Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

تم تمويل هذا التقرير من قبل شركة لومينيكس (أوستن، تكساس). يشكر المؤلفون ماثيو سيلفرمان دكتوراه (حلول النشر الطبي الحيوي، ديلراي بيتش، فلوريدا) للمساعدة في التحرير العلمي.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

ستيفن أنجيلوني وشيري دنبار هما موظفان في شركة لومينيكس التي تنتج بعض الكواشف والأدوات التي استخدمت في هذه الدراسة. تم رعاية نشر الوصول المفتوح لهذه المقالة من قبل شركة Luminex

وسعت هذه الدراسة وظائف متعددة الفلورسنت المجهرية المقايسة ، 3Flex ، أن يقيم نوعيا استجابة IgG للعدوى من قبل سارس - CoV -2 1. في حين أن العديد من المقايسات المصلية ل COVID-19 الكشف عن مستضد واحد، وهذا المقايسة في وقت واحد يقيم S، RBD، وN NC المستضدات، ويتضمن عنصر تحكم الأجسام المضادة الداخلية isotype7. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم ACE2 كمؤشر للكشف عن تحييد الثدي الأجسام المضادة للسارس-CoV-2.
وقد تكون المقايسات المتعددة المستضدات مفيدة بشكل خاص في المستقبل في التمييز بين الاستجابات المناعية بين الأشخاص المصابين والملقحين. مع السارس-CoV-2، إذا تم تقييم الأجسام المضادة S و RBD فقط، سيكون من المستحيل تمييز ما إذا كان هذا يرجع إلى عدوى سابقة أو إلى استجابة الأجسام المضادة للتطعيم. لا يستهدف أي من اللقاحات المستخدمة حاليا مستضد Nc، لذا من خلال تقييم مستضدات S/RBD وNc، من الممكن التمييز بين العدوى الفيروسية السابقة (Nc- و S/RBD-positive) والاستجابة للتطعيم (S/RBD-positive فقط؛ Nc-السلبية).
وفي الدراسة الحالية، نقلت المقايسات المصلية والمحايدة 3Flex (القسمان 5 و6) إلى أداة تحليل تدفق المراسل المزدوج الجديدة (القسمان 7 و8). تشبه بروتوكولات المناعة النموذجية لمقايسات تعدد النماذج المستندة إلى الخرز بروتوكولات ELISA القياسية ، بعد خطوات مماثلة لاحتضان العينات ، واحتضان الأجسام المضادة / المراسلات ، وتحليل النتائج8. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا كيف يمكن نقل المقايسات ELISA القياسية إلى منصة multixing القائمة على حبة9.
ويمكن نقل بروتوكولات الفحص بسلاسة من أداة المراسلة الواحدة السابقة إلى نظام المراسلين المزدوجين الجديد، كما تبين النتائج التي تم الحصول عليها لعينات الاختبار والضوابط(الشكل 4 والشكل 5). وفي المقايسة المصلية، أظهرت جميع عينات المصل الإيجابية انخفاضا مميزا يستجيب للجرعة في الإشارة المقابلة لتخفيف عينة أعلى وتركيز أقل للأجسام المضادة للكشف، في حين ظلت إشارات العينات السلبية عند مستويات الخلفية. وبالمثل، بالنسبة لمقايسة التحييد، فإن انخفاض الإشارات ل S و RBD، ولكن ليس Nc، يتوافق مع تركيزات متزايدة لمنافس ACE2، في حين أن مصل IgG المجرد كان أقل تأثرا بإضافة ACE2. قبل احتضان الخرز مع ACE2 لمدة 2 دقيقة قبل إضافة عينة المصل (كما هو موضح في القسمين 6 و 8) ، تمت مقارنته أيضا بالجمع بين الخرز مع ACE2 والمصل في نفس الوقت ولم ينتج فرقا كبيرا في النتائج (البيانات غير موضحة). ومع ذلك، لأن النتائج التي تم الحصول عليها مع الخرز بالإضافة إلى ACE2 خطوة ما قبل الحضانة كانت أكثر اتساقا، كان الإجراء النهائي المعتمد لبروتوكول فحص تحييد (القسمين 6 و 8).
