Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Dit rapport werd gefinancierd door Luminex Corporation (Austin, TX). De auteurs bedanken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) voor wetenschappelijke redactiehulp.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni en Sherry Dunbar zijn werknemers van Luminex Corporation dat enkele van de reagentia en instrumenten produceert die in deze studie werden gebruikt. Open Access publicatie van dit artikel werd gesponsord door Luminex Corporation

Deze studie breidde de functionaliteit uit van een multiplex fluorescerende microsfeertest, 3Flex, die kwalitatief de IgG-respons op infectie door SARS-CoV-2beoordeelt 1. Hoewel veel serologische testen voor COVID-19 een enkel antigeen detecteren, evalueert deze test tegelijkertijd S-, RBD- en Nc-antigenen en bevat een interne antilichaamisotypecontrole7. Daarnaast wordt ACE2 gebruikt als indicator om neutraliserende antilichaamtiters tegen SARS-CoV-2 te detecteren.
Multi-antigeentests kunnen in de toekomst bijzonder nuttig zijn voor het onderscheiden van immuunresponsen tussen geïnfecteerde en gevaccineerde personen. Met SARS-CoV-2, als alleen S- en RBD-antilichamen worden geëvalueerd, zou het onmogelijk zijn om te onderscheiden of dit te wijten was aan een eerdere infectie of aan een vaccinatie-antilichaamrespons. Geen van de vaccins die momenteel in gebruik zijn, is gericht op het Nc-antigeen, dus door S / RBD- en Nc-antigenen te evalueren, is het mogelijk om eerdere virale infectie (Nc- en S / RBD-positief) te onderscheiden van een vaccinatierespons (alleen S / RBD-positief; Nc-negatief).
In de huidige studie werden de 3Flex serologische en neutralisatie assays (secties 5 en 6) overgebracht naar een nieuw dual reporter flow analyse-instrument (secties 7 en 8). Typische immunoassayprotocollen voor op kralen gebaseerde multiplextests zijn vergelijkbaar met standaard ELISA-protocollen, volgens vergelijkbare stappen voor monsterincubatie, detectie van antilichaam / reporter-incubatie en analyse van resultaten8. Eerdere studies hebben ook aangetoond hoe standaard ELISA-assays kunnen worden overgebracht naar een op kralen gebaseerd multiplexingplatform9.
De testprotocollen konden naadloos worden overgezet van het vorige single reporter-instrument naar het nieuwe dual reporter-systeem, zoals blijkt uit de resultaten die zijn verkregen voor de testmonsters en -controles(figuur 4 en figuur 5). In de serologische test vertoonden alle positieve serummonsters een karakteristieke dosisresponsieve afname van het signaal die overeenkomt met zowel een hogere monsterverdunning als een lagere detectieantilichaamconcentratie, terwijl de signalen voor de negatieve monsters op achtergrondniveaus bleven. Evenzo kwamen voor de neutralisatietest afnemende signalen voor S en RBD, maar niet voor Nc, overeen met toenemende concentraties van de ACE2-concurrent, terwijl het IgG-gestripte serum veel minder werd beïnvloed door de toevoeging van ACE2. Het vooraf incuberen van de kralen met ACE2 gedurende 2 minuten voorafgaand aan de toevoeging van het serummonster (zoals beschreven in rubrieken 6 en 8), werd ook vergeleken met het tegelijkertijd combineren van de kralen met ACE2 en serum en produceerde weinig verschil in de resultaten (gegevens niet getoond). Omdat de resultaten verkregen met de kralen plus ACE2 pre-incubatiestap echter consistenter waren, was dit de definitieve procedure die werd gevolgd voor het neutralisatietestprotocol (secties 6 en 8).
