Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Уилана за щедрое предоставление вируса VSV-S-eGFP, используемого в этом протоколе (описанного в Case et al. 2020). Мы также благодарим докторов Билла Кэмерона и Ютапорна Коуэна (и команду) за сбор образцов крови пациента (идентификатор протокола REB 20200371-01H). Авторы раскрывают получение следующей финансовой поддержки для исследования, авторства и / или публикации этой статьи: Эта работа была профинансирована щедрой поддержкой Фонда больницы Оттавы и грантом от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (#448323) и быстрым грантом от фонда Thistledown для науки о COVID-19 C.S.I. T.R.J. финансируется стипендией для выпускников Онтарио и кластерной стипендией Mitacs. JP финансируется кластерной стипендией Mitacs. T.A. финансируется CIHR Banting Fellowship. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования.

1. Покрывающие клетки (День 1) для производства и количественной оценки псевдовируса SARS-CoV-2
<ol><li>Подготовка к посеву тканей<ol>
<li>Теплый 1x фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS); Модифицированная орлиная среда (DMEM) от Dulbecco, содержащая 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% пеници?...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

Метод, описанный здесь, может быть адаптирован к различным лабораторным средам и ресурсам по мере необходимости. Важно отметить, что основным ограничением этого протокола является необходимость защиты пространства уровня 2 и вытяжки культуры тканей. Применение реплицируемого РНК-вир?...

В декабре 2019 года был выявлен новый коронавирус, который мы теперь знаем как SARS-CoV-2, возбудитель коронавирусной болезни 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 — бетакоронавирус, принадлежащий к семейству Coronaviridae. Эти вирусы в оболочке содержат большой геном РНК с положительным смыслом и ответственны за респираторные и кишечные инфекции как у людей, так и уживотных2. По состоянию на май 2021 года во всем мире зарегистрировано более 157 миллионов случаев COVID-19 и более 3,2 миллиона смертей3. Разработка эффективной вакцины стала основной целью исследователей по всему миру, по крайней мере, 77 доклинических вакцин находятся в стадии исследования и 90 в настоящее время проходят клинические испытания4.
Коронавирусы кодируют четыре структурных белка, включая спайк-белок (S), нуклеокапсид (N), белок оболочки (E) и мембранный белок (M). Вступление SARS-CoV-2 требует взаимодействия рецептор-связывающего домена (RBD) S с рецептором хозяина, человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) и последующим слиянием мембран после протеолитического расщепления клеточной сериновой протеазой хозяина, трансмембранной протеазой серином 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Гуморальная иммунодоминальность S-белка SARS-CoV была ранее сообщена и теперь показана также для SARS-CoV-211,12,13. Действительно, нейтрализующие реакции антител против S были обнаружены у выздоравливающих сывороток пациентов с SARS-CoV через 24 месяца после заражения14,что подчеркивает их критическую роль в долгосрочном иммунном ответе. Белок S был идентифицирован как перспективная мишень для вакцин и, таким образом, стал ключевым компонентом большинства разрабатываемых вакцин15,16.
Хотя быстрое выявление нейтрализующих антител является критическим аспектом разработки вакцины, оно может также пролить свет на уровень инфицирования и сероэпидемиологический надзор в затронутых районах17. Компетентный к репликации VSV псевдотипизированный с гликопротеином SARS-CoV-2 S вместо гликопротеина VSV дикого типа для изучения инфекции SARS-CoV-2 в условиях биобезопасности уровня 2 был любезно пожертвован Уиланом и его коллегами18. VSV-экспрессирующий спайк (VSV-S) будет использоваться для определения нейтрализующего ответа антител против спайкового белка SARS-CoV-2. Поскольку VSV-S, используемый здесь, также экспрессирует усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), очаги eGFP могут быть обнаружены в течение 24 ч для количественной оценки инфекции, тогда как образование бляшек может занять от 48 до 72 ч. Здесь обобщен простой и эффективный протокол определения способности выздоравливающей сыворотки пациента нейтрализовать инфекцию VSV-S-eGFP. Этот метод также может быть легко адаптирован для опроса других потенциальных терапевтических средств, которые направлены на нарушение взаимодействия хозяина с вирусом белка SARS-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