ولأن نظام المراسل المزدوج يتضمن قناة مراسل فلورية ثانية، فقد تم تحويل كلا المقايسات إلى مقايسات متساوية الطباعة لقياس استجابات IgG وIgM في نفس الوقت. تسمح وظيفة المراسل المزدوج لم حلل التدفق بجمع إشارات فلورية من كاشفين للكشف عن المراسل لكل تحليل في المضاعف لكل عينة ، مما يضاعف بشكل فعال البيانات التي يتم إنشاؤها لكل عينة في المقايسة. من أجل تطوير وتحسين بروتوكولات الفحص المزدوج للمراسل ، تم تقييم العديد من الأصباغ المراسلة المتاحة تجاريا والأجسام المضادة للكشف عن قناة RP2 الجديدة(الشكل 7 والشكل 8)لتحديد أفضل الخيارات (الخيارات) المتاحة. المضادة IgM الأجسام المضادة المقترنة DL 405 مراسل صبغ لم يكن أداء جيدا في قناة RP2 (الشكل 7)، لذلك biotin المضادة لIgG مع SASB تم تقييمها في وقت لاحق للكشف في قناة RP2 (الشكل 8). تمت مقارنة ثلاث مجموعات من كاشفات الكشف RP1 وRP2 في المقايسة المزدوجة تحييد المراسل(الجدول 1 والشكل 9)لتحديد أفضل المجموعات أداء للكشف المتزامن عن الأجسام المضادة تحييد IgG وIgM. في حين كانت هناك اختلافات كبيرة في كثافة الإشارة بين قناة RP1 باستخدام PE-anti IgM وقناة RP2 باستخدام DL 549 anti-IgM ، لم يكن هناك فرق كبير في قياس تثبيط الربط في المئة من قبل ACE2.
يتم الاعتراف بعدة قيود على الطريقة الحالية وهذه الدراسة. أولا، اقتصرت العينات التي تم اختبارها واستخدامها في تطوير الأسلوب والتحسين على مجموعات من 8-11 عينة. وسيتم اختبار المزيد من العينات في دراسات موسعة للتحقق من أن الطريقة هي الأمثل تماما. ثانيا، تم اختبار عدد محدود من الفلوروفور المراسل وأزواج المراسلين. وسيحدد إجراء مزيد من الاختبارات لجميع المراسلين المتاحين في جميع المجموعات الممكنة الكواشف التي يمكن استخدامها بنجاح في هذه الطريقة. كان الجسم المضاد ل IgG المترافق مع البيوتين مختلفا عن الجسم المضاد ل IgG المترافق مع مراسل BV 421. لذلك ، على الرغم من وجود تباين في كثافة الإشارة ل BV 421 المضادة لIgG ، يمكن أن يكون ذلك بسبب خصوصية الجسم المضاد ولا علاقة له بصبغة المراسل. اختبار الأجسام المضادة الأخرى المتاحة BV 421-اقتران قد تحديد الأجسام المضادة الأخرى التي من شأنها أن تؤدي بشكل جيد في قناة RP2. كما ستقيم الدراسات المستقبلية الجمع بين PE anti-IgM و BV 421 Anti-Human IgG للكشف عنه في RP1 وRP2 على التوالي. وأخيرا، حتى مع القدرة المزدوجة للمراسلة على الآلة، تقتصر المقايسات على نوعين متساويي الأنماط (معلمتان) لكل رد فعل. إذا كان من المقرر قياس أنواع متساوية إضافية أو الرغبة في isotyping الكامل ، فإن ردود الفعل الإضافية باستخدام نفس قناتي المراسل ستحتاج إلى تشغيلها في آبار منفصلة.
تسمح تقنية تعدد المضاعفات المستندة إلى الخرز بتصميم سريع ومرن للاختبارات مع التنفيذ السهل لسير العمل المختبري الروتيني3و4و10. أظهرت هذه الدراسة سهولة نقل المقايسات المصلية والمحايدة 3Flex الموصوفة سابقا ل SARS-CoV-2 إلى نظام تحليل التدفق لقياس IgG بمراسل واحد ، أو مع تعديل طفيف ، وقياس استجابات IgG وIgM في وقت واحد باستخدام اثنين من المراسلين. يتمتع خيار المراسل المزدوج بمزايا واضحة على منصات المراسلين الفردية لأنه يمكن أن يوفر ضعف كمية البيانات لكل عينة ، باستخدام نصف حجم العينة ، وفي نصف عدد آبار التفاعل. مع الأصباغ المراسل المناسب والأجسام المضادة الكشف، يمكن بسهولة تطوير المقايسات isotyping وتنفيذها على أداة تحليل تدفق المراسل المزدوج.

