Name: detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection
Uploaded: 2021-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Whelan laboratuvarına, bu protokolde kullanılan VSV-S-eGFP virüsünü cömertçe sağladığı için teşekkür ederiz (Case ve ark. 2020'de açıklanmıştır). Ayrıca Dr. Bill Cameron ve Juthaporn Cowan'a (ve ekibine) hasta kan örneklerini (REB protokol kimliği 20200371-01H) topladıkları için teşekkür ederiz. Yazarlar, bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayımlanması için aşağıdaki finansal desteğin alındığını açıklamalıdır: Bu çalışma, Ottawa Hastanesi Vakfı'nın cömert desteği ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (#448323) bir hibe ve COVID-19 Bilimi için Thistledown Vakfı'ndan C.S.I. T.R.J.'e hızlı bir hibe ile finanse edilmektedir. JP bir küme Mitacs bursu tarafından finanse edilir. T.A. bir CIHR Banting Bursu tarafından finanse edilir. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz.

1. SARS-CoV-2 psödovirüs üretimi ve niceliği için kaplama hücreleri (Gün 1)
<ol><li>Doku kültürüne hazırlık<ol>
<li>Sıcak 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS); Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Modifiye Kartal Orta (DMEM) (isteğe bağlı); ve yaklaşık 15 dakika boyunca bir su banyosunda% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ila 37 °C.</li>
		<li>Bir doku kültürü davlumbazını% 70 etanol ile dezenfekte edin ve doku kültürü yemekler...

<ol>
	<li>Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+SARS-CoV-2+and+COVID-19.">Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).</li><li>Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses.">Coronaviruses.</a> Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).</li><li>COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://coronavirus.jhu.edu/map.html">https://coronavirus.jhu.edu/map.html</a> (2021)</li><li>Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html">https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html</a> (2021)</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Letko, M., Marzi, A., Munster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cell+entry+and+receptor+usage+for+SARS-CoV-2+and+other+lineage+B+betacoronaviruses.">Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses.</a> Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoluciferase+complementation-based+bioreporter+reveals+the+importance+of+N-linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry.">Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Molecular Therapy. , (2021).</li><li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction.">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+NanoBiT:+a+Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition.">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design:+Fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization.">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215 (2020).</li><li>Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+persistent+antibody+responses+against+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+in+recovered+patients.">Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients.</a> Virology Journal. 7, 299 (2010).</li><li>To, K. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+profiles+of+viral+load+in+posterior+oropharyngeal+saliva+samples+and+serum+antibody+responses+during+infection+by+SARS-CoV-2:+an+observational+cohort+study.">Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).</li><li>Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+inactivated+vaccine+candidate+for+SARS-CoV-2.">Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6499), 77-81 (2020).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+prospective+study+of+the+humoral+immune+response+of+patients+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome.</a> Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates.">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).</li><li>Amanat, F., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccines:+Status+report.">SARS-CoV-2 vaccines: Status report.</a> Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).</li><li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans.">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li><li>Case, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+and+soluble+ACE2+inhibition+of+a+replication-competent+VSV-SARS-CoV-2+and+a+clinical+isolate+of+SARS-CoV-2.">Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2.</a> Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).</li><li>Garcia-Beltran, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journal+Pre-proof+COVID-19+neutralizing+antibodies+predict+disease+severity+and+survival.">Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival.</a> Cell. 184 (2), 476-488 (2020).</li><li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+against+SARS-CoV-2+spike+in+COVID-19+patients,+health+care+workers,+and+convalescent+plasma+donors.">Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors.</a> JCI insight. 5 (22), (2020).</li><li>Whitman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+SARS-CoV-2+serology+assays+reveals+a+range+of+test+performance.">Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance.</a> Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).</li><li>Ainsworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+five+immunoassays+for+SARS-CoV-2:+a+head-to-head+benchmark+comparison.">Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison.</a> The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).</li><li>Sharifkashani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+(ACE2)+receptor+and+SARS-CoV-2:+Potential+therapeutic+targeting.">Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting.</a> European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).</li><li>Burki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+variants+of+SARS-CoV-2.">Understanding variants of SARS-CoV-2.</a> The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+pandemic:+a+review+of+molecular+diagnostic+tools+including+sample+collection+and+commercial+response+with+associated+advantages+and+limitations.">SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays.">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li></ol>

Burada açıklanan yöntem, gerektiğinde farklı laboratuvar ortamlarına ve kaynaklarına uyacak şekilde uyarlanabilir. Daha da önemlisi, bu protokolün ana sınırlaması, bir muhafaza düzeyi 2 alan ve doku kültürü başlığı için gerekliliktir. VSV-S-eGFP gibi SARS-CoV-2 ani yükselişi ile sözde çoğaltıcı bir RNA virüsünün uygulanması, kontrol altına alma seviyesi 3 çalışma alanı gerektiren SARS-CoV-2 virüsüne zorlu bir alternatiftir, ancak bazı gruplar için bir sınırlama olarak kalabilir...

