasienter viste økt nøytraliserende kapasitet sammenlignet med de som ikke krevde sykehusinnleggelse. Denne prosedyren kan også brukes til å evaluere andre COVID-19 forebygging og terapeutiske midler som tar sikte på å blokkere virusinfeksjon.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generasjon av Escape varianter av nøytralisere influensa Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En rask, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyse for et Multiplexed Bead-basert flytanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Påvisning av SARS-CoV-2 reseptorbindende domeneantistoff ved hjelp av en HiBiT-basert bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkripsjon PCR spytt diagnostisk strategi ved hjelp av åpen kildekode pipettering roboter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypede virus som et molekylært verktøy for å overvåke humorale immunresponser mot SARS-CoV-2 via nøytraliseringsanalyse

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...