وقد أكد وباء COVID-19 على أهمية القدرة على التطور السريع والتنفيذ السريع وعالي الإنتاجية والاختبارات المصلية عالية الأداء التي يمكن استخدامها لتشخيص ومراقبة مسببات الأمراض الجديدة مثل السارس-CoV-2. يمكن أن يكون الاختبار المصلي المتعدد مفيدا للغاية في الجائحة ، حيث يمكنه تحليل الأجسام المضادة في وقت واحد إلى مستضدات متعددة ، مما يوفر تغطية واسعة للعوامل الممرضة وضوابط للتغير في الكائن الحي واستجابة المضيف للعدوى. تم مؤخرا الإبلاغ عن تطوير م المقايسة الفلورية المتعددة القائمة على حبة ، السارس -CoV-2 IgG 3Flex (3Flex) ، التي يمكنها اكتشاف الأجسام المضادة للبروتين (S) ، وانزيم تحويل الأنجيوتنسين - 2 (ACE2) (ACE2) المجال الملزم للمستقبلات (RBD) ، وnucleocapsid (Nc) من SARS-CoV-2مؤخرا 1. 3وبين أن أداء الفليكس مماثل لمرجعية من فحص سارس-CoV-2 IgG للمصل تم الحصول عليه في ≥21 يوما من بداية الأعراض ولكن كانت حساسيته أعلى مع العينات التي تم جمعها في ≤5 أيام من ظهور الأعراض. بالإضافة إلى ذلك، تم إثبات تثبيط ربط الأجسام المضادة لمضادات S و RBD باستخدام ACE2 القابل للذوبان في تنسيق فحص تحييد. وقد اعتمدت على نطاق واسع التكنولوجيا Multix حبة على أساس كتكنولوجيا ثبت لاختبار serological multix ولها مزايا متميزة للفحص على نطاق واسع، بما في ذلك وقت قصير إلى نتائج، ومتطلبات عينة صغيرة، وانخفاضالعمالة 2،3،4.
في الآونة الأخيرة ، أصبح أداة جديدة لتحليل التدفق متاحة توفر نفس القدرة عالية الضفيرة وعالية الإنتاجية للنظام التي أظهرتها في العمل السابق1، ولكن مع فائدة إضافية من قناتين مراسلتين. القدرة على قياس اثنين من إشارات مراسل الفلورسنت في رد فعل واحد يسمح بتقييم نتيجتين لكل تحليل لكل عينة ومثالية لتطبيقات isotyping، والتي عادة ما يجب أن يتم في ردود فعل منفصلةالآبار 5. توفر قدرة المراسل المزدوج ضعف البيانات لكل عينة في نصف عدد آبار التفاعل مع نصف متطلبات حجم العينة ، وبالتالي لديها ميزة واضحة على أنظمة المراسلين الفرديين. تفصل هذه الدراسة بروتوكول الفحص المصلي القياسي وتصف التكيف مع م المقايسة المحايدة. بالإضافة إلى ذلك، يصف هذا التقرير تحويل المقايسة المراسلة الواحدة إلى مقايسة سيرولوجية مزدوجة للمراسل، وبعد ذلك، اختبار تحييد المراسل المزدوج، لقياس تحييد الأجسام المضادة لكل من IgG وIgM isotypes ضد مستضدات السارس-CoV-2 S وRBD وNc في وقت واحد. يتم توفير نظرة عامة مرئية على بروتوكول المقايسة في الشكل 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

وقد أكد وباء COVID-19 على الحاجة إلى طرق سريعة عالية الإنتاجية للكشف المصلي الحساس والمحدد للعدوى بمسببات الأمراض الجديدة، مثل السارس-CoV-2. يمكن أن يكون الاختبار المصلي المتعدد مفيدا بشكل خاص لأنه يمكنه تحليل الأجسام المضادة في وقت واحد إلى مستضدات متعددة تعمل على تحسين تغطية مسببات الأمراض ، وضوابط للتغير في الكائن الحي واستجابة المضيف الفردية. هنا نصف السارس-CoV-2 IgG 3-plex الفلورسنت المقايسة القائمة على المجهرية التي يمكن الكشف عن كل من IgM وIgG الأجسام المضادة لثلاثة مستضدات السارس-CoV-2 الرئيسية-ارتفاع (S) البروتين، ارتفاع أنجيوتنسين تحويل إنزيم-2 (ACE2) مستقبل ملزم المجال (RBD)، وnucleocapsid (Nc). وتبين أن الفحص له أداء مماثل للمساحة المرجعية للسارس-CoV-2 ل IgG في المصل التي تم الحصول عليها في ≥21 يوما من ظهور الأعراض ولكن كانت حساسيتها أعلى مع العينات التي تم جمعها في ≤5 أيام من ظهور الأعراض. علاوة على ذلك ، باستخدام ACE2 القابل للذوبان في شكل مقايسة تحييد ، تم إثبات تثبيط ربط الأجسام المضادة ل S و RBD.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