Aralık 2019'da, şimdi sars-CoV-2 olarak bildiğimiz, koronavirüs hastalığının etken maddesi 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2, Coronaviridae ailesine ait bir betakoronavirüstür. Bu zarflı virüsler büyük bir pozitif duyu RNA genomunu içerir ve hem insanlarda hem de hayvanlarda solunum ve bağırsak enfeksiyonlarından sorumludur2. Mayıs 2021 itibarıyla küresel olarak bildirilen 157 milyondan fazla COVID-19 vakası ve 3,2 milyondan fazla ölüm3. Etkili bir aşının geliştirilmesi, incelenmekte olan en az 77 klinik öncesi aşı ve şu anda klinik deneylerden geçen 90 ile dünya çapında araştırmacıların birincil hedefi haline gelmiştir4.
Koronavirüsler spike proteini (S), nükleocapsid (N), zarf proteini (E) ve membran proteini (M) dahil olmak üzere dört yapısal proteini kodlar. SARS-CoV-2'nin girişi, S'nin reseptör bağlayıcı etki alanının (RBD) konak reseptör ile etkileşimini gerektirir, insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (hACE2) ve konak hücresel serine proteaz, transmembran proteaz serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 tarafından proteolitik bölünmeyi takiben sonraki membran füzyonu . SARS-CoV'un S proteininin humoral immün hakimiyeti daha önce bildirilmiştir ve şimdi SARS-CoV-211 , 12,13için de gösterilmiştir. Gerçekten de, SARS-CoV hastalarından iyileşen serumda S'ye karşı nötralize edici antikor yanıtları tespit edilmiştir Enfeksiyon 14 ' ten24ay sonra , uzun süreli immün yanıttaki kritik rollerini vurgulamaktadır. S proteini umut verici bir aşı hedefi olarak tanımlanmıştır ve bu nedenle geliştirilmekte olan çoğu aşının önemli bir bileşeni haline gelmiştir15,16.
Nötralize edici antikorların hızlı tespiti aşı geliştirmenin kritik bir yönü olmakla birlikte, etkilenen bölgelerde enfeksiyon ve sero-epidemiyolojik gözetim oranına da ışık tutabilir17. Biyogüvenlik seviye 2 ayarlarında SARS-CoV-2 enfeksiyonunu incelemek için vahşi tip VSV glikoproteinin yerine SARS-CoV-2 S glikoprotein ile sözde replikasyon yetkin bir VSV, Whelan ve iş arkadaşları tarafından nazikça bağışlandı18. SARS-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikor yanıtını belirlemek için VSV ekspresying spike (VSV-S) kullanılacaktır. Burada kullanılan VSV-S aynı zamanda gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) ifade ettiği için, enfeksiyonu ölçmek için 24 saat içinde eGFP odakları tespit edilebilirken, plak oluşumu 48 ila 72 saat sürebilir. Burada özetlenen, iyileşen hasta serumunun VSV-S-eGFP enfeksiyonunu nötralize etme yeteneğini belirlemek için basit ve etkili bir protokoldür. Bu yöntem, SARS-CoV-2 S proteininin konak-viral etkileşimini bozmayı amaçlayan diğer potansiyel terapötikleri sorgulamak için de kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>LS25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayScan VTI HCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescent imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Gibco)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (Powder) (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP-310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Isotype Control (mouse)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#160;CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of sars-cov-2 neutralizing antibodies using high-throughput fluorescent imaging of pseudovirus infection