Поскольку пандемия COVID-19, вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), продолжает развиваться, стало очевидно, что наличие нейтрализующих антител против вируса может обеспечить защиту от будущей инфекции. Таким образом, поскольку создание и трансляция эффективных вакцин против COVID-19 продолжается с беспрецедентной скоростью, разработка быстрых и эффективных методов измерения нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 будет становиться все более важной для определения долгосрочной защиты от инфекции как для ранее инфицированных, так и для иммунизированных лиц. В этой статье описывается высокопроизводительный протокол с использованием вируса везикулярного стоматита (VSV), псевдотипизированного с шиповым белком SARS-CoV-2, для измерения наличия нейтрализующих антител в реконвалесцентной сыворотке у пациентов, которые недавно выздоровели от COVID-19. Использование реплицируемого псевдотипного вируса устраняет необходимость в объекте сдерживания уровня 3, необходимом для обработки SARS-CoV-2, что делает этот протокол доступным практически для любой лаборатории уровня сдерживания 2. Использование формата 96 скважин позволяет одновременно запускать множество образцов с коротким временем обработки 24 ч.

В этом протоколе описан быстрый и эффективный метод обнаружения нейтрализующих антител против белка SARS-CoV-2 S путем ингибирования псевдовирусной инфекции VSV-S-eGFP (количественно определяемой по потере обнаруженных очагов eGFP). Схематическое представление протокола показано на <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Протокол, описанный здесь, описывает быстрый и эффективный метод измерения нейтрализующих антител против спайкового белка SARS-CoV-2 путем оценки способности реконвалесцентных образцов сыворотки ингибировать инфекцию усиленным зеленым флуоресцентным белком меченым вирусом везикулярного стоматита, псевдотипизированным с шиповым гликопротеином.

Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Этот метод дает способ ответить на один из наиболее важных вопросов, касающихся разрабатываемых вакцин против SARS-коронавируса-2. Способна ли вакцина вызывать нейтрализующий ответ антител? Основным преимуществом этой техники является то, что она может быть выполнена в защитной изоляции второго уровня.Он также относительно быстрый и недорогой, что делает его хорошо подходящим для анализа многих образцов одновременно. Демонстрируя процедуру нейтрализации кислоты, у нас есть Рикардо Мариус, старший техник в лаборатории и Тейлор Джеймисон, аспирант MD. Начните с культивирования клеток Vero E6 в DMEM, дополненных 10% FBS при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Чтобы пройти клетки, сначала вымойте их, добавив 10 миллилитров PBS и осторожно раскачивая блюдо четыре-пять раз. После аспирации PBS добавьте три миллилитра трипсина ЭДТА и покачайте блюдо, чтобы убедиться, что вся поверхность покрыта перед инкубацией при 37 градусах Цельсия. Как только клетки отделяются, деактивируйте трипсин, добавив семь миллилитров DMEM, дополненных 10% FBS, а затем повторно суспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз несколько раз.Удалите трипсин центрифугированием и аспирировать супернатант, не нарушая клеточную гранулу, прежде чем повторно сусминать клетки в 10 миллилитрах свежего DMEM. После подсчета добавляйте примерно один раз 10 к седьмой клетке к каждой 15-сантиметровой пластине и инкубируют культуру в течение одного-двух дней, пока клетки не будут на 100% сливаться. Чтобы подготовить vsv спайковый псевдовирус EGFP к титрованию, инфицировать клетки при кратности заражения 0,01 стоковым вирусом, разведенным в 12 миллилитрах бессывороточного DMEM.После добавления вируса инкубируют клетки в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа с периодическим раскачиванием. В конце инкубации замените инокуляту свежим DMEM, дополненным 2% FBS и 20 миллимолярными кучами, затем инкубируют клетки при 34 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. На следующий день используйте флуоресцентный микроскоп для визуализации экспрессии EGFP инфицированных клеток.Как только наблюдается обширный цитопатический эффект и отслоение клеток, соберите супернатант культуры и удалите мусор центрифугированием. Чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания, аликвотирует супернатант перед хранением при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы определить вирусный титр, пластинчатые клетки Vero E6 в шести колодцах пластин при плотности посева от шести раз 10 до пятой клетки на скважину и инкубируют в течение ночи.На следующий день установили десятикратную серию серийного разведения вирусного запаса, добавив 900 микролитров среды к семи микроцентрифужным трубкам и добавив 100 микролитров вирусного запаса в первую трубку. После кратковременного вихря перенесите 100 микролитров разбавленного вируса в каждую последующую трубку, вихрев между каждой трубкой. Затем замените супернатант в каждой лунки культурального листа Vero E6 на 500 микролитров от 10 до минус секунды до 10 до минус седьмого вирусного разведения.После 45-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры с аккуратным раскачиванием каждые 15 минут замените инокуляту накладным раствором и инкубируйте клетки при 34 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов. В конце инкубации, чтобы визуализировать бляшки путем окрашивания кристаллического фиолетового цвета, промыть клетки один раз PBS, прежде чем добавлять два миллилитра 0,1% кристаллического фиолетового цвета в каждую лунку. Поместите пластину на коромысло в течение примерно 20 минут при комнатной температуре, прежде чем аккуратно промыть каждую скважину два раза PBS.После последней промывки дайте пластинам высохнуть на воздухе в течение не менее одного часа, прежде чем использовать формулу, указанную для расчета титра вируса в каждой скважине в единицах образования бляшек на миллилитр. Для пластинчатых ячеек для анализа нейтрализации используют многоканальный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров ячеек Vero E6 в каждую лунку пластины из 96 лунок при плотности в два раза 10 к пятой ячейке на миллилитр и инкубировать пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день тепло инактивирует образцы сыворотки пациента, которые должны быть проверены на водяной бане с температурой 56 градусов цельсия в течение 30 минут.Затем устанавливают десятикратную серию разведения образцов сыворотки пациента в пустой 96-луночной пластине для культивирования тканей, добавляя восемь микролитров сыворотки к 72 микролитрам безсыворочного DMEM с антибиотиками в каждой лунке ряда A.Затем добавьте 40 микролитров безсыворочного DMEM к каждой лунке рядов B до G и 80 микролитров к каждой лунке ряда H.Используя 12-луночную многоканальную пипетку, смешать образцы в строке A, затем перенести 40 микролитров образца из каждой скважины ряда A в каждую лунку ряда B. После смешивания повторите разбавление для каждого последующего ряда скважин до ряда F.Далее добавьте 40 микролитров VSV spike EGFP при кратности заражения 0,05 к каждой скважине в рядах A до G, и перемешать, пипетируя четыре-пять раз перед инкубацией пластины в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. В конце инкубации осторожно аспирируют супернатант из каждой лунки культуральной пластины Vero E6 и переносят 60 микролитров смеси вируса антител из каждой лунки пластины разбавления образца в соответствующий колодец пластины клеточной культуры. Когда все образцы будут переданы, поместите пластину клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа с раскачиваемостью каждые 20 минут.После завершения инкубации добавляют 140 микролитров накладного раствора карбоксиметилцеллюлозы в каждую лунку пластины клеточной культуры и переносят пластину в инкубатор с содержанием диоксида углерода 34 градуса Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа визульцируйте пластины на автоматизированном флуоресцентном томообразователье с длиной волны 488 нанометров и используйте функцию автоматического подсчета томорабля для количественной оценки отдельных очагов EGFP. В этом репрезентативном примере коммерчески доступное нейтрализующее антитело против домена связывания спайк-рецепторов SARS-coronavirus-2 использовалось в качестве положительного контроля, наряду с IgG в качестве отрицательного контроля.Процент ингибирования был рассчитан на основе количества очагов EGFP, обнаруженных с помощью флуоресцентной визуализации. Нейтрализация псевдовируса образцами выздоравливающих пациентов, собранными примерно через три месяца после заражения SARS-коронавирусом-2, показала, что госпитализированные пациенты продемонстрировали повышенную нейтрализующую способность по сравнению с теми, кто не требовал госпитализации. Эта процедура также может быть использована для оценки других профилактических и терапевтических агентов COVID-19, которые направлены на блокирование вирусной инфекции.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Экспресс-мультиплексный двойной репортер IgG и IgM SARS-CoV-2 нейтрализуя для мультиплексированной системы анализа потоков на основе шариков

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Эффективная sars-CoV-2 количественная обратная транскриптаза ПЦР стратегия диагностики слюны с использованием роботов для пипетирования с открытым исходным кодом

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...