تم استخدام نظام تحليل التدفق للمقايسات متعددة الفأس القائمة على الخرز والتي توفر قراءات من اثنين من المراسلين لتطوير المقايسات متعددة المصلية وتحييد الأجسام المضادة التي يمكن أن تقيس في وقت واحد تحييد الأجسام المضادة IgG و IgM للسارس-CoV-2.

سريع، متعدد المراسل المزدوج IgG وIgM سارس-CoV-2 تحييد المقايسة لنظام تحليل التدفق متعددة الخرز القائم

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

على حد علمنا، هذا هو المثال الأول لبروتوكول متعدد المضاعفات قائم على الخرز يستخدم إشرتي مراسل لقياس نتيجتين لكل تحليل في وقت واحد. تسمح هذه التقنية للمستخدم بقياس IgM و IgG المحددين للمضاد في نفس الوقت ، مع عينة أقل ووقت أقصر للنتائج. في حين أن طريقة المراسل المزدوج هذه محددة ل isotyping الأجسام المضادة ، يمكن تكييفها لقياس أزواج التحليل الأخرى ، مثل التعديلات اللاحقة للترجمة أو أشكال الأدوية المجانية مقابل المقيدة.مما يدل على إجراءاتنا اليوم لدينا الدكتور ستيف أنجيلوني، وهو عالم تطبيق ميداني كبير لشركة لومينيكس. لبدء المراسل المزدوج IgG و IgM المقايسة المصلية ، قم بإعداد مزيج حبة multix المطلوبة من حبة الزوجين الفردية والتحكم في مخزون الخرز بتركيز واحد × 10 إلى خرزات الستة لكل ملليلتر. بعد ذلك ، تمييع عينات المصل 100 مرة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المصل إلى 990 ميكرولتر من مخزن PBS-TBN المؤقت ، ثم تمييع العينات عشرة أضعاف أخرى عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من تخفيف 1:100 إلى 180 ميكرولتر من PBS-TBN.عندما يمزج حبة وعينات المصل جاهزة، إضافة 50 ميكرولتر من حبة multix يمزج إلى الآبار المخصصة من لوحة microtiter 96 جيدا غير ملزمة، ثم إضافة 50 ميكرولتر من عينات المصل المخفف إلى الآبار المناسبة. بمجرد إضافة جميع العينات، قم بتغطية الطبق بختم رقائق صغيرة واحتضنه على شاكر لوحة ساخنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، فصل الخرز من خليط التفاعل عن طريق وضع لوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة دقيقتين.حفظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط. ثم عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار. في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس، لطخة لوحة على الورق ماصة.لغسل آبار التفاعل، قم بإزالة اللوحة من مغناطيس اللوحة وأضف 150 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر. غطي الطبق بختم رقائق طازج واحتضني شاكر ساخن لمدة دقيقتين قبل وضعه مرة أخرى على مغناطيس الطبق لمدة دقيقتين أخريين. مع الحفاظ على لوحة على المغناطيس، عكس لوحة لتجاهل supernatant، ولطخة لوحة على الورق ماصة.بعد غسل PBS-TBN الثاني، قم بإزالة اللوحة من المغناطيس وأضف 100 ميكرولتر من مزيج كاشف الكشف الطازج إلى كل بئر. بعد تغطية اللوحة بختم رقائق ميكروبليت، ضعها على طبق ساخن شاكر لمدة 15 دقيقة، ثم على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة دقيقتين. بينما تكون اللوحة على المغناطيس، تجاهل مزيج كاشف الكشف عن طريق عكس اللوحة فوق حاوية نفايات ونقعها على الورق الماصة.غسل آبار رد الفعل مع برنامج تلفزيوني-TBN مرتين كما هو موضح سابقا، ثم إزالة لوحة من المغناطيس. إضافة 100 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر، ثم تغطية لوحة مع ختم احباط ويهز لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية. إزالة ختم احباط والمضي قدما في قراءة 50 ميكرولتر من العينة من كل بئر في محلل التدفق.لقراءة اللوحة، حدد القائمة المنسدلة في الزاوية العلوية اليسرى، وانتقل إلى تكوين اللوحة، ثم قم بتحميل اللوحة التي تم تكوينها مسبقا، وحدد تشغيل لوحة. أخرج حامل اللوحة عن طريق تحديد رمز الإخراج، ثم قم بتحميل اللوحة على حامل اللوحة وحدد رمز السحب لسحب حامل اللوحة. بمجرد أن تطول حاملة اللوحة إلى المحلل، حدد رمز التشغيل لبدء قراءة اللوحة.بالنسبة لمقايسة تحييد المراسل المزدوج ، أضف 50 ميكرولتر من حبة متعددة إلى الآبار المخصصة للوحة microtiter غير ملزمة بشكل جيد ، ثم أضف 25 ميكرولتر من ميكروغرامين لكل ملليلتر ACE2 إلى كل بئر ، وغطى اللوحة بختم احباط. بعد حضانة لمدة دقيقتين على شاكر لوحة ساخنة، إضافة 25 ميكرولتر من تخفيف المصل 1:500 إلى الآبار المخصصة. بمجرد إضافة جميع العينات، قم بإجراء خطوات الحضانة والغسيل والكشف والتحليل كما سبق إثباتها للمقايسة المصلية.اختبار المضادة IgM اقترانها صبغة مراسل DyLight 405 باستخدام عينات المصل في غضون خمسة إلى 60 يوما من ظهور الأعراض وعينة مصل الشريط IgG لم تنتج إشارة عالية لمضاد ارتفاع. بالنسبة للعينات ذات كثافة الفلورسينس المتوسطة عالية IgM ، شوهدت أعلى الإشارات للمجال الملزم للمستقبلات والمستضدات النووية. وفي حين كان ينبغي رفع معدل التر IgM في بعض العينات، فإن مستويات كثافة الفلورسينس المتوسطة الملاحظة لم تتجاوز 140 وحدة من وحدات MFI.وعلاوة على ذلك، فإن حبة التحكم لIgM تفتقر إلى نطاق ديناميكي كبير لكثافة الفلورسينس المتوسطة عند استخدام DyLight 405 المترافق مع مضاد IgM مقارنة بالفيكوريثرين المسمى المضاد IgM بنفس التركيز. للكشف عن IgG ، كان اقتران البنفسجي الرائع أعلى متوسط إشارات كثافة الفلورسينس من اقتران streptavidin من الفلورية سوبر برايت 436. ومع ذلك ، فإن كثافة الإشارة للموازوج البنفسجي الرائعة اختلفت عبر المعايرة ACE2.هذا التقلب إشارة من قبل اقتران البنفسجي الرائعة عبر تركيزات ACE2 تدخلت أيضا مع تحديد تثبيط في المئة من قبل ACE2 عبر مجموعة من تيتر IgG. للكشف عن IgM، عرض phycoerythrin المضادة IgM إشارات أعلى من تلك التي تم إنشاؤها بواسطة DyLight 549 المضادة للإنسان IgM. أثناء تحديد تثبيط ACE2 في المئة من ربط IgM ، كان هناك فرق طفيف ولكن ضئيل بين كاشفي الكشف IgM.لذا فإن إحدى أهم الخطوات في الإجراء هي إعداد مزيج الخرز المتعدد من مخزون حباتك الفردية والتأكد من القيام بذلك بشكل صحيح. لذلك يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لقياس فعالية اللقاحات ورصد الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض الأخرى أيضا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

الكشف عن الأجسام المضادة للمجال الملزمة للمستقبلات من سارس-CoV-2 باستخدام جهاز تقرير حيوي قائم على HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

الفيروسات الزائفة كأداة جزيئية لمراقبة الاستجابات المناعية الخلطية ضد SARS-CoV-2 عن طريق مقايسة التحييد

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

الكشف عن الأجسام المضادة لداء IgG و IgM باستخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...