Şiddetli akut solunum yolu sendromu Coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu COVID-19 pandemisi gelişmeye devam ederken, virüse karşı nötralize edici antikorların varlığının gelecekteki enfeksiyona karşı koruma sağlayabileceği ortaya çıktı. Bu nedenle, etkili COVID-19 aşılarının oluşturulması ve çevirisi benzeri görülmemiş bir hızda devam ettikçe, SARS-CoV-2'ye karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi, hem daha önce enfekte olmuş hem de aşılanmış bireyler için enfeksiyona karşı uzun vadeli korumayı belirlemek için giderek daha önemli hale gelecektir. Bu makalede, COVID-19'dan yeni kurtulan hastalardan iyileşen serumda nötralize edici antikorların varlığını ölçmek için SARS-CoV-2 spike proteini ile sözde olarak yazılmış veziküler stomatit virüsü (VSV) kullanan yüksek verimli bir protokol açıklanmaktadır. Çoğaltıcı bir sözde virüs kullanımı, SARS-CoV-2 kullanımı için gerekli olan bir muhafaza seviyesi 3 tesisi için gerekliliği ortadan kaldırır ve bu protokolü hemen hemen her kapsama seviyesi 2 laboratuvarı için erişilebilir hale getirir. 96 kuyulu bir formatın kullanılması, birçok örneğin aynı anda 24 saat kısa bir geri dönüş süresiyle çalıştırılmasını sağlar.

Bu protokol, VSV-S-eGFP psödovirüs enfeksiyonunun inhibisyonu yoluyla SARS-CoV-2 S proteinine karşı nötralize edici antikorları tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir (tespit edilen eGFP odaklarının kaybı ile ölçülebilir). Şekil 1'de protokolün şematik bir gösterimi resmedilmiştir. Testin tutarlılığını sağlamak için test her çalıştırılmasında pozitif kontrol olarak piyasada bulunan bir antikorun kullanılması önerilir. Burada, bir Ig...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection at JoVE.com

