Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
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Nos gustaría agradecer al laboratorio Whelan por proporcionar generosamente el virus VSV-S-eGFP utilizado en este protocolo (descrito en Case et al. 2020). También agradecemos a los dres. Bill Cameron y Juthaporn Cowan (y al equipo) por recolectar las muestras de sangre del paciente (ID de protocolo REB 20200371-01H). Los autores revelan la recepción del siguiente apoyo financiero para la investigación, autoría y / o publicación de este artículo: Este trabajo fue financiado por el generoso apoyo de la Fundación del Hospital de Ottawa y una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (# 448323) y una subvención rápida de la Fundación Thistledown para la Ciencia COVID-19 a C.S.I. T.R.J. está financiada por una beca de posgrado de Ontario y una beca Mitacs del clúster. JP está financiado por una beca Mitacs del clúster. T.A. está financiado por una beca de banting del CIHR. También nos gustaría agradecer a todas las personas que participaron y donaron sus muestras de sangre para este estudio.

1. Células de recubrimiento (Día 1) para la producción y cuantificación del pseudovirus SARS-CoV-2
<ol><li>Preparación para el cultivo de tejidos<ol>
<li>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Warm 1x Dulbecco; El Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (opcional); y ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA) al 0,25% a 37 °C en un baño de agua durante aproximadamente 15 min.</li>
		<li>Desinfecte una campana ...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

El método descrito aquí puede adaptarse para adaptarse a diferentes entornos y recursos de laboratorio según sea necesario. Es importante destacar que la principal limitación de este protocolo es la necesidad de un espacio de contención de nivel 2 y una campana de cultivo de tejidos. La aplicación de un virus de ARN replicante pseudotipado con el pico del SARS-CoV-2, como el VSV-S-eGFP, es una alternativa formidable al virus SARS-CoV-2, que requiere un área de trabajo de nivel 3 de contención, pero puede seguir s...

En diciembre de 2019, se identificó un nuevo coronavirus, que ahora conocemos como SARS-CoV-2, el agente causal de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)1. El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus perteneciente a la familia Coronaviridae. Estos virus envueltos comprenden un gran genoma de ARN de sentido positivo y son responsables de infecciones respiratorias e intestinales tanto en humanos como en animales2. Hasta mayo de 2021 se han reportado más de 157 millones de casos de COVID-19 en todo el mundo y más de 3.2 millones de muertes3. El desarrollo de una vacuna eficaz se ha convertido en el objetivo principal de los investigadores de todo el mundo con al menos 77 vacunas preclínicas bajo investigación y 90 actualmente en fase de ensayos clínicos4.
Los coronavirus codifican cuatro proteínas estructurales, incluida la proteína espiga (S), la nucleocápside (N), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de membrana (M). La entrada del SARS-CoV-2 requiere la interacción del dominio de unión al receptor (RBD) de S con el receptor del huésped, la enzima convertidor de angiotensina humana 2 (hACE2) y la posterior fusión de la membrana después de la escisión proteolítica por la serina proteasa celular del huésped, la serina serina 2 de la proteasa transmembrana (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . La inmunodominancia humoral de la proteína S del SARS-CoV se ha informado previamente y ahora se ha demostrado también para el SARS-CoV-211,12,13. De hecho, se han detectado respuestas de anticuerpos neutralizantes contra S en suero convaleciente de pacientes con SARS-CoV 24 meses después de la infección14,destacando su papel crítico en la respuesta inmune a largo plazo. La proteína S ha sido identificada como un objetivo prometedor de la vacuna y, por lo tanto, se ha convertido en un componente clave de la mayoría de las vacunas en desarrollo15,16.
Si bien la detección rápida de anticuerpos neutralizantes es un aspecto crítico del desarrollo de vacunas, también puede arrojar luz sobre la tasa de infección y la vigilancia seroepidemiológica en las áreas afectadas17. Whelan y sus compañeros de trabajodonaronamablemente un vsV de tipo salvaje pseudotipado con la glicoproteína SARS-CoV-2 S, en lugar de la glicoproteína VSV de tipo salvaje, para estudiar la infección por SARS-CoV-2 en entornos de nivel 2 de bioseguridad 2. El pico de expresión de VSV (VSV-S) se utilizará para determinar la respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2. Como el VSV-S utilizado aquí también expresa proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), los focos de eGFP pueden detectarse dentro de las 24 h para cuantificar la infección, mientras que la formación de placa puede tardar de 48 a 72 h. Aquí se resume un protocolo simple y efectivo para determinar la capacidad del suero del paciente convaleciente para neutralizar la infección por VSV-S-eGFP. Este método también se puede adaptar fácilmente para interrogar otras terapias potenciales que tienen como objetivo interrumpir la interacción huésped-viral de la proteína SARS-CoV-2 S.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

