Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao laboratório Whelan por fornecer generosamente o vírus VSV-S-eGFP usado neste protocolo (descrito no Case et al. 2020). Agradecemos também aos Drs. Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e equipe) pela coleta das amostras de sangue do paciente (ID do protocolo REB 20200371-01H). Os autores divulgam o recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: Este trabalho foi financiado pelo generoso apoio da Fundação Hospitalar de Ottawa e uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (#448323) e uma Bolsa Rápida da Fundação Thistledown para a Ciência COVID-19 para c.S.I. T.R.J. é financiada por uma bolsa de pós-graduação de Ontário e uma bolsa mitacs de cluster. JP é financiado por uma bolsa mitacs cluster. A T.A. é financiada por uma Cihr Banting Fellowship. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo.

1. Células de chapeamento (Dia 1) para a produção e quantificação do pseudovírus SARS-CoV-2
<ol><li>Preparação para a cultura tecidual<ol>
<li>Salina Fosfato-Tampão-Tampão de Dulbecco (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (opcional); e 0,25% de ácido tetraáctico de tripca-etilenodiamina (EDTA) a 37 °C em banho-maria por aproximadamente 15 minutos.</li>
		<li>Desinfete uma capa de cultura tecidual com 70% de etanol, e coloque p...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. 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K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

O método aqui descrito pode ser adaptado para atender a diferentes ambientes e recursos de laboratório, conforme necessário. É importante ressaltar que a principal limitação deste protocolo é a necessidade de um espaço de contenção nível 2 e uma capa de cultura tecidual. A aplicação de um vírus RNA replicante pseudotipado com o pico SARS-CoV-2, como VSV-S-eGFP, é uma alternativa formidável ao vírus SARS-CoV-2, que requer uma área de trabalho nível 3 de contenção, mas pode permanecer uma limitação p...

Em dezembro de 2019, foi identificado um novo coronavírus, que hoje conhecemos como SARS-CoV-2, o agente causador da doença coronavírus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 é um betacoronavírus pertencente à família Coronaviridae. Esses vírus envoltos compreendem um genoma de RNA de grande senso positivo e são responsáveis por infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais2. Até maio de 2021, foram registrados mais de 157 milhões de casos notificados de COVID-19 globalmente e mais de 3,2 milhões de mortes3. O desenvolvimento de uma vacina eficaz tornou-se o objetivo principal de pesquisadores em todo o mundo com pelo menos 77 vacinas pré-clínicas sob investigação e 90 atualmente submetidas a testes clínicos4.
Coronavírus codificam quatro proteínas estruturais, incluindo a proteína do pico (S), nucleocapsid (N), proteína envelope (E) e a proteína da membrana (M). A entrada do SARS-CoV-2 requer interação do domínio receptor-vinculativo (RBD) de S com o receptor hospedeiro, enzima conversor de angiotensina humana 2 (hACE2), e posterior fusão de membrana seguindo o decote proteolítico por serina hospedeira, soro de protease transmembrana 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . A imunodominância humoral da proteína S do SARS-CoV foi relatada anteriormente e agora foi mostrada também para SARS-CoV-211,12,13. De fato, as respostas neutralizantes de anticorpos contra S foram detectadas em soro convalescente de pacientes sars-cov 24 meses após a infecção14, destacando seu papel crítico na resposta imune a longo prazo. A proteína S foi identificada como um alvo vacinal promissor e, portanto, tornou-se um componente-chave da maioria das vacinas em desenvolvimento15,16.
Embora a rápida detecção de anticorpos neutralizantes seja um aspecto crítico do desenvolvimento de vacinas, também pode lançar luz sobre a taxa de infecção e vigilância soro-epidemiológica nas áreas impactadas17. Um pseudotipado VSV competente para replicação com a glicoproteína SARS-CoV-2 S, no lugar da glicoproteína VSV do tipo selvagem, para estudar a infecção pelo SARS-CoV-2 em configurações de biossegurança nível 2 foi gentilmente doada por Whelan e colegas de trabalho18. O pico de expressão VSV (VSV-S) será utilizado para determinar a resposta neutralizante de anticorpos contra a proteína de pico SARS-CoV-2. Como o VSV-S usado aqui também expressa proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), os focos eGFP podem ser detectados dentro de 24 horas para quantificar a infecção, enquanto a formação de placas pode levar de 48 a 72 h. Resumido aqui está um protocolo simples e eficaz para determinar a capacidade do soro convalescente do paciente de neutralizar a infecção vsv-S-eGFP. Este método também pode ser facilmente adaptado para interrogar outras terapêuticas potenciais que visam interromper a interação hosmá-viral da proteína SARS-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

