Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Denne rapport blev finansieret af Luminex Corporation (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) for videnskabelig redigering bistand.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni og Sherry Dunbar er ansatte i Luminex Corporation, der producerer nogle af de reagenser og instrumenter, der blev brugt i denne undersøgelse. Open Access offentliggørelse af denne artikel blev sponsoreret af Luminex Corporation

Denne undersøgelse udvidede funktionaliteten af en multiplex fluorescerende mikrosfære assay, 3Flex, der kvalitativt vurderer IgG reaktion på infektion ved SARS-CoV-21. Mens mange serologiske analyser for COVID-19 registrerer et enkelt antigen, evaluerer denne analyse samtidig S, RBD og Nc antigener og omfatter en intern antistofisotypekontrol7. Derudover bruges ACE2 som en indikator til at opdage neutraliserende antistoftiter til SARS-CoV-2.
Multiantigenanalyser kan være særligt nyttige i fremtiden til diskriminerende immunrespons mellem inficerede og vaccinerede personer. Med SARS-CoV-2, hvis kun S- og RBD-antistoffer vurderes, ville det være umuligt at afgøre, om dette skyldtes en tidligere infektion eller et vaccinationsantistofrespons. Ingen af de vacciner, der i øjeblikket anvendes, er rettet mod Nc-antigen, så ved at evaluere S/RBD- og Nc-antigener er det muligt at skelne tidligere virusinfektion (Nc- og S/RBD-positiv) fra et vaccinationsrespons (kun S/RBD-positiv; Nc-negativ).
I den aktuelle undersøgelse blev 3Flex serologiske og neutraliseringsanalyser (afsnit 5 og 6) overført til et nyt dobbelt reporterflowanalyseinstrument (afsnit 7 og 8). Typiske immunoassay protokoller for perle-baserede multiplex assays ligner standard ELISA protokoller, efter sammenlignelige trin for prøve inkubation, detektion antistof / reporter inkubation, og analyse af resultater8. Tidligere undersøgelser har også vist, hvordan standard ELISA-analyser kan overføres til en perlebaseret multiplexingplatform9.
Analysen protokoller kunne problemfrit overføres fra forgængeren enkelt reporter instrument til den nye dobbelt reporter system, som det fremgår af de resultater, der er opnået for testprøver og kontrol (figur 4 og figur 5). I den serologiske analyse påviste alle positive serumprøver et karakteristisk dosisfølsomt fald i signal svarende til både en højere prøvefortynding og en lavere detektionsantistofkoncentration, mens signalerne til de negative prøver forblev på baggrundsniveau. Tilsvarende svarede faldende signaler for S og RBD, men ikke Nc, til stigende koncentrationer af ACE2-konkurrenten, mens IgG strippet serum var langt mindre påvirket af tilsætning af ACE2. Præinkubation af perlerne med ACE2 i 2 min før tilsætning af serumprøven (som beskrevet i afsnit 6 og 8) blev også sammenlignet med at kombinere perlerne med ACE2 og serum på samme tid og gav kun ringe forskel i resultaterne (data, der ikke blev vist). Men da de opnåede resultater med perlerne plus ACE2 pre-inkubation skridt var mere konsekvent, det var den endelige procedure vedtaget for neutralisering assay protokol (afsnit 6 og 8).