A medida que la pandemia de COVID-19 causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) continúa evolucionando, se ha hecho evidente que la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus puede proporcionar protección contra futuras infecciones. Por lo tanto, a medida que la creación y traducción de vacunas efectivas contra la COVID-19 continúe a una velocidad sin precedentes, el desarrollo de métodos rápidos y efectivos para medir los anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 será cada vez más importante para determinar la protección a largo plazo contra la infección tanto para las personas previamente infectadas como para las inmunizadas. Este artículo describe un protocolo de alto rendimiento que utiliza el virus de la estomatitis vesicular (VSV) pseudotipado con la proteína espiga del SARS-CoV-2 para medir la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero convaleciente de pacientes que se han recuperado recientemente de COVID-19. El uso de un virus pseudotipado replicante elimina la necesidad de una instalación de contención de nivel 3 requerida para el manejo del SARS-CoV-2, lo que hace que este protocolo sea accesible para prácticamente cualquier laboratorio de contención de nivel 2. El uso de un formato de 96 pozos permite ejecutar muchas muestras al mismo tiempo con un corto tiempo de respuesta de 24 h.

Este protocolo describe un método rápido y eficaz para detectar anticuerpos neutralizantes contra la proteína SARS-CoV-2 S a través de la inhibición de la infección por pseudovirus VSV-S-eGFP (cuantificable por la pérdida de focos de eGFP detectada). Una representación esquemática del protocolo se representa en la Figura 1. Se recomienda que se utilice un anticuerpo disponible comercialmente como control positivo cada vez que se ejecute el ensayo para garantizar la consistencia del ...