À medida que a pandemia COVID-19 causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) continua a evoluir, tornou-se evidente que a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus pode fornecer proteção contra infecções futuras. Assim, à medida que a criação e tradução de vacinas eficazes COVID-19 continua em uma velocidade sem precedentes, o desenvolvimento de métodos rápidos e eficazes para medir anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 se tornará cada vez mais importante para determinar a proteção a longo prazo contra infecções para indivíduos previamente infectados e imunizados. Este artigo descreve um protocolo de alto rendimento usando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína de pico SARS-CoV-2 para medir a presença de anticorpos neutralizantes em soro convalescente de pacientes que se recuperaram recentemente do COVID-19. O uso de um vírus pseudotipado replicante elimina a necessidade de uma instalação de nível 3 de contenção necessária para o manuseio sars-cov-2, tornando este protocolo acessível a praticamente qualquer laboratório nível de contenção 2. O uso de um formato de 96 poços permite que muitas amostras sejam executadas ao mesmo tempo com um curto tempo de retorno de 24 horas.

Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para detectar anticorpos neutralizantes contra a proteína SARS-CoV-2 S através da inibição da infecção por pseudovírus VSV-S-eGFP (quantificável pela perda de focos eGFP detectados). Uma representação esquemática do protocolo é retratada na Figura 1. Recomenda-se que um anticorpo comercialmente disponível seja usado como um controle positivo cada vez que o ensaio é executado para garantir a consistência do ensaio. Aqui, demon...