Omdat het dual reporter-systeem een tweede fluorescerend reporterkanaal bevat, werden beide assays omgezet in isotyping-assays om tegelijkertijd zowel IgG- als IgM-responsen te meten. De dual reporter-functionaliteit van de flow analyzer maakt het mogelijk om fluorescerende signalen te verzamelen van twee reporterdetectiereagentia voor elke analyt in de multiplex voor elk monster, waardoor de gegevens die per monster in een test worden gegenereerd, effectief worden verdubbeld. Voor de ontwikkeling en optimalisatie van de dual reporter assay protocollen werden verschillende commercieel beschikbare reporter kleurstoffen en detectie antilichamen geëvalueerd voor het nieuwe RP2 kanaal (Figuur 7 en Figuur 8) om de beste beschikbare optie(s) te bepalen. Het anti-IgM-antilichaam geconjugeerd met de DL 405 reporterkleurstof presteerde niet goed in het RP2-kanaal(figuur 7),dus biotine anti-IgG met SASB werd vervolgens geëvalueerd voor detectie in het RP2-kanaal(figuur 8). Drie combinaties van RP1- en RP2-detectiereagentia werden vergeleken in de dual reporter neutralisatietest (tabel 1 en figuur 9) om de best presterende combinaties te bepalen voor gelijktijdige detectie van IgG- en IgM-neutraliserende antilichamen. Hoewel er significante verschillen waren in de signaalintensiteit tussen het RP1-kanaal met PE-anti IgM en het RP2-kanaal met DL 549 anti-IgM, was er geen significant verschil in de meting van de procentuele bindingsremming door ACE2.
Verschillende beperkingen van de huidige methode en deze studie worden erkend. Ten eerste waren de monsters die werden getest en gebruikt bij de ontwikkeling en optimalisatie van de methode beperkt tot sets van 8-11 monsters. Meer monsters zullen worden getest in uitgebreide studies om te controleren of de methode volledig is geoptimaliseerd. Ten tweede werd een beperkt aantal reporter fluoroforen en reporterparen getest. Verder testen van alle beschikbare melders in alle mogelijke combinaties zal bepalen welke reagentia met succes kunnen worden gebruikt in deze methode. Het anti-IgG-antilichaam geconjugeerd aan biotine was anders dan het anti-IgG-antilichaam geconjugeerd aan de BV 421-verslaggever. Dus, hoewel variabiliteit in de signaalintensiteit voor de BV 421 anti-IgG bestond, kan dit te wijten zijn aan de specificiteit van het antilichaam en niet gerelateerd aan de reporterkleurstof. Het testen van andere beschikbare BV 421-geconjugeerde antilichamen kan een ander antilichaam identificeren dat goed zou presteren in het RP2-kanaal. Toekomstige studies zullen ook de combinatie van PE anti-IgM met BV 421 anti-humaan IgG evalueren voor detectie in respectievelijk RP1 en RP2. Ten slotte zijn assays, zelfs met de dual reporter-capaciteit van het instrument, beperkt tot twee isotypen (twee parameters) per reactie. Als extra isotypen moeten worden gemeten of volledige isotypering gewenst is, moeten extra reacties met dezelfde twee reporterkanalen in afzonderlijke putten worden uitgevoerd.
Op kralen gebaseerde multiplexingtechnologie maakt een snel en flexibel testontwerp mogelijk met eenvoudige implementatie in routinematige laboratoriumworkflows3,4,10. Deze studie toonde het gemak aan bij het overbrengen van de eerder beschreven 3Flex serologische en neutralisatietests voor SARS-CoV-2 naar een stroomanalysesysteem voor het meten van IgG met een enkele reporter, of met lichte modificatie, waarbij tegelijkertijd zowel IgG- als IgM-responsen worden gemeten met behulp van twee reporters. De dual reporter-optie heeft duidelijke voordelen ten opzichte van single reporter-platforms omdat het twee keer zoveel gegevens per monster kan leveren, met behulp van de helft van het steekproefvolume en in de helft van het aantal reactieputten. Met de juiste reporterkleurstoffen en detectieantistoffen kunnen isotyping-assays eenvoudig worden ontwikkeld en uitgevoerd op het dual reporter flow analysis-instrument.

De COVID-19-pandemie heeft het belang benadrukt van het snel kunnen ontwikkelen en implementeren van snelle, high-throughput, hoogwaardige serologische tests die kunnen worden gebruikt voor de diagnose en surveillance van nieuwe pathogenen zoals SARS-CoV-2. Multiplex serologische testen kunnen uiterst nuttig zijn in een pandemie, omdat het tegelijkertijd antilichamen tegen meerdere antigenen kan analyseren, wat zorgt voor een brede pathogeendekking en controles voor variabiliteit in het organisme en de reactie van de gastheer op infectie. De ontwikkeling van een multiplex fluorescerende op kralen gebaseerde test, het SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), dat antilichamen kan detecteren tegen het spike (S) -eiwit, het spike angiotensine-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD) en nucleocapsid (Nc) van SARS-CoV-2 werd onlangs gemeld1. 3Flex bleek vergelijkbare prestaties te hebben als een referentie SARS-CoV-2 IgG-test voor serum verkregen op ≥21 dagen na het begin van de symptomen, maar had een hogere gevoeligheid met monsters verzameld op ≤5 dagen na het begin van de symptomen. Bovendien werd remming van antilichaambinding aangetoond voor S- en RBD-antigenen met behulp van oplosbare ACE2 in een neutralisatietestformaat. Multiplex-op kralen gebaseerde technologie is op grote schaal toegepast als een bewezen technologie voor multiplex serologische testen en heeft duidelijke voordelen voor grootschalige screening, waaronder een korte tijd tot resultaten, kleine monstervereisten en verminderde arbeid2,3,4.
Onlangs is een nieuw stroomanalyse-instrument beschikbaar gekomen dat dezelfde high-plex, high-throughput-capaciteit biedt als het systeem dat in eerder werk1werd gedemonstreerd, maar met het extra voordeel van twee reporterkanalen. De mogelijkheid om twee fluorescerende reportersignalen in een enkele reactie te meten, maakt de beoordeling van twee resultaten per analyt voor elk monster mogelijk en is ideaal voor isotyperingstoepassingen, die meestal in afzonderlijke reactieputten moeten worden uitgevoerd5. De dubbele reportercapaciteit biedt twee keer de gegevens voor elk monster in half zoveel reactieputten met de helft van de vereisten voor het monstervolume, en heeft dus een duidelijk voordeel ten opzichte van systemen met één verslaggever. Deze studie beschrijft het standaard serologische assay protocol en beschrijft de aanpassing aan een neutralisatie assay. Daarnaast beschrijft dit rapport de conversie van de single reporter assay naar een dual reporter serologische assay, en vervolgens een dual reporter neutralisatie assay, om tegelijkertijd neutraliserende antilichamen van zowel IgG- als IgM-isotypen tegen de SARS-CoV-2 S, RBD en Nc-antigenen te meten. Een visueel overzicht van het testprotocol is te vinden in figuur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

De COVID-19-pandemie heeft de noodzaak onderstreept van snelle high-throughput-methoden voor gevoelige en specifieke serologische detectie van infecties met nieuwe pathogenen, zoals SARS-CoV-2. Multiplex serologische testen kunnen bijzonder nuttig zijn omdat het tegelijkertijd antilichamen tegen meerdere antigenen kan analyseren die de dekking van pathogenen optimaliseren en controles op variabiliteit in het organisme en de individuele gastheerrespons. Hier beschrijven we een SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende microsfeergebaseerde test die zowel IgM- als IgG-antilichamen kan detecteren tegen drie belangrijke SARS-CoV-2-antigenen- het spike (S) -eiwit, spike angiotensine-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-bindend domein (RBD) en nucleocarpsid (Nc). De test bleek vergelijkbare prestaties te hebben als een SARS-CoV-2-referentietest voor IgG in serum verkregen na ≥21 dagen na het begin van de symptomen, maar had een hogere gevoeligheid met monsters verzameld op ≤5 dagen na het begin van de symptomen. Verder werd met behulp van oplosbare ACE2 in een neutralisatietestformaat remming van antilichaambinding aangetoond voor S en RBD.

Optimalisatie van de Single Reporter Serological Assay. De koppelingsstrategie voor alle SARS-CoV-2-antigenen wordt beschreven in Cameron, et al., 20201 en in stap 2.1 hierboven. De strategie voor koppelingsbevestiging wordt beschreven in stap 2.3 hierboven. Voor een efficiënte koppeling moeten de waarden van de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) aanzienlijk hoger zijn dan de negatieve controlereactie(s) zonder serum/geen antilichaam en moeten ze een dosisrespons van afnemend MFI-signaal aantonen met afnemende hoeveelheden detectiereagens. MFI's van ongeveer 1.000 MFI-eenheden of meer over achtergrond MFI duiden over het algemeen op efficiënte eiwitkoppeling en zijn afhankelijk van de concentratie en specificiteit van het gebruikte detectiereagens. Met behulp van deze methode werd de bevestiging van S-, RBD- en Nc-antigeenkoppeling getest op twee partijen kralen(figuur 2). De MFI-signalen voor alle antigenen waren significant hoger dan de MFI op de achtergrond en vertoonden een dosisrespons met titratie van de detectiereagentia. De gegevens toonden ook een goede reproduceerbaarheid van MFI-niveaus tussen de twee verschillende partijen gekoppelde kralen.
Optimalisatie van de single reporter assay werd gedaan zoals beschreven in Cameron, et al., 20201. Elk antigeen werd getest bij verschillende koppelingsconcentraties met verschillende verdunningen van verschillende serummonsters die hoge, gemiddelde, lage en negatieve monsters vertegenwoordigden. Omdat de test IgG-titers meet, werd bovendien een IgG-gestript serum gebruikt als een extra negatief monster. De resultaten van een representatieve monsterverdunningsreeks met verschillende antigeenkoppelingsniveaus zijn weergegeven in figuur 3. Deze initiële verdunningsreeks werd getest met een vaste concentratie van detectiereagentia om een potentieel bereik van representatieve antigeenspecifieke en achtergrond MFI-niveaus te krijgen. Op basis van deze gegevens werden aanvullende monsterverdunningsbereiken en antigeenkoppelingsniveaus bepaald en verder getest met aanvullende monsters (gegevens niet weergegeven).
Vervolgens werd de concentratie van het detectiereagens geoptimaliseerd voor gebruik met de verschillende serumverdunningen en antigeenkoppelingsniveaus. Representatieve gegevens met 6 positieve en 2 negatieve monsters zijn weergegeven in figuur 4. Na aanvullende tests met enkele honderden negatieve pre-COVID-19 serummonsters werden de uiteindelijke optimale antigeenkoppelingsniveaus en detectieconcentraties geselecteerd voor het definitieve testprotocol, zoals beschreven in rubriek 5.
Conversie naar één neutralisatietest voor verslaggevers Conversie van de serologische test van de enkele reporter naar een neutralisatietest werd bereikt door een incubatiestap toe te voegen met ACE2 (als een concurrerend reagens) met de kralen voorafgaand aan het toevoegen van het serummonster. Door de toegevoegde hoeveelheid ACE2 te titreren, werd remming van IgG-binding aan de S- en RBD-antigenen waargenomen, zoals weergegeven in figuur 5. Hoewel de sera van 11 patiënten verschillende titers van IgG hadden, vertoonden ze elk een significante afname van het MFI-signaal met een toenemende ACE2-concentratie. Zoals verwacht heeft ACE2 alleen invloed op de MFI-signalen van S en RBD, maar niet op het Nc-antigeen.
Het percentage resterende MFI-signaal ten opzichte van 0 μg/ml ACE2 voor alle monsters is weergegeven in figuur 6. Voor de meeste monsters werd een signaalverlies >30% waargenomen voor S en RBD met toenemende ACE2-concentratie. Zoals verwacht was er geen effect van ACE2 op het Nc-signaal.
Conversie naar een dual reporter IgG en IgM serologische assay Voor de dual reporter IgG en IgM assay werden de standaard single reporter assay condities gebruikt om verschillende antilichaam- en reportercombinaties voor de twee reporter kanalen te testen. Het RP1-kanaal is vergelijkbaar met eerdere stroomanalyse-instrumenten met detectie van "oranje" fluorescentie voor reporterkleurstoffen zoals PE. Het tweede kanaal, RP2, maakt gebruik van een violette excitatielaser die kan worden gebruikt voor het detecteren van de "blauwe" fluorescentie van kleurstoffen die worden geëxciteerd bij 402 nm met emissiespectrapieken in het bereik van 421-441 nm.
Verschillende anti-humane IgG- en IgM-antilichaamcombinaties werden getest in verschillende concentraties met de standaard 2.000-voudige monsterverdunnings- en incubatieomstandigheden zoals beschreven in sectie 6. Een eerste test van anti-IgM geconjugeerd aan de DyLight 405 reporterkleurstof (DL 405; excitatie bij 400 nm en emissie bij 420 nm) voor het RP2-kanaal werd uitgevoerd met behulp van een set van 11 PCR-positieve monsters met DFSO variërend van 5 tot >60 dagen, en een IgG-gestript serummonster. Dit detectiereagens produceerde geen hoog signaal in het RP2-kanaal zoals weergegeven in figuur 7A, B, C. Voor monsters met de hoge IgM RP2 MFI werden de hoogste signalen gezien voor RBD en Nc(Figuur 7B,C). Hoewel IgM-titers op dit moment in sommige monsters verhoogd moeten zijn, waren de waargenomen MFI-niveaus niet hoger dan 140 MFI-eenheden met het IgM-detectiereagens. Bovendien ontbrak het de controlekraal voor IgM aan een significant dynamisch bereik voor MFI bij gebruik van DL 405 geconjugeerd aan anti-IgM in vergelijking met een PE-gelabelde anti-IgM RP1-reporter die bij dezelfde concentraties werd gebruikt(figuur 7D).
Omdat er geen geschikt detectiereagens met RP2-reporterlabel voor IgM beschikbaar was, werd het oorspronkelijke biotine anti-IgG met SASB getest voor gebruik in het RP2-kanaal. Het signaal voor IgG in het RP2-kanaal met SASB had niet hetzelfde dynamische bereik als met SAPE, maar het had nog steeds een geschikt bereik voor het meten van IgG-titers voor S, RBD en Nc(Figuur 8). Deze gegevens leidden tot het testen van verschillende RP1 IgM- en RP2 IgG-detectiereagenscombinaties, zoals hieronder beschreven.
Conversie naar dual reporter neutralisatie assay De serologische test met dubbele reporter werd omgezet in een neutralisatietest door een incubatiestap toe te voegen met ACE2 en kralen, voorafgaand aan het toevoegen van het serummonster. Een 2-voudige verdunningsreeks ace2 vanaf 16 μg/ml werd gebruikt en vervolgens getest met sets van 11 monsters en gestripte sera zoals hierboven beschreven. Daarnaast werden 3 verschillende combinaties van RP1 IgM en RP2 IgG detectie antilichaam mixen getest op een set van 11 monsters en gestripte serum controles. De uiteindelijke combinaties en reagensconcentraties die optimaal zijn, zijn vermeld in tabel 1.
Voor IgG-detectie werd de biotine anti-humane IgG / SASB die werd gebruikt in de oorspronkelijke single reporter-test getest samen met een andere anti-IgG geconjugeerd aan de BV reporter-kleurstof. Terwijl de BV-conjugaat hoge RP2 MFI-signalen had, varieerde de MFI-signaalintensiteit voor IgG-titer over de ACE2-titraties(Figuur 9A,C, E). De biotine anti-humaan IgG/SASB-combinatie had een consistentere MFI-signaalafname over de ACE2-titratie in vergelijking met het BV-conjugaat, wat een dosisrespons aantoont, hoewel de MFI-niveaus lager waren. De signaalfluctuatie door de BV-conjugaat over ACE2-concentraties interfereerde ook met het bepalen van de procentuele remming door ACE2 over het bereik van IgG-titers in vergelijking met de biotine anti-humane IgG / SASB-combinatie (Figuur 9B,D, F). Monsters met lage MFI-signalen, zoals het DFSO 3-monster, hebben geen titers die hoog genoeg zijn om de prestaties van deze reagentia te evalueren of de IgG-neutraliserende capaciteit te meten.
Voor het bepalen van IgM-titers in het RP1-kanaal werd een PE-geconjugeerde anti-IgM vergeleken met een anti-humaan IgM geconjugeerd aan de DyLight 549 reporterkleurstof (DL 549; excitatie bij 562 nm en emissie bij 576 nm) bij de concentraties vermeld in tabel 1. Van deze twee reagentia vertoonde de PE anti-IgM hogere MFI's dan die gegenereerd door DL 549 anti-humaan IgM voor de geteste monsters(Figuur 9A,C, E). De IgM-controlekraal die de toevoeging van deze reagentia meet, had verschillende gemiddelde MFI's van ≈ 17.000 voor de PE-anti-IgM en 2.723 voor de DL 549-conjugaat. Zelfs met deze verschillen was de impact van de verschillende ACE2-concentraties op MFI meetbaar met het DL 549-conjugaat. Voor het bepalen van ACE2 procent remming van IgM binding was er een klein maar onbeduidend verschil tussen de twee IgM detectiereagentia(Figuur 9B,D,F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Combinatie</td>
			<td rowspan="2">Verslaggever</td>
			<td colspan="2">Eindconcentratie in put (μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotine-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sasb</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Briljant Violet 421 Anti-Human IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotine-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sasb</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Lijst van geteste RP1- en RP2-reporterkleurstofcombinaties. Verschillende RP1- en RP2-reporterkleurstoffen werden geëvalueerd voor het meten van IgG- en IgM-titers. De drie hierboven getoonde combinaties werden getest bij verschillende RP1-detectiemodi en voor optimalisatie van de neutralisatietest. Voor RP2-combinaties met SASB worden concentraties voor het gebiotinyleerde detectieantilichaam en SASB weergegeven. *Eindconcentratie vertegenwoordigt de uiteindelijke concentratie in de reactieput.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Figuur 1: Stroomdiagram met de belangrijkste stappen van het testprotocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Figuur 2: Bevestiging van de antigeenkoppeling. Antigenen werden gekoppeld aan 100, 10 en 1 pmol/106 kralen. Voor S- en RBD-antigenen werd konijn-anti-S-sera gebruikt en gedetecteerd met PE-anti-konijn IgG. Voor Nc werd een Eiwit G-gezuiverd konijn polyklonaal anti-Nc gebruikt. De titratiecurven voor kralen in combinatie met 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) en 100 pmol Nc (C) worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Figuur 3: Optimalisatie van serumverdunning met verschillende antigeenkoppelingsniveaus. Serummonsters die hoge, gemiddelde, lage en negatieve monsters vertegenwoordigden, werden getest met de verschillende pmolantigeen/10 6-kraalkoppelingen. Een 4-voudige serumtitratie werd getest met een multiplexmengsel van antigeen-gekoppelde kralen met behulp van het testprotocol beschreven in rubriek 5. De MFI-waarden van de titratiecurven voor S (A), RBD (B) en Nc (C) worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Figuur 4: Bepaling van de optimale serumverdunning en detectie van de reagensconcentratie. Acht serummonsters, waaronder negatieve patiënten (2 monsters) en laag- tot hoog-positief (6 monsters), werden getest op aanvullende serumverdunningen met drie verschillende detectiereagensconcentraties. De MFI-resultaten worden weergegeven voor S (A), RBD (B) en Nc (C). Op basis van deze en andere gegevens (niet getoond) werd een monsterverdunning van 1:2.000 en een biotinedetectieantilichaamconcentratie van 0,62 μg/ml geselecteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Figuur 5: Optimalisatie van single reporter neutralization assay. Modificatie van de serologische test van de enkele reporter naar een neutraliserende antilichaamdetectietest werd uitgevoerd door een incubatiestap toe te voegen met ACE2 als concurrent, zoals beschreven in sectie 6. Een set van 11 monsters, variërend van laag- tot hoog-positieve titersera, en een IgG-gestreept serummonster werden getest met een tweevoudige verdunningsreeks ace2 vanaf 4 μg / ml, met behulp van standaard testomstandigheden. Over dit bereik van ACE2-concentraties kan een afname van MFI worden gezien bij verhoogde ACE2 voor S (A) en RBD (B), maar niet voor Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Figuur 6: Procentuele remming van het signaal met ACE2. Het percentage restsignalen voor de set van 11 monsters (uit figuur 4)wordt getoond. Voor elk monster, ongeacht de IgG-titer, werd een maximale afname van ≥30% MFI-signaal bereikt voor S (A) en RBD (B) bij de hoogste ACE2-concentratie. Voor het Nc-antigeen (C) was er geen significante remming van het signaal met enige hoeveelheid ACE2 getest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Figuur 7: Test van DyLight 405 anti-IgM als RP2 IgM detectiereagens. Een set van 11 monsters en IgG-gestripte sera werden gebruikt om DL 405-geconjugeerde anti-IgM te testen als een RP2-detectiereagens. De RP2 IgM MFI-signalen voor S(A),RBD(B)en Nc(C)worden weergegeven. Het hoogste MFI-signaal voor elk antigeen met een monster was ongeveer 140 MFI-eenheden voor RBD met monster H (B). Zelfs het signaal op de IgM-controleparelset was minder dan 1.000 MFI in het RP2-kanaal over het hele antilichaamtiterbereik en vertoonde niet het verhoogde dynamische bereik dat werd waargenomen met het PE-anti-IgM-detectieantilichaam in het RP1-kanaal(D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Figuur 8: Optimalisatie van SASB als RP2 reporter met Biotine anti-IgG. Een set van 11 monsters en IgG-gestripte sera werden gebruikt om een verdunningsreeks SASB te testen met de standaard 0,62 μg / ml biotine anti-IgG. De resulterende IgG MFI's in het RP2-kanaal voor S (A), RBD (B) en Nc (C) worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Figuur 9: Vergelijking van drie verschillende combinaties van RP1 IgM en RP1 IgG detectiemixen. Drie verschillende detectie antilichaammengsels werden getest op 11 monsters en IgG-gestripte sera. De gebruikte combinaties en eindconcentraties zijn beschreven in tabel 1. Alle monsters werden getest met een 2-voudige ACE2-verdunning, beginnend bij 16 μg / ml. Gegevens voor monsters bij DFSO van 3, 12 en 30 dagen worden getoond. De MFI-signalen voor RP1 IgM (oranje) en RP2 IgG (blauw) worden weergegeven in A (DFSO 3), C (DFSO 12) en E (DFSO 30). De resterende ACE2 procent MFI's worden weergegeven in B (DFSO 3), D (DFSO 12) en F (DFSO 30). Signalen die een daling van >30% vertegenwoordigen in vergelijking met geen ACE2-besturingselementen worden lichtgroen gemarkeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Voor zover wij weten, is dit het eerste voorbeeld van een op kralen gebaseerd multiplexingprotocol dat twee reportersignalen gebruikt om tegelijkertijd twee resultaten per analyt te meten. Met deze techniek kan de gebruiker antigeenspecifieke IgM en IgG tegelijkertijd meten, met minder monster en een kortere tijd tot resultaten. Hoewel deze dual reporter-methode specifiek is voor antilichaamisotyping, kan deze worden aangepast om andere analytparen te meten, zoals post-translationele modificaties of vrije versus gebonden medicijnvormen.Vandaag demonstreren we onze procedure met Dr. Steve Angeloni, een senior field application scientist voor Luminex Corporation. Om te beginnen met de serologische test van dual reporter IgG en IgM, bereidt u de vereiste multiplexkraalmengsels van de individuele paarkraal en controleert u de kraalvoorraden in een concentratie van één keer 10 tot de zes kralen per milliliter. Verdun vervolgens de serummonsters 100-voudig door 10 microliter serum toe te voegen aan 990 microliter PBS-TBN-buffer en verdun de monsters vervolgens nog eens tienvoudig door 20 microliter van de 1:100 verdunning toe te voegen aan 180 microliter PBS-TBN.Wanneer de kralenmengsels en serummonsters klaar zijn, voegt u 50 microliter van de multiplexkraalmengsels toe aan de toegewezen putjes van een 96-well niet-bindende microtiterplaat en voegt u vervolgens 50 microliter van de verdunde serummonsters toe aan de juiste putjes. Zodra alle monsters zijn toegevoegd, bedekt u de plaat met een microplaatfolieafdichting en incubeert u gedurende 15 minuten op een verwarmde platenschudder bij 37 graden Celsius. Scheid vervolgens de kralen van het reactiemengsel door de plaat gedurende twee minuten op een magnetische platenscheider te plaatsen.Houd de plaat op de magneet, verwijder de folieafdichting. Keer vervolgens de plaat voorzichtig om over een afvalcontainer en veeg het supernatant voorzichtig uit de putten. Terwijl u de plaat nog steeds op de magneet houdt, dep u de plaat op absorberend papier.Om de reactieputten te wassen, verwijdert u de plaat van de plaatmagneet en voegt u 150 microliter PBS-TBN toe aan elke put. Bedek de plaat met een verse folieafdichting en incubeer gedurende twee minuten op de verwarmde shaker voordat u deze nog twee minuten terug op de plaatmagneet plaatst. Terwijl u de plaat op de magneet houdt, keert u de plaat om om het supernatant weg te gooien en det u de plaat op absorberend papier.Verwijder na de tweede PBS-TBN-was de plaat van de magneet en voeg 100 microliter vers detectiereagensmengsel toe aan elke put. Nadat u de plaat hebt bedekt met een microplaatfolieafdichting, plaatst u deze gedurende 15 minuten op een verwarmde platenschudder en vervolgens gedurende twee minuten op een magnetische platenscheider. Terwijl de plaat op de magneet zit, gooit u het detectiereagensmengsel weg door de plaat om te keren over een afvalcontainer en deze op absorberend papier te devlekken.Was de reactieputten met PBS-TBN tweemaal zoals eerder aangetoond en verwijder vervolgens de plaat van de magneet. Voeg 100 microliter PBS-TBN toe aan elke put, bedek de plaat met folieafdichting en schud gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder de folieafdichting en ga verder met het aflezen van 50 microliter van het monster uit elke put in de stroomanalysator.Als u de plaat wilt lezen, selecteert u het vervolgkeuzemenu in de linkerbovenhoek, navigeert u naar Plaatconfiguratie, laadt u de eerder geconfigureerde plaat en selecteert u Plaat uitvoeren. Werp de plaatdrager uit door het pictogram Uitwerpen te selecteren, laad de plaat vervolgens op de plaatdrager en selecteer het pictogram Intrekken om de plaatdrager in te trekken. Zodra de plaatdrager zich in de analyzer heeft uitgestrekken, selecteert u het pictogram Uitvoeren om de plaat te lezen.Voeg voor de dual reporter neutralisatietest 50 microliter van de multiplexkraalmengsels toe aan toegewezen putten van een niet-bindende microtiterplaat met 96 putten, voeg vervolgens 25 microliter van twee microgram per milliliter ACE2 toe aan elke put en bedekt de plaat met een folieafdichting. Voeg na een incubatie van twee minuten op een verwarmde platenschudder 25 microliter van 1:500 serumverdunningen toe aan de toegewezen putjes. Zodra alle monsters zijn toegevoegd, voert u de incubatie-, was-, detectie- en analysestappen uit zoals eerder aangetoond voor de serologische test.Een test van anti-IgM geconjugeerd aan de DyLight 405 reporter kleurstof met behulp van serummonsters binnen vijf tot 60 dagen na het begin van de symptomen en een IgG strip serummonster produceerde geen hoog signaal voor het spike-antigeen. Voor monsters met een hoge IgM-gemiddelde fluorescentie-intensiteit werden de hoogste signalen gezien voor het receptorbindende domein en nucleocapside antigenen. Hoewel de IgM-titer in sommige monsters verhoogd had moeten zijn, waren de waargenomen intensiteitsniveaus van gemiddelde fluorescentie niet hoger dan 140 MFI-eenheden.Bovendien ontbrak het de controlekraal voor IgM aan een significant dynamisch bereik voor de mediane fluorescentie-intensiteit bij gebruik van DyLight 405 geconjugeerd aan anti-IgM in vergelijking met een fycoerythrin met het label anti-IgM in dezelfde concentratie. Voor IgG-detectie had het briljante violette conjugaat hogere mediane fluorescentie-intensiteitssignalen dan het streptavidin-conjugaat van fluorfore Super Bright 436. De signaalintensiteit voor het briljante violette geconjugeerde varieerde echter over de ACE2-titraties.Deze signaalfluctuatie door het briljante violette geconjugeerde over ACE2-concentraties interfereerde ook met het bepalen van de procentuele remming door ACE2 over het bereik van IgG-titers. Voor IgM-detectie vertoonde het fycoerythrin anti-IgM hogere signalen dan die gegenereerd door DyLight 549 anti-humaan IgM. Bij het bepalen van ACE2 procent remming van IgM binding, was er een klein maar onbeduidend verschil tussen de twee IgM detectiereagentia.Dus een van de belangrijkste stappen in de procedure is om uw multiplexkraalmix van uw individuele kralenvoorraden te bereiden en ervoor te zorgen dat u dat correct doet. Deze procedure kan dus ook worden gebruikt om de werkzaamheid van vaccins te meten en de immuunresponsen op andere pathogenen te monitoren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Kraal gebaseerd Multiplex Assay voor analyse van Tear Cytokine profielen

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Efficiënte SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Speeksel diagnostische strategie met behulp van Open-Source Pipetteerrobots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Gepseudotypeerde virussen als moleculair hulpmiddel om humorale immuunresponsen tegen SARS-CoV-2 te volgen via neutralisatietest

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Detectie van rabiës IgG- en IgM-antilichamen met behulp van de Rabiës Indirect Fluorescerende Antilichaamtest

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...