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Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Este método proporciona una forma de responder a una de las preguntas más importantes relacionadas con las vacunas contra el SARS-coronavirus-2 en desarrollo. ¿Es la vacuna capaz de provocar una respuesta de anticuerpos neutralizantes? La principal ventaja de esta técnica es que se puede hacer en una instalación de contención de nivel dos.También es relativamente rápido y económico, por lo que es muy adecuado para analizar muchas muestras a la vez. Demostrando el procedimiento de ácido neutralizante, tenemos a Ricardo Marius, un técnico superior en el laboratorio y Taylor Jamieson, un estudiante de doctorado MD. Comience cultivando células Vero E6 en DMEM suplementadas con 10% FBS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Para pasar las células, primero lávelas agregando 10 mililitros de PBS y meciendo suavemente el plato de cuatro a cinco veces. Después de aspirar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina EDTA y balancee el plato para asegurarse de que toda la superficie esté cubierta antes de incubarlo a 37 grados centígrados. Una vez que las células se hayan desprendido, desactive la tripsina agregando siete mililitros de DMEM suplementados con 10% FBS, luego resuspenda las células mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces.Retire la tripsina por centrifugación y aspire el sobrenadante sin perturbar la bolita celular antes de volver a suspender las células en 10 mililitros de DMEM fresco. Después de contar, agregue aproximadamente una vez 10 a las séptimas células a cada placa de 15 centímetros e incube el cultivo durante uno o dos días hasta que las células sean 100% confluentes. Para preparar el pseudovirus EGFP de pico VSV para la titulación, infecte las células a 0.01 multiplicidad de infección con el virus stock diluido en 12 mililitros de DMEM sin suero.Después de agregar el virus, incube las células durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con balanceo ocasional. Al final de la incubación, reemplace el inóculo con DMEM fresco suplementado con 2% FBS y 20 montones milimolares, luego incube las células a 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, use un microscopio fluorescente para visualizar la expresión de EGFP de las células infectadas.Una vez que se observa un efecto ciopático extenso y desprendimiento celular, recoger el sobrenadante de cultivo y eliminar los restos por centrifugación. Para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación, alícuota el sobrenadante antes del almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Para determinar el título viral, platee las células Vero E6 en seis placas de pozo a una densidad de siembra de seis veces 10 a la quinta célula por pozo e incube durante la noche.Al día siguiente, configure una serie de dilución en serie de diez veces del stock viral agregando 900 microlitros de tubos de microcentrífuga media a siete y agregando 100 microlitros de stock viral al primer tubo. Después de un breve vórtice, transfiera 100 microlitros de virus diluido a cada tubo posterior, vórtice entre cada tubo. Luego reemplace el sobrenadante en cada pozo de la placa de cultivo Vero E6 con 500 microlitros de las diluciones virales de 10 a menos segundo a menos 10 a menos séptimo.Después de una incubación de 45 minutos en la incubadora de cultivo celular con un balanceo suave cada 15 minutos, reemplace el inóculo con una solución superpuesta e incube las células a 34 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Al final de la incubación, para visualizar las placas por tinción de cristal violeta, lave las células una vez con PBS antes de agregar dos mililitros de violeta de cristal al 0,1% a cada pozo. Coloque la placa en un balancín durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente antes de lavar suavemente cada pozo dos veces con PBS.Después del último lavado, deje que las placas se sequen al aire durante al menos una hora antes de usar la fórmula indicada para calcular el título del virus en cada pozo en unidades formadoras de placa por mililitro. Para platear las células para un ensayo de neutralización, use una pipeta multicanal para agregar 100 microlitros de células Vero E6 a cada pozo de una placa de 96 pozos a una densidad de dos veces 10 a la quinta celda por mililitro, e incube la placa durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, el calor inactiva las muestras de suero del paciente para ser analizadas en un baño de agua de 56 grados centígrados durante 30 minutos.Luego configure una serie de dilución de diez veces de las muestras de suero del paciente en una placa de cultivo de tejido vacía de 96 pozos agregando ocho microlitros del suero a 72 microlitros de DMEM sin suero con antibióticos en cada pozo de la fila A.Luego agregue 40 microlitros de DMEM sin suero a cada pozo de las filas B a G y 80 microlitros a cada pozo de la fila H.Usando una pipeta multicanal de 12 pozos, mezclar las muestras en la fila A, luego transferir 40 microlitros de la muestra de cada pozo de la fila A a cada pozo de la fila B.Después de mezclar, repita la dilución para cada fila posterior de pozos hasta la fila F.A continuación, agregue 40 microlitros de ESPIGA VSV EGFP a 0.05 multiplicidad de infección a cada pozo en las filas A a G, y mezclar mediante pipeteo de cuatro a cinco veces antes de incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, aspire cuidadosamente el sobrenadante de cada podo de la placa de cultivo Vero E6 y transfiera 60 microlitros de mezcla de virus de anticuerpos de cada podo de la placa de dilución de la muestra al pozo correspondiente de la placa de cultivo celular. Cuando todas las muestras hayan sido transferidas, coloque la placa de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora con balanceo cada 20 minutos.Después de completar la incubación, agregue 140 microlitros de solución superpuesta de carboximetilcelulosa a cada podo de la placa de cultivo celular y transfiera la placa a una incubadora de 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, imagine las placas en un generador de imágenes fluorescente automatizado a una longitud de onda de 488 nanómetros y utilice la función de conteo automatizado del generador de imágenes para cuantificar los focos individuales de EGFP. En este ejemplo representativo, se utilizó un anticuerpo neutralizante disponible comercialmente contra el dominio de unión al receptor de picos del SARS-coronavirus-2 como control positivo, junto con IgG como control negativo.El porcentaje de inhibición se calculó en función del número de focos de EGFP detectados a través de imágenes fluorescentes. La neutralización por pseudovirus por muestras de pacientes convalecientes recolectadas aproximadamente tres meses después de la infección por SARS-coronavirus-2 mostró que los pacientes hospitalizados demostraron una mayor capacidad neutralizante en comparación con aquellos que no requirieron hospitalización. Este procedimiento también se puede utilizar para evaluar otros agentes terapéuticos y de prevención de COVID-19 que tienen como objetivo bloquear la infección viral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detección de anticuerpos de dominio de unión al receptor SARS-CoV-2 mediante un bioinformador basado en HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Estrategia eficiente de diagnóstico de saliva por PCR con transcriptasa inversa cuantitativa del SARS-CoV-2 utilizando robots pipeteadores de código abierto

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...