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Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Este método fornece uma maneira de responder a uma das questões mais importantes relativas às vacinas SARS-coronavirus-2 em desenvolvimento. A vacina é capaz de obter uma resposta neutralizante de anticorpos? A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser feita em uma instalação de contenção nível dois.Também é relativamente rápido e barato, tornando-o adequado para analisar muitas amostras ao mesmo tempo. Demonstrando o procedimento ácido neutralizante, temos Ricardo Marius, um técnico sênior no laboratório e Taylor Jamieson, um estudante de doutorado em Doutorado. Comece por culminar células Vero E6 em DMEM suplementadas com 10% FBS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para passar as células, primeiro lave-as adicionando 10 mililitros de PBS e balançando suavemente o prato quatro a cinco vezes. Depois de aspirar o PBS, adicione três mililitros de trippsina EDTA e balance o prato para garantir que toda a superfície esteja coberta antes de incuba-la a 37 graus Celsius. Uma vez que as células tenham se destacado, desative a trippsina adicionando sete mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS, em seguida, resuspend as células pipetando para cima e para baixo várias vezes.Remova a trippsina por centrifugação e aspire o supernatário sem perturbar a pelota celular antes de reutilizar as células em 10 mililitros de DMEM fresco. Após a contagem, adicione aproximadamente uma vez 10 às sete células a cada placa de 15 centímetros e incuba a cultura por um a dois dias até que as células sejam 100% confluentes. Para preparar o pseudovírus EGFP de pico VSV para titering, infecte as células a 0,01 multiplicidade de infecção com o vírus de estoque diluído em 12 mililitros de DMEM sem soro.Depois de adicionar o vírus, incubar as células por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com balanço ocasional. No final da incubação, substitua o inóculo por DMEM fresco suplementado com 2%FBS e 20 mililitros, em seguida, incubar as células a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, use um microscópio fluorescente para visualizar a expressão EGFP das células infectadas.Uma vez observado um extenso efeito citopático e o descolamento celular, colete a cultura sobrenatante e remova os detritos por centrifugação. Para evitar vários ciclos de congelamento, aliquot o supernatante antes de armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para determinar o titer viral, as células de placa Vero E6 em seis placas de poço a uma densidade de semeadura de seis vezes 10 para as quintas células por poço e incubam durante a noite.No dia seguinte, configure uma série de diluição serial dez vezes do estoque viral adicionando 900 microliters de tubos de microcrédito a sete microcrífugas e adicionando 100 microliters de estoque viral ao primeiro tubo. Após um breve vórtice, transfira 100 microliters de vírus diluído para cada tubo subsequente, vórtices entre cada tubo. Em seguida, substitua o supernaente em cada poço da placa de cultura Vero E6 por 500 microliters dos 10 para o menos segundo a 10 para as diluições menos sétima viral.Após uma incubação de 45 minutos na incubadora de cultura celular com balanço suave a cada 15 minutos, substitua o inóculo por uma solução de sobreposição e incuba as células a 34 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. No final da incubação, para visualizar as placas por coloração violeta cristalina, lave as células uma vez com PBS antes de adicionar dois mililitros de 0,1% de violeta cristalina a cada poço. Coloque a placa em um roqueiro por aproximadamente 20 minutos em temperatura ambiente antes de lavar suavemente cada poço duas vezes com PBS.Após a última lavagem, deixe as placas secarem pelo menos uma hora antes de usar a fórmula indicada para calcular o título do vírus em cada poço em unidades formadoras de placas por mililitro. Para emplacar células para um ensaio de neutralização, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 microliters de células Vero E6 a cada poço de uma placa de poço de 96 a uma densidade de duas vezes 10 a cinco células por mililitro, e incubar a placa por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, o calor inativa as amostras de soro do paciente a serem testadas em um banho de água de 56 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, configure uma série de diluição dez vezes das amostras de soro do paciente em uma placa vazia de cultura de tecido de 96 poços adicionando oito microliters do soro a 72 microliters de DMEM sem soro com antibióticos em cada bem da linha A.Em seguida, adicione 40 microliters de DMEM sem soro a cada poço de linhas B a G e 80 microliters a cada poço de linha H.Usando uma pipeta multicanal de 12 poços, misturar as amostras na linha A, depois transfira 40 microliters da amostra de cada poço da linha A para cada poço da linha B.Após a mistura, repita a diluição para cada linha subsequente de poços até a linha F.Next, adicione 40 microliters de VSV egFP em 0,05 multiplicidade de infecção para cada poço nas linhas A a G, e misture por pipetar quatro a cinco vezes antes de incubar a placa por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, aspire cuidadosamente o supernaente de cada poço da placa de cultura Vero E6 e transfira 60 microliters de mistura de vírus de anticorpos de cada poço da placa de diluição amostral para o poço correspondente da placa de cultura celular. Quando todas as amostras tiverem sido transferidas, coloque a placa de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora com balanço a cada 20 minutos.Após a conclusão da incubação, adicione 140 microliters de solução de sobreposição de carboximetilcelulose a cada poço da placa de cultura celular e transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono de 34 graus Celsius e 5%. Após 24 horas, imagem as placas em um imager fluorescente automatizado a 488 comprimentos de onda nanômetros, e use o recurso de contagem automatizada do imager para quantificar os focos EGFP individuais. Neste exemplo representativo, um anticorpo neutralizante comercialmente disponível contra o domínio de ligação do receptor de pico SARS-coronavirus-2 foi usado como um controle positivo, ao lado do IgG como um controle negativo.A inibição percentual foi calculada com base no número de focos EGFP detectados via imagem fluorescente. A neutralização do pseudovírus por amostras de pacientes convalescentes coletadas aproximadamente três meses após a infecção pelo SARS-coronavírus-2 mostrou que os pacientes hospitalizados demonstraram uma maior capacidade de neutralização em comparação com aqueles que não necessitaram de internação. Este procedimento também pode ser utilizado para avaliar outros agentes de prevenção e terapêutica COVID-19 que visam bloquear a infecção viral.

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Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...