Fordi den dobbelte reporter system indeholder en anden fluorescerende reporter kanal, begge assays blev omdannet til isotyping assays til samtidig at måle både IgG og IgM svar. Den dobbelte reporter funktionalitet flow analysator tillader indsamling af fluorescerende signaler fra to reporter detektion reagenser for hver analysand i multiplex for hver prøve, effektivt fordoble de data, der genereres pr prøve i en analyse. Til udvikling og optimering af de dobbelte reporter assay protokoller, flere kommercielt tilgængelige reporter farvestoffer og detektion antistoffer blev evalueret for den nye RP2 kanal (Figur 7 og Figur 8) for at bestemme den bedste løsning (r) til rådighed. Anti-IgM-antistoffet, der blev konjugeret med DL 405-reporterfarven, klarede sig ikke godt i RP2-kanalen (figur 7), så biotin anti-IgG med SASB blev efterfølgende evalueret til påvisning i RP2-kanalen (Figur 8). Tre kombinationer af RP1- og RP2-detektionsreagenser blev sammenlignet i den dobbelte reporterneutraliseringsanalyse (tabel 1 og figur 9) for at bestemme de kombinationer, der klarer sig bedst, til samtidig påvisning af IgG- og IgM-neutraliserende antistoffer. Mens der var betydelige forskelle i signalintensiteten mellem RP1-kanalen ved hjælp af PE-anti IgM og RP2-kanalen ved hjælp af DL 549 anti-IgM, var der ingen signifikant forskel i målingen af den procent bindende hæmning af ACE2.
Flere begrænsninger i den nuværende metode, og denne undersøgelse er anerkendt. For det første var prøverne testet og anvendt i metodens udvikling og optimering begrænset til sæt af 8-11 prøver. Flere prøver vil blive testet i udvidede undersøgelser for at kontrollere, at metoden er fuldt optimeret. For det andet blev et begrænset antal reporter fluorophores og reporter par testet. Yderligere test af alle tilgængelige journalister i alle mulige kombinationer vil afgøre, hvilke reagenser der kan bruges med succes i denne metode. Anti-IgG antistof konjugeret til biotin var anderledes end anti-IgG antistof konjugeret til BV 421 reporter. Så selv om variabilitet i signalintensiteten for BV 421 anti-IgG eksisterede, kunne det skyldes specificiteten af antistoffet og ikke relateret til reporterfarven. Test af andre tilgængelige BV 421-konjugerede antistoffer kan identificere et andet antistof, der ville klare sig godt i RP2-kanalen. Fremtidige undersøgelser vil også evaluere kombinationen af PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG til påvisning i henholdsvis RP1 og RP2. Sidst, selv med den dobbelte reporter kapacitet af instrumentet, assays er begrænset til to isotyper (to parametre) pr reaktion. Hvis yderligere isotyper skal måles eller fuld isotyping ønskes, skal yderligere reaktioner ved hjælp af de samme to reporterkanaler køres i separate brønde.
Perlebaseret multiplexingteknologi giver mulighed for hurtigt og fleksibelt analysedesign med nem implementering i rutinemæssige laboratoriearbejdsgange3,4,10. Denne undersøgelse viste, at det er nemt at overføre de tidligere beskrevne 3Flex serologiske og neutraliseringsanalyser til SARS-CoV-2 til et flowanalysesystem til måling af IgG med en enkelt reporter eller med mindre modifikation, der samtidig måler både IgG- og IgM-respons ved hjælp af to journalister. Den dobbelte reporter mulighed har klare fordele i forhold til enkelt reporter platforme, fordi det kan give dobbelt så mange data pr prøve, ved hjælp af halvdelen af prøven volumen, og i halvdelen af antallet af reaktion brønde. Med de relevante reporter farvestoffer og detektion antistoffer, isotyping assays kan nemt udvikles og udføres på den dobbelte reporter flow analyse instrument.

COVID-19-pandemien har understreget vigtigheden af hurtigt at kunne udvikle og implementere hurtige, højtydende serologiske tests, der kan bruges til diagnosticering og overvågning af nye patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologiske test kan være yderst nyttig i en pandemi, da den samtidig kan analysere antistoffer mod flere antigener, hvilket giver mulighed for bred patogendækning og kontrol for variabilitet i organismen og værtsresponsen på infektion. Udviklingen af en multiplex fluorescerende perle-baseret assay, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), der kan opdage antistoffer mod spike (S) protein, spike angiotensin-konvertering enzym-2 (ACE2) receptor-bindende domæne (RBD), og nucleocapsid (Nc) af SARS-CoV-2 blev for nylig rapporteret1. 3Flex viste sig at have en reference-SARS-CoV-2 IgG-analyse for serum, der var fremstillet i ≥21 dage fra symptomdebut, men havde større følsomhed med prøver indsamlet i ≤5 dage fra symptomdebut. Derudover blev hæmning af antistofbinding påvist for S- og RBD-antigener ved hjælp af opløselige ACE2 i et neutraliseringsanalyseformat. Multiplex perle-baseret teknologi er blevet bredt vedtaget som en gennemprøvet teknologi til multiplex serologisk test og har klare fordele for storstilet screening, herunder korte tid-til-resultater, små prøve krav, og reduceret arbejdskraft2,3,4.
For nylig er et nyt flowanalyseinstrument blevet tilgængeligt, der giver systemets samme højplex, high-throughput-kapacitet, der blev demonstreret i tidligere arbejde1, men med den ekstra fordel af to reporterkanaler. Evnen til at måle to fluorescerende reportersignaler i en enkelt reaktion gør det muligt at vurdere to resultater pr. analysand for hver prøve og er ideel til isotypingapplikationer, som typisk skal udføres i separate reaktions brønde5. Den dobbelte reporter kapacitet giver dobbelt så mange data for hver prøve i halvt så mange reaktion brønde med halvdelen af prøven volumen krav, og dermed har en klar fordel i forhold til enkelt reporter systemer. Denne undersøgelse beskriver standard serologisk assay protokol og beskriver tilpasningen til en neutralisering assay. Derudover beskriver denne rapport konverteringen af enkelt reporter assay til en dobbelt reporter serologisk analyse, og efterfølgende, en dobbelt reporter neutralisering assay, til samtidig at måle neutraliserende antistoffer af både IgG og IgM isotyper mod SARS-CoV-2 S, RBD, og Nc antigener. Der findes en visuel oversigt over analyseprotokollen i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19-pandemien har understreget behovet for hurtige metoder med høj kapacitet til følsom og specifik serologisk påvisning af infektion med nye patogener, såsom SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testning kan være særlig nyttig, fordi den samtidig kan analysere antistoffer mod flere antigener, der optimerer patogendækningen og kontroller for variabilitet i organismen og den enkelte værtsrespons. Her beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende mikrosfære-baseret assay, der kan detektere både IgM og IgG antistoffer til tre store SARS-CoV-2 antigener-spike (S) protein, spike angiotensin-konvertering enzym-2 (ACE2) receptor-bindende domæne (RBD), og nucleocapsid (Nc). Analysen viste sig at have en sammenlignelig ydeevne med en SARS-CoV-2-referenceanalyse for IgG i serum, der blev fremstillet i ≥21 dage fra symptomdebut, men havde højere følsomhed med prøver indsamlet i ≤5 dage fra symptomdebut. Ved hjælp af opløseligt ACE2 i et neutraliseringsanalyseformat blev der påvist hæmning af antistofbinding for S og RBD.

Optimering af Single Reporter Serological Assay. Koblingsstrategien for alle SARS-CoV-2 antigener er beskrevet i Cameron, et al., 20201 og i trin 2.1 ovenfor. Strategien for koblingsbekræftelse er beskrevet i trin 2.3 ovenfor. For en effektiv kobling skal median fluorescensintensiteten (MFI) være betydeligt højere end no serum/no antistof negativ kontrolreaktion(er) og bør påvise en dosisrespons af faldende MFI-signal med faldende mængder af detektionsreagens. MFI'er på ca. 1.000 MFI-enheder eller derover over baggrundS MFI indikerer generelt effektiv proteinkobling og er afhængige af koncentrationen og specificiteten af detekteringsreagens, der anvendes. Ved hjælp af denne metode blev bekræftelse af S, RBD og Nc antigenkobling testet for to partier perler (Figur 2). MFI-signalerne for alle antigener var signifikant højere end baggrunds-MFI'en og viste en dosisrespons med titrering af detektionsreagenserne. Dataene viste også god reproducerbarhed af MFI niveauer mellem de to forskellige partier af koblede perler.
Optimering af enkelt reporter assay blev gjort som beskrevet i Cameron, et al., 20201. Hvert antigen blev testet ved forskellige koblingskoncentrationer med forskellige fortyndinger af flere serumprøver, der repræsenterede høje, mellemstore, lave og negative prøver. Desuden, fordi analysen måler IgG titers, en IgG-strippet serum blev brugt som en ekstra negativ prøve. Resultaterne af en repræsentativ prøvefortyndingsserie med forskellige antigenkoblingsniveauer er vist i figur 3. Denne indledende fortyndingsserie blev testet med en fast koncentration af detektionsreagenser for at få et potentielt udvalg af repræsentative antigenspecifikke og baggrunds MFI-niveauer. Ud fra disse data blev yderligere fortyndingsområdeer og antigenkoblingsniveauer fastlagt og testet yderligere med yderligere prøver (data, der ikke er vist).
Dernæst blev koncentrationen af detektionsreagens optimeret til brug med de forskellige serumfortyndinger og antigenkoblingsniveauer. Repræsentative data med 6 positive og 2 negative prøver er vist i figur 4. Efter yderligere test med flere hundrede negative serumprøver før COVID-19 blev de endelige optimale antigenkoblingsniveauer og detektionsregentkoncentrationer udvalgt til den endelige analyseprotokol, som beskrevet i afsnit 5.
Konvertering til en enkelt reporter neutralisering assay Konvertering af enkelt reporter serologisk analyse til en neutralisering assay blev opnået ved at tilføje en inkubation skridt ved hjælp af ACE2 (som en konkurrerende reagens) med perlerne forud for tilsætning af serum prøve. Ved at titrere mængden af ACE2 tilsat, hæmning af IgG binding til S og RBD antigener blev observeret, som vist i figur 5. Mens de 11 patient sera havde forskellige titere af IgG, hver viste et betydeligt fald i MFI signal med stigende ACE2 koncentration. Som forventet påvirker ACE2 kun MFI-signalerne fra S og RBD, men ikke Nc antigen.
Den procent resterende MFI-signal i forhold til 0 μg/ml ACE2 for alle prøver er vist i figur 6. For de fleste prøver blev der observeret et signaltab >30 % for S og RBD med stigende ACE2-koncentration. Som forventet var der ingen effekt af ACE2 på Nc-signalet.
Konvertering til en dobbelt reporter IgG og IgM serologisk analyse For den dobbelte reporter IgG og IgM assay, standard enkelt reporter assay betingelser blev brugt til at teste forskellige antistof og reporter kombinationer for de to reporter kanaler. RP1-kanalen ligner tidligere flowanalyseinstrumenter med påvisning af "orange" fluorescens for reporterfarvestoffer som PE. Den anden kanal, RP2, anvender en violet excitation laser, der kan bruges til at opdage den "blå" fluorescens af farvestoffer ophidset ved 402 nm med emission spektre toppe i 421-441 nm rækkevidde.
Flere forskellige anti-humane IgG- og IgM-antistofkombinationer blev testet i forskellige koncentrationer med standard 2.000 gange prøvefortynding og inkubationsbetingelser, der er beskrevet i afsnit 6. En indledende test af anti-IgM konjugeret til DyLight 405 reporter farvestof (DL 405; excitation ved 400 nm og emission ved 420 nm) for RP2-kanalen blev udført ved hjælp af et sæt af 11 PCR-positive prøver med DFSO spænder fra 5 til >60 dage, og en IgG-strippet serum prøve. Dette reagens har ikke givet et højt signal i RP2-kanalen som vist i figur 7A, B, C. For prøver med den høje IgM RP2 MFI blev de højeste signaler set for RBD og Nc (Figur 7B, C). Mens IgM-titere på dette tidspunkt skulle forhøjes i nogle prøver, oversteg de observerede MFI-niveauer ikke 140 MFI-enheder med IgM-detektionsreagenset. Desuden manglede kontrolperler for IgM et betydeligt dynamikområde for MFI, når der anvendes DL 405 konjugeret til anti-IgM i forhold til en PE-mærket anti-IgM RP1 reporter anvendes i de samme koncentrationer (Figur 7D).
Da et egnet RP2-reporter-mærket detektionsreagens til IgM ikke var tilgængeligt, blev den originale biotin anti-IgG med SASB testet til brug i RP2-kanalen. Signalet til IgG i RP2-kanalen med SASB havde ikke det samme dynamiske område som med SAPE, men det havde stadig et passende interval til måling af IgG-titere til S, RBD og Nc (Figur 8). Disse data førte til test af forskellige RP1 IgM- og RP2 IgG-detektionsreagenskombinationer som beskrevet nedenfor.
Konvertering til dobbelt reporter neutralisering assay Den dobbelte reporter serologiske assay blev konverteret til en neutralisering assay ved at tilføje en inkubation skridt med ACE2 og perler, før du tilføjer serum prøve. Der blev anvendt en 2-doblingserie af ACE2, der startede ved 16 μg/ml, og derefter blev testet med sæt på 11 prøver og strippet sera som beskrevet ovenfor. Derudover blev 3 forskellige kombinationer af RP1 IgM og RP2 IgG-påvisning antistofblandinger testet på et sæt af 11 prøver og strippet serum kontrol. De endelige kombinationer og reagenskoncentrationer, der vurderes at være optimale, er beskrevet i tabel 1.
Til IgG-påvisning blev den biotin anti-menneskelige IgG/SASB, der blev brugt i den oprindelige enkeltreporteranalyse, testet sammen med en anden anti-IgG, der blev konjugeret til BV-reporterfarven. Mens BV-konjugaten havde høje RP2 MFI-signaler, varierede MFI-signalintensiteten for IgG-titer på tværs af ACE2-titrerne (Figur 9A,C, E). Biotin anti-human IgG/SASB-kombinationen havde et mere ensartet MFI-signalfald på tværs af ACE2-titreringen sammenlignet med BV-konjugaten, hvilket viste en dosisrespons, selv om MFI-niveauerne var lavere. Signaludsvingene fra BV konjugerer på tværs af ACE2-koncentrationer forstyrrede også bestemmelse af den procenthæmning, som ACE2 havde på tværs af IgG-titerne i forhold til biotin-anti-human IgG/SASB-kombinationen (Figur 9B, D,F). Prøver med lave MFI-signaler, såsom DFSO 3-prøven, har ikke høj nok titere til at vurdere disse reagensers ydeevne eller måle IgG-neutraliserende kapacitet.
Til bestemmelse af IgM-titere i RP1-kanalen blev en PE-konjugeret anti-IgM sammenlignet med en anti-human IgM, der blev konjugeret til DyLight 549-reporterfarvestof (DL 549; excitation ved 562 nm og emission ved 576 nm) ved de koncentrationer, der er anført i tabel 1. Af disse to reagenser udviste PE anti-IgM højere MFI'er end dem, der blev genereret af DL 549 anti human IgM for de testede prøver (Figur 9A,C,E). IgM-kontrolperle, der måler tilsætning af disse reagenser, havde forskellige gennemsnitlige MFI'er på ≈ 17.000 for PE anti-IgM og 2.723 for DL 549-konjugaten. Selv med disse forskelle var virkningen af de forskellige ACE2-koncentrationer på MFI målbar med DL 549-konjugaten. Til bestemmelse af ACE2 procent hæmning af IgM-binding var der en lille, men ubetydelig forskel mellem de to IgM-detektionsreagenser (Figur 9B, D,F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kombination</td>
			<td rowspan="2">Reporter</td>
			<td colspan="2">Endelig koncentration i brønd (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Strålende Violet 421 Anti-Human IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Liste over RP1 og RP2 reporter farvestof kombinationer testet. Flere forskellige RP1 og RP2 reporter farvestoffer blev evalueret til måling af IgG og IgM titers. De tre kombinationer, der er vist ovenfor, blev testet ved forskellige RP1-detektionstilstande og til optimering af neutraliseringsanalysen. For RP2-kombinationer, der anvender SASB, vises koncentrationer for det biotinylerede detektionsantistof og SASB. * Endelig koncentration repræsenterer den endelige koncentration i reaktionen godt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Figur 1: Rutediagram, der fremhæver de vigtigste assayprotokoltrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Figur 2: Bekræftelse af antigenkobling. Antigener blev koblet på 100, 10 og 1 pmol/106 perler. For S og RBD antigener blev kanin anti-S sera brugt og opdaget med PE anti-kanin IgG. For Nc, en Protein G-renset kanin polyklonale anti-Nc blev brugt. Titreringskurverne for perler kombineret med 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) og 100 pmol Nc (C) er vist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Figur 3: Optimering af serumfortynding med forskellige antigenkoblingsniveauer. Serumprøver, der repræsenterer høje, mellemstore, lave og negative prøver, blev testet med de forskellige pmolantigen/106 perlekoblinger. En 4-fold serum titrering blev testet med en multiplex blanding af antigen-koblede perler ved hjælp af analysen protokol beskrevet i afsnit 5. MFI-værdierne for titreringskurverne for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Figur 4: Bestemmelse af optimal serumfortynding og detektionsreagenskoncentration. Otte serumprøver, herunder negative patienter (2 prøver) og lav- til højpositive (6 prøver), blev testet ved yderligere serumfortyndinger med tre forskellige detektionsreagenskoncentrationer. MFI-resultaterne vises for S (A), RBD (B) og Nc (C). På grundlag af disse og andre data (ikke vist) blev der udvalgt en prøvefortynding på 1:2.000 og en antistofkoncentration på biotin på 0,62 μg/mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Figur 5: Optimering af enkelt reporter neutralisering assay. Ændring af enkelt reporter serologisk analyse til en neutraliserende antistof afsløring assay blev udført ved at tilføje en inkubation skridt med ACE2 som en konkurrent, som beskrevet i afsnit 6. Et sæt på 11 prøver, der spænder fra lav- til højpositiv titer sera, og en IgG-stribet serumprøve blev testet med en dobbelt fortyndingsserie af ACE2, der starter ved 4 μg/ml, ved hjælp af standard assay betingelser. På tværs af dette interval af ACE2-koncentrationer kan et fald i MFI ses med øget ACE2 for S (A) og RBD (B), men ikke for Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Figur 6: Procent hæmning af signal med ACE2. Den procent resterende signaler for sættet af 11 prøver (fra figur 4) er vist. For hver prøve blev der, uanset dens IgG-titer, opnået et maksimalt fald på ≥30 % MFI-signal for S (A) og RBD (B) ved den højeste ACE2-koncentration. For Nc antigen (C) var der ingen signifikant hæmning af signal med nogen mængde ACE2 testet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Figur 7: Test af DyLight 405 anti-IgM som RP2 IgM-detektionsreagens. Et sæt på 11 prøver og IgG-strippet sera blev brugt til at teste DL 405-konjugeret anti-IgM som en RP2 detektion reagens. RP2 IgM MFI-signalerne for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Det højeste MFI-signal for et antigen med en prøve var ca. 140 MFI-enheder til RBD med prøve H (B). Selv signalet på IgM-kontrolperlesættet var mindre end 1.000 MFI i RP2-kanalen på tværs af hele antistofmelerområdet og viste ikke det øgede dynamikområde, der blev observeret med PE anti-IgM-detektionsantistofet i RP1-kanalen (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Figur 8: Optimering af SASB som RP2 reporter med Biotin anti-IgG. Et sæt på 11 prøver og IgG-strippet sera blev brugt til at teste en fortyndingsserie sasb med standard 0,62 μg/mL biotin anti-IgG. De resulterende IgG MFI'er i RP2-kanalen for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Figur 9: Sammenligning af tre forskellige kombinationer af RP1 IgM og RP1 IgG-detektionsblandinger. Tre forskellige detektion antistof blandinger blev testet på 11 prøver og IgG strippet sera. De anvendte kombinationer og endelige koncentrationer er beskrevet i tabel 1. Alle prøver blev testet med en 2-dobling af ACE2-fortyndinger, der startede ved 16 μg/ml. Data for prøver ved DFSO på 3, 12 og 30 dage vises. MFI-signalerne for RP1 IgM (orange) og RP2 IgG (blå) er vist i A (DFSO 3), C (DFSO 12) og E (DFSO 30). ACE2 procent resterende MFI'er er vist i B (DFSO 3), D (DFSO 12) og F (DFSO 30). Signaler, der repræsenterer et fald på >30 % sammenlignet med ingen ACE2-kontroller, fremhæves lysegrønt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Et flowanalysesystem til perlebaserede multiplexed assays, som giver en to-reporter udlæsning blev brugt til udvikling af multiplex serologiske og antistofneutralisering assays, der samtidig kan måle neutraliserende IgG og IgM antistoffer for SARS-CoV-2.

En hurtig, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 neutralisering Assay for en multiplexed perle-baseret Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Så vidt vi ved, er dette det første eksempel på en perlebaseret multiplexingprotokol, der bruger to reportersignaler til samtidig at måle to resultater pr. analysand. Denne teknik giver brugeren mulighed for at måle antigen-specifikke IgM og IgG på samme tid, med mindre prøve og en kortere tid til resultater. Mens denne dobbelte reporter metode er specifik for antistof isotyping, det kunne tilpasses til at måle andre analysand par, såsom post-translationelle ændringer eller gratis versus bundet lægemiddel former.Viser vores procedure i dag har vi Dr.Steve Angeloni, en senior felt ansøgning videnskabsmand for Luminex Corporation. For at begynde den dobbelte reporter IgG og IgM serologisk analyse, forberede de nødvendige multiplex perle blander fra de enkelte par perle og kontrol perle bestande i en koncentration på en gange 10 til de seks perler pr milliliter. Derefter fortyndes serumprøverne 100 gange ved at tilsætte 10 mikroliter serum til 990 mikroliter PBS-TBN-buffer, og fortynd derefter prøverne yderligere tidoblet ved at tilsætte 20 mikroliter af 1:100 fortynding til 180 mikroliter af PBS-TBN.Når perleblandingerne og serumprøverne er klar, tilsættes 50 mikroliter af multiplexperleblandingerne til de tildelte brønde på en 96-brønd ikke-bindende mikrotiterplade og tilsæt derefter 50 mikroliter af de fortyndede serumprøver til de relevante brønde. Når alle prøver er tilsat, dække pladen med en mikropladefolie forsegling og inkubere på en opvarmet plade shaker ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Adskil derefter perlerne fra reaktionsblandingen ved at placere pladen på en magnetisk pladeseparator i to minutter.Hold pladen på magneten, fjern folieforseglingen. Vend derefter forsigtigt pladen over en affaldsbeholder og svirp forsigtigt supernatanten ud af brøndene. Mens du stadig holder pladen på magneten, skal du blotlægge pladen på absorberende papir.For at vaske reaktionsbjerne skal du fjerne pladen fra plademagneten og tilføje 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønd. Dæk pladen med en frisk folieforsegling og inkuber på den opvarmede shaker i to minutter, før du placerer den tilbage på plademagneten i yderligere to minutter. Mens du holder pladen på magneten, vend pladen for at kassere supernatanten, og blotter pladen på absorberende papir.Efter den anden PBS-TBN vask, fjerne pladen fra magneten og tilføje 100 mikroliter af frisk Detection Reagent mix til hver brønd. Efter at have dækket pladen med en mikropladefolieforsegling, skal du placere den på en opvarmet plade shaker i 15 minutter og derefter på en magnetisk pladeseparator i to minutter. Mens pladen er på magneten, skal du kassere detektionsgenagentblandingen ved at invertere pladen over en affaldsbeholder og blotte den på absorberende papir.Vask reaktionstjerne med PBS-TBN dobbelt så tidligere påvist, og fjern derefter pladen fra magneten. Tilsæt 100 mikroliter PBS-TBN til hver brønd, dæk derefter pladen med folieforsegling og ryst i to minutter ved 37 grader Celsius. Fjern folieforseglingen, og fortsæt med at læse 50 mikroliter af prøven fra hver brønd i flowanalysator.Hvis du vil læse pladen, skal du vælge rullemenuen i øverste venstre hjørne, navigere til Pladekonfiguration, indlæse den tidligere konfigurerede plade og vælge Kør plade. Skub pladeholderen ud ved at vælge ikonet Skub ud, læg derefter pladen på pladeholderen, og vælg ikonet Træk tilbage for at trække pladeholderen tilbage. Når pladeholderen har trukket sig ind i analysator, skal du vælge ikonet Kør for at begynde at læse pladen.For den dobbelte reporter neutralisering assay, tilføje 50 mikroliter af multiplex perle blander til tildelte brønde af en 96-godt nonbinding mikrotiter plade, derefter tilføje 25 mikroliter af to mikrogram per milliliter ACE2 til hver brønd, og dækkede pladen med en folie forsegling. Efter en to minutters inkubation på en opvarmet plade shaker tilsættes 25 mikroliter af 1:500 serumfortyndinger til de tildelte brønde. Når alle prøver er tilsat, udføre inkubation, vask, detektion, og analyse trin som tidligere påvist for den serologiske analyse.En test af anti-IgM konjugeret til DyLight 405 reporter farvestof ved hjælp af serum prøver inden for fem til 60 dage fra symptom debut og en IgG strimmel serum prøve ikke producere et højt signal til spike antigen. For prøver med en høj IgM medium fluorescensintensitet blev de højeste signaler set for receptorbindingsdomænet og nukleocapsid antigener. Mens IgM-titeren burde have været forhøjet i nogle prøver, oversteg de observerede medium fluorescensintensitetsniveauer ikke 140 MFI-enheder.Desuden manglede kontrolperlen til IgM et betydeligt dynamisk område for median fluorescensintensitet, når der blev brugt DyLight 405 konjugeret til anti-IgM sammenlignet med et fykoerythrin mærket anti-IgM i samme koncentration. For IgG detektion, den geniale violet konjugat havde højere median fluorescens intensitet signaler end streptavidin konjugat af fluorphore Super Bright 436. Signalintensiteten for den strålende violette konjugat varierede dog på tværs af ACE2-titrerne.Dette signal udsving ved den strålende violet konjugat på tværs af ACE2 koncentrationer også forstyrret bestemmelse af procent hæmning af ACE2 på tværs af rækken af IgG titers. Til IgM-detektion viste phycoerythrin anti-IgM højere signaler end dem, der genereres af DyLight 549 anti-human IgM. Mens bestemmelse ACE2 procent hæmning af IgM bindende, der var en lille, men ubetydelig forskel mellem de to IgM detektion reagenser.Så et af de vigtigste trin i proceduren er at forberede din multiplex perle mix fra dine individuelle perle bestande og sørg for at gøre det korrekt. Så denne procedure kan også bruges til at måle effekten af vacciner og overvåge immunresponset på andre patogener samt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generation af tofarvede Antigen Microarrays til samtidig påvisning af IgG og IgM-autoantistoffer

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Perle baseret Multiplex Assay for analyse af tåre cytokin profiler

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Påvisning af SARS-CoV-2 receptorbindende domæneantistof ved hjælp af en HiBiT-baseret bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkriptase PCR spytdiagnostisk strategi ved hjælp af open source pipetteringsrobotter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Samtidig påvisning af forskellige antistofklasser i en multiplexet serologisk test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypede vira som et molekylært værktøj til overvågning af humorale immunresponser mod SARS-CoV-2 via neutraliseringsanalyse

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Påvisning af rabies IgG- og IgM-antistoffer ved hjælp af rabies indirekte fluorescerende antistoftest

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...