Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Vi vill tacka Whelan-labbet för att generöst ha tillhandahållit VSV-S-eGFP-viruset som används i detta protokoll (beskrivs i fall et al. 2020). Vi tackar också Drs. Bill Cameron och Juthaporn Cowan (och team) för att samla in patientens blodprover (REB-protokoll-ID 20200371-01H). Författarna avslöjar mottagandet av följande ekonomiska stöd för forskning, författarskap och / eller publicering av denna artikel: Detta arbete finansierades av det generösa stödet från Ottawa Hospital Foundation och ett bidrag från Canadian Institutes of Health Research (#448323) och ett fast grant från Thistledown foundation för COVID-19 Science till C.S.I. T.R.J. finansieras av ett Ontario Graduate Scholarship och cluster Mitacs fellowship. JP finansieras av ett kluster Mitacs-stipendium. T.A. finansieras av cihr banting fellowship. Vi vill också tacka alla individer som deltog och donerade sina blodprover för denna studie.

1. Pläteringsceller (dag 1) för produktion och kvantifiering av pseudoviruset SARS-CoV-2
<ol><li>Förberedelse för vävnadskultur<ol>
<li>Varm 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS); Dulbeccos modifierade eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (valfritt); och 0,25% trypsinetylendiamintetraättiksyra (EDTA) till 37 °C i ett vattenbad i ca 15 minuter.</li>
		<li>Desinficera en mjukpappersodlingshuv med 70% etanol och placera vävnadskulturrätter...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

Metoden som beskrivs här kan anpassas för att passa olika labbmiljöer och resurser efter behov. Viktigt är att den huvudsakliga begränsningen av detta protokoll är nödvändigheten av en inneslutning nivå 2 utrymme och vävnad kultur huva. Tillämpningen av ett replikerande RNA-virus pseudotypat med SARS-CoV-2-spiken, såsom VSV-S-eGFP, är ett formidabelt alternativ till SARS-CoV-2-viruset, som kräver ett arbetsområde på inneslutningsnivå 3, men kan förbli en begränsning för vissa grupper. Alla andra steg ...

I december 2019 identifierades ett nytt coronavirus, som vi nu känner som SARS-CoV-2, orsaksmedlet för coronavirussjukdom 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 är ett betacoronavirus som tillhör familjen Coronaviridae. Dessa höljede virus består av ett stort positivt RNA-genom och är ansvariga för luftvägs- och tarminfektioner hos både människor och djur2. I maj 2021 rapporterades mer än 157 miljoner fall av covid-19 globalt och mer än 3,2 miljoner dödsfall3. Utvecklingen av ett effektivt vaccin har blivit det primära målet för forskare runt om i världen med minst 77 prekliniska vacciner under utredning och 90 som för närvarande genomgår kliniska prövningar4.
Coronavirus kodar fyra strukturella proteiner inklusive spikproteinet (S), nukleokapslar (N), kuvertprotein (E) och membranproteinet (M). För att komma in i SARS-CoV-2 krävs interaktion mellan den receptorbindande domänen (RBD) av S med värdreceptorn, humant angiotensinkonverterande enzym 2 (hACE2) och efterföljande membranfusion efter proteolytisk klyvning av värdcellsserinproteas, transmembran proteas serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humoral immunodominance av S-proteinet av SARS-CoV har tidigare rapporterats och har nu visats även för SARS-CoV-211,12,13. Neutraliserande antikroppssvar mot S har faktiskt påvisats i konvalescent serum från SARS-CoV patienter 24 månader efter infektion14, vilket belyser deras kritiska roll i det långsiktiga immunsvaret. S-proteinet har identifierats som ett lovande vaccinmål och har därmed blivit en nyckelkomponent i de flesta vacciner under utveckling15,16.
Även om den snabba upptäckten av neutraliserande antikroppar är en kritisk aspekt av vaccinutvecklingen, kan det också kasta ljus över infektionshastigheten och seroepidemiologisk övervakning i drabbade områden17. En replikerings kompetent VSV pseudotypad med SARS-CoV-2 S glykoprotein, i stället för wild-typ VSV glykoprotein, för att studera SARS-CoV-2 infektion i biosäkerhet nivå 2 inställningar donerades vänligt av Whelan och medarbetare18. VSV-uttrycksspik (VSV-S) kommer att användas för att bestämma det neutraliserande antikroppssvaret mot SARS-CoV-2 spike protein. Eftersom VSV-S som används här också uttrycker förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP), kan eGFP-högborgar detekteras inom 24 timmar för att kvantifiera infektion, medan plackbildning kan ta 48 till 72 timmar. Sammanfattas här är ett enkelt och effektivt protokoll för att bestämma förmågan hos konvalescent patienten serum att neutralisera VSV-S-eGFP infektion. Denna metod kan också enkelt anpassas för att förhöra andra potentiella terapier som syftar till att störa värd-viral interaktion av SARS-CoV-2 S protein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

När COVID-19-pandemin orsakad av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsätter att utvecklas, har det blivit uppenbart att förekomsten av neutraliserande antikroppar mot viruset kan ge skydd mot framtida infektion. Således, när skapandet och översättningen av effektiva COVID-19-vacciner fortsätter i en aldrig tidigare skådad hastighet, kommer utvecklingen av snabba och effektiva metoder för att mäta neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 att bli allt viktigare för att fastställa långsiktigt skydd mot infektion för både tidigare smittade och immuniserade individer. Detta dokument beskriver en hög-genomströmning protokoll med vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped med SARS-CoV-2 spik protein för att mäta förekomsten av neutraliserande antikroppar i konvalescent serum från patienter som nyligen har återhämtat sig från COVID-19. Användningen av ett replikerande pseudotypat virus eliminerar behovet av en inneslutning nivå 3 anläggning som krävs för SARS-CoV-2 hantering, vilket gör detta protokoll tillgängligt för praktiskt taget alla inneslutning nivå 2 lab. Användningen av ett 96-brunnsformat gör att många prover kan köras samtidigt med en kort leveranstid på 24 timmar.

Detta protokoll beskriver en snabb och effektiv metod för att upptäcka neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 S protein via hämning av VSV-S-eGFP pseudovirusinfektion (kvantifierbar genom förlust av eGFP-högborgar upptäckt). En schematisk representation av protokollet visas i figur 1. Det rekommenderas att en kommersiellt tillgänglig antikropp används som en positiv kontroll varje gång analysen körs för att säkerställa analysens konsistens. Här demonstrerar vi en utspädnin...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Protokollet beskrivs här skisserar en snabb och effektiv metod för att mäta neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 spik protein genom att utvärdera förmågan hos konvalescent serum prover att hämma infektion av en förbättrad grön fluorescerande protein-märkt vesicular stomatitis virus pseudotyped med spik glykoprotein.

Påvisande av SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar med hjälp av fluorescerande avbildning med hög genomströmning av pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Denna metod ger ett sätt att besvara en av de viktigare frågorna om sars-coronavirus-2-vacciner under utveckling. Kan vaccinet framkalla ett neutraliserande antikroppssvar? Den största fördelen med denna teknik är att det kan göras i en inneslutningsnivå två anläggning.Det är också relativt snabbt och billigt, vilket gör det väl lämpat för att analysera många prover på en gång. Vi demonstrerar neutraliserande syraproceduren och har Ricardo Marius, en senior tekniker i labbet och Taylor Jamieson, en MD doktorand. Börja med att odla Vero E6-celler i DMEM kompletterade med 10% FBS vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.För att passage cellerna, tvätta dem först genom att lägga till 10 milliliter PBS och försiktigt gunga skålen fyra till fem gånger. Efter att ha aspirerat PBS, tillsätt tre milliliter trypsin EDTA och rocka skålen för att säkerställa att hela ytan är täckt innan du inkuberar den vid 37 grader Celsius. När cellerna har lossnat, inaktivera trypsin genom att lägga till sju milliliter DMEM kompletterat med 10%FBS, sedan återanvända cellerna genom pipettering upp och ner flera gånger.Ta bort trypsin genom centrifugering och aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten innan cellerna återanvänds i 10 milliliter färsk DMEM. Efter räkning, tillsätt ungefär en gång 10 till de sjunde cellerna till varje 15 centimeter tallrik och inkubera kulturen i en till två dagar tills cellerna är 100% sammanflöde. För att förbereda VSV-spiken EGFP pseudovirus för titering, infektera cellerna vid 0,01 multiplicity av infektion med lagerviruset utspädd i 12 milliliter serumfri DMEM.Efter tillsats av viruset, inkubera cellerna i en timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid med tillfällig gungning. I slutet av inkubationen, ersätt inokulat med färsk DMEM kompletterat med 2% FBS och 20 millimolarhögar, inkubera sedan cellerna vid 34 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar. Nästa dag, använd ett fluorescerande mikroskop för att visualisera EGFP-uttrycket för de infekterade cellerna.När en omfattande cytopatisk effekt och cellavlossning observeras, samla upp odlingssenanten och ta bort skräpet genom centrifugering. För att undvika flera frys-tina cykler, aliquot supernatanten före lagring vid minus 80 grader Celsius. För att bestämma den virala titer, plätera Vero E6-celler i sex brunnsplattor med en såddtäthet på sex gånger 10 till de femte cellerna per brunn och inkubera över natten.Nästa dag, inrätta en tiofaldig seriell utspädningsserie av viruslagret genom att tillsätta 900 mikroliter av medelstora till sju mikrocentrifugerrör och lägga till 100 mikroliter viruslager till det första röret. Efter kort virvel, överför 100 mikroliter av utspädd virus till varje efterföljande rör och virvla mellan varje rör. Byt sedan ut supernatanten i varje brunn på Vero E6-odlingsplattan med 500 mikroliter av 10 till minus sekund till 10 till minus sjunde virusutspädningar.Efter en 45 minuters inkubation i cellodlingsinkubatorn med försiktigt gungning var 15: e minut, byt ut inokulatet med en överlagringslösning och inkubera cellerna vid 34 grader Celsius med 5% koldioxid i 48 timmar. I slutet av inkubationen, för att visualisera plack genom kristallviolett färgning, tvätta cellerna en gång med PBS innan du lägger till två milliliter av 0,1% kristallviolett till varje brunn. Placera plattan på en vipp i cirka 20 minuter i rumstemperatur innan du försiktigt tvättar varje brunn två gånger med PBS.Efter den sista tvätten, låt plattorna lufttorka i minst en timme innan du använder formeln enligt vad som anges för att beräkna virusets titer i varje brunn i plackbildande enheter per milliliter. För att plätera celler för en neutraliseringsanalys, använd en flerkanalig pipett för att lägga till 100 mikroliter Vero E6-celler till varje brunn på en 96-brunnsplatta med en densitet av två gånger 10 till de femte cellerna per milliliter och inkubera plattan i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Följande dag inaktiverar värmen de patientserumprover som ska testas i ett 56 grader Celsius vattenbad i 30 minuter.Sätt sedan upp en tiofaldig utspädningsserie av patientens serumprover i en tom 96 väl vävnadsodlingsplatta genom att tillsätta åtta mikroliter serum till 72 mikroliter serumfritt DMEM med antibiotika i varje brunn på rad A.Lägg sedan till 40 mikroliter serumfritt DMEM till varje brunn av rader B till G och 80 mikroliter till varje brunn på rad H.Med hjälp av en 12 väl multikanalpipeett, blanda proverna i rad A, överför sedan 40 mikroliter av provet från varje brunn på rad A till varje brunn på rad B.Efter blandning, upprepa utspädningen för varje efterföljande rad brunnar till rad F.Next, tillsätt 40 mikroliter VSV spike EGFP vid 0,05 multiplicitet av infektion till varje brunn i rad A till G, och blanda genom pipettering fyra till fem gånger innan du inkuberar plattan i en timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. I slutet av inkubationen aspirera du försiktigt supernatanten från varje brunn på Vero E6-odlingsplattan och överför 60 mikroliter antikroppsvirusblandning från varje brunn i provutspädningsplattan till motsvarande brunn på cellodlingsplattan. När alla prover har överförts, placera cellodlingsplattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i en timme med gungning var 20: e minut.När inkubationen är klar, tillsätt 140 mikroliter av karboxymetylcellulosa överläggslösning till varje brunn på cellodlingsplattan och överför plattan till en 34 grader Celsius och 5% koldioxidinkubator. Efter 24 timmar avbildar du plattorna på en automatiserad fluorescerande bildspelare vid 488 nanometers våglängd och använder bildbildens automatiska räkningsfunktion för att kvantifiera de enskilda EGFP-högborgarna. I detta representativa exempel användes en kommersiellt tillgänglig neutraliserande antikropp mot SARS-coronavirus-2 spike receptor bindande domän som en positiv kontroll, tillsammans med IgG som en negativ kontroll.Procenthämningen beräknades baserat på antalet EGFP-högborgar som detekterades via fluorescerande avbildning. Pseudovirus neutralisering av konvalescent patient prover samlades in cirka tre månader efter SARS-coronavirus-2 infektion visade att sjukhuspatienter visade en ökad neutraliserande kapacitet jämfört med dem som inte behövde sjukhusvistelse. Denna procedur kan också användas för att utvärdera andra COVID-19 förebyggande och terapeutiska medel som syftar till att blockera virusinfektion.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En snabb, Multiplex Dual Reporter IgG och IgM SARS-CoV-2 neutraliseringsanalys för ett multiplexerat pärlbaserat flödesanalyssystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 Kvantitativ omvänd transkriptas PCR Saliva Diagnostisk strategi med hjälp av öppen källkod pipettering robotar

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypade virus som ett molekylärt verktyg för att övervaka humana immunsvar mot SARS-CoV-2 via neutralisationsanalys

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...