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

Bu yöntem, geliştirilmekte olan SARS-coronavirus-2 aşıları ile ilgili daha önemli sorulardan birini yanıtlamanın bir yolunu sağlar. Aşı nötralize edici bir antikor tepkisi ortaya çıkarabiliyor mu? Bu tekniğin temel avantajı, ikinci seviye bir muhafaza tesisinde yapılabilmesidir.Ayrıca nispeten hızlı ve ucuzdur, bu da aynı anda birçok numuneyi analiz etmek için uygun hale getirir. Nötralize edici asit prosedürünü gösteren, laboratuvarda kıdemli bir teknisyen olan Ricardo Marius ve doktora öğrencisi Taylor Jamieson var. DMEM'deki Vero E6 hücrelerini 37 santigrat derecede %10 FBS ve %5 karbondioksit ile destekleyerek başlayın.Hücreleri geçirmek için, önce 10 mililitre PBS ekleyerek ve kabı dört ila beş kez hafifçe sallayarak yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce tüm yüzeyin kaplı olduğundan emin olmak için yemeği sallayın. Hücreler ayrıldıktan sonra, %10 FBS ile desteklenmiş yedi mililitre DMEM ekleyerek trypsin'i devre dışı bırakın, ardından birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri yeniden dürt.Tripini santrifüjleme ile çıkarın ve hücreleri 10 mililitre taze DMEM'de canlandırmadan önce hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin. Saydıktan sonra, her 15 santimetrelik plakaya yaklaşık bir kez 10 yedinci hücre ekleyin ve hücreler% 100 bir birikmeye kadar kültürü bir ila iki gün kuluçkaya yatırın. VSV spike EGFP psödovirüsü titerleme için hazırlamak için, serumsuz DMEM'in 12 mililitresinde seyreltilmiş stok virüsü ile enfeksiyonun 0.01 çokluğunda hücreleri enfekte edin.Virüsü ekledikten sonra, hücreleri 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın ve ara sıra sallanan% 5 karbondioksit. Kuluçkanın sonunda, inokülüsünü% 2 FBS ve 20 milimolar yığınlarla desteklenmiş taze DMEM ile değiştirin, ardından hücreleri 34 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, enfekte hücrelerin EGFP ifadesini görselleştirmek için floresan bir mikroskop kullanın.Kapsamlı bir sitopatik etki ve hücre müfrezesi gözlendikten sonra, kültür üstnatantını toplayın ve santrifüjleme ile enkazı kaldırın. Birden fazla donma-çözülme döngüsünü önlemek için, eksi 80 santigrat derecede depolamadan önce süpernatant aliquot. Viral titreyi belirlemek için, Vero E6 hücrelerini altı kuyu plakasında, kuyu başına altı çarpı 10 ila beşinci hücrelere kadar tohumlama yoğunluğunda plakalayın ve bir gecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, 900 mikrolitre orta ila yedi mikro santrifüj tüpü ekleyerek ve ilk tüpe 100 mikrolitre viral stok ekleyerek viral stokun on kat seri seyreltme serisini kurun. Kısa bir girdaplamadan sonra, her tüp arasında girdaplama yaparak, sonraki her tüpe 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs aktarın. Daha sonra Vero E6 kültür plakasının her kuyusundaki süpernatantı 10 ila eksi saniyenin 500 mikrolitresi ile eksi yedinci viral seyreltmelere değiştirin.Hücre kültürü inkübatörde her 15 dakikada bir hafifçe sallanan 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, inokülüsleri bir kaplama çözeltisi ile değiştirin ve hücreleri 34 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 48 saat boyunca kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, plakları kristal mor boyama ile görselleştirmek için, her kuyuya iki mililitre% 0.1 kristal mor eklemeden önce hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Pbs ile her kuyuyu iki kez hafifçe yıkamadan önce tabağı oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bir rocker üzerine yerleştirin.Son yıkamadan sonra, mililitre başına plak şekillendirme ünitelerinde her kuyuda virüsün titresini hesaplamak için belirtilen formülü kullanmadan önce plakaların en az bir saat kurumasına izin verin. Nötralizasyon tahlilleri için hücreleri plakalamak için, mililitre başına beşinci hücrelere iki kez 10 yoğunlukta 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre Vero E6 hücresi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün ısı, 56 santigrat derecelik su banyosunda test edilecek hasta serum örneklerini 30 dakika boyunca devre dışı bıraktı.Daha sonra her kuyuda antibiyotik içeren 72 mikrolitre serumsuz DMEM'e serumun sekiz mikrolitresini ekleyerek hastanın serum örneklerinin on katını boş bir 96 kuyu doku kültürü plakasına kurun A.Sıra A.'nın ardından B'den G'ye kadar her bir satır kuyusuna 40 mikrolitre serumsuz DMEM ve H sırasının her kuyusuna 80 mikrolitre ekleyin.12 kuyu çok kanallı pipet kullanarak, örnekleri A satırında karıştırın, sonra A satırının her kuyusundan B satırının her kuyusuna numunenin 40 mikrolitresini aktarın.Karıştırdıktan sonra, sonraki her kuyu satırı için seyreltmeyi F.Next satırına kadar tekrarlayın, A'dan G'ye kadar her kuyuya 0.05 çok miktarda enfeksiyonda 40 mikrolitre VSV spike EGFP ekleyin, ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırmadan önce dört ila beş kez pipetleme ile karıştırın. Kuluçkanın sonunda, vero E6 kültür plakasının her kuyusundan süpernatantı dikkatlice emiş edin ve örnek seyreltme plakasının her kuyusundan hücre kültür plakasının ilgili kuyusuna 60 mikrolitre antikor virüsü karışımı aktarın. Tüm örnekler aktarıldığında, hücre kültürü plakasını 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite her 20 dakikada bir sallayarak bir saat yerleştirin.Kuluçka tamamlandıktan sonra, hücre kültürü plakasının her kuyusuna 140 mikrolitre karboksimetilselüloz kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı 34 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın. 24 saat sonra, plakaları 488 nanometre dalga boyunda otomatik bir floresan görüntüleyici üzerinde görüntüleyin ve tek tek EGFP odaklarını ölçmek için görüntüleyicinin otomatik sayma özelliğini kullanın. Bu temsili örnekte, SARS-coronavirus-2 spike reseptör bağlama etki alanına karşı piyasada bulunan nötralize edici bir antikor, igG'nin yanı sıra negatif kontrol olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılmıştır.Yüzde inhibisyon, floresan görüntüleme ile tespit edilen EGFP odaklarının sayısına göre hesaplandı. SARS-koronavirüs-2 enfeksiyonu sonrası yaklaşık üç ay sonra toplanan iyileşen hasta örnekleri ile psödovirüs nötralizasyonu, hastanede yatan hastaların hastaneye yatmayı gerektirmeyenlere kıyasla nötralizasyon kapasitesinin arttığını göstermiştir. Bu prosedür, viral enfeksiyonu engellemeyi amaçlayan diğer COVID-19 önleme ve terapötik ajanları değerlendirmek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...