Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Ce rapport a été financé par Luminex Corporation (Austin, TX). Les auteurs remercient Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) pour son aide à l’édition scientifique.

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	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni et Sherry Dunbar sont des employés de Luminex Corporation qui produit certains des réactifs et des instruments utilisés dans cette étude. La publication en libre accès de cet article a été sponsorisée par Luminex Corporation

Cette étude a élargi la fonctionnalité d’un test de microsphère fluorescente multiplexe, 3Flex, qui évalue qualitativement la réponse des IgG à l’infection par le SRAS-CoV-21. Alors que de nombreux tests sérologiques pour COVID-19 détectent un seul antigène, ce test évalue simultanément les antigènes S, RBD et Nc, et comprend un contrôle interne de l’isotype d’anticorps7. De plus, l’ACE2 est utilisé comme indicateur pour détecter les titres d’anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2.
Les tests multi-antigènes pourraient être particulièrement utiles à l’avenir pour discriminer les réponses immunitaires entre les personnes infectées et vaccinées. Avec le SARS-CoV-2, si seuls les anticorps S et RBD sont évalués, il serait impossible de discerner si cela est dû à une infection passée ou à une réponse vaccinale anticorps. Aucun des vaccins actuellement utilisés ne cible l’antigène Nc, de sorte qu’en évaluant les antigènes S/RBD et Nc, il est possible de distinguer une infection virale passée (Nc- et S/RBD-positive) d’une réponse vaccinale (S/RBD-positive uniquement; Nc-négatif).
Dans la présente étude, les essais sérologiques et de neutralisation 3Flex (sections 5 et 6) ont été transférés sur un nouvel instrument d’analyse de flux à double rapporteur (sections 7 et 8). Les protocoles d’immunodosage typiques pour les tests multiplex à base de billes sont similaires aux protocoles ELISA standard, suivant des étapes comparables pour l’incubation de l’échantillon, l’incubation des anticorps de détection / rapporteurs et l’analyse des résultats8. Des études antérieures ont également démontré comment les tests ELISA standard peuvent être transférés sur une plate-forme de multiplexage à base deperles 9.
Les protocoles d’essai pourraient être transférés de manière transparente de l’instrument de rapporteur unique prédécesseur au nouveau système de rapporteur double, comme le montrent les résultats obtenus pour les échantillons d’essai et les contrôles(figure 4 et figure 5). Dans le test sérologique, tous les échantillons sériques positifs ont démontré une diminution caractéristique du signal sensible à la dose correspondant à la fois à une dilution plus élevée de l’échantillon et à une concentration d’anticorps de détection plus faible, tandis que les signaux pour les échantillons négatifs sont restés aux niveaux de fond. De même, pour le test de neutralisation, la diminution des signaux pour S et RBD, mais pas Nc, correspondait à des concentrations croissantes du concurrent ACE2, tandis que le sérum dépouillé d’IgG était beaucoup moins affecté par l’ajout d’ACE2. La pré-incubation des billes avec ACE2 pendant 2 minutes avant l’ajout de l’échantillon de sérum (comme décrit dans les rubriques 6 et 8), a également été comparée à la combinaison des perles avec ACE2 et sérum en même temps et a produit peu de différence dans les résultats (données non montrées). Cependant, comme les résultats obtenus avec les billes plus l’étape de pré-incubation ACE2 étaient plus cohérents, c’était la procédure finale adoptée pour le protocole de test de neutralisation (sections 6 et 8).
Étant donné que le système de rapporteur double intègre un deuxième canal rapporteur fluorescent, les deux essais ont été convertis en essais d’isotypage pour mesurer simultanément les réponses IgG et IgM. La fonctionnalité de double rapporteur de l’analyseur de débit permet de présager des signaux fluorescents à partir de deux réactifs de détection de rapporteur pour chaque analyte dans le multiplex pour chaque échantillon, doublant ainsi les données générées par échantillon dans un essai. Pour le développement et l’optimisation des protocoles de test à double rapporteur, plusieurs colorants rapporteurs et anticorps de détection disponibles dans le commerce ont été évalués pour le nouveau canal RP2(figure 7 et figure 8)afin de déterminer la ou les meilleures options disponibles. L’anticorps anti-IgM conjugué avec le colorant rapporteur DL 405 n’a pas bien fonctionné dans le canal RP2 (Figure 7), de sorte que la biotine anti-IgG avec SASB a ensuite été évaluée pour détection dans le canal RP2 (Figure 8). Trois combinaisons de réactifs de détection RP1 et RP2 ont été comparées dans le test de neutralisation à double rapporteur(tableau 1 et figure 9)afin de déterminer les combinaisons les plus performantes pour la détection simultanée d’anticorps neutralisants IgG et IgM. Bien qu’il y ait eu des différences significatives dans l’intensité du signal entre le canal RP1 utilisant PE-anti IgM et le canal RP2 utilisant DL 549 anti-IgM, il n’y avait pas de différence significative dans la mesure du pourcentage d’inhibition de liaison par ACE2.
Plusieurs limites à la méthode actuelle et à la présente étude sont reconnues. Tout d’abord, les échantillons testés et utilisés dans le développement et l’optimisation de la méthode ont été limités à des ensembles de 8 à 11 échantillons. D’autres échantillons seront testés dans le cadre d’études approfondies pour vérifier que la méthode est entièrement optimisée. Deuxièmement, un nombre limité de fluorophores rapporteurs et de paires de rapporteurs ont été testés. Des tests supplémentaires de tous les rapporteurs disponibles dans toutes les combinaisons possibles détermineront quels réactifs peuvent être utilisés avec succès dans cette méthode. L’anticorps anti-IgG conjugué à la biotine était différent de l’anticorps anti-IgG conjugué au rapporteur BV 421. Ainsi, bien qu’il existe une variabilité de l’intensité du signal pour l’anti-IgG BV 421, elle pourrait être due à la spécificité de l’anticorps et non au colorant rapporteur. L’essai d’autres anticorps conjugués BV 421 disponibles peut identifier un autre anticorps qui fonctionnerait bien dans le canal RP2. Des études futures évalueront également la combinaison d’anti-IgM PE avec des IgG anti-humaines BV 421 pour la détection dans RP1 et RP2, respectivement. Enfin, même avec la capacité de double rapporteur de l’instrument, les essais sont limités à deux isotypes (deux paramètres) par réaction. Si des isotypes supplémentaires doivent être mesurés ou si un isotypage complet est souhaité, des réactions supplémentaires utilisant les deux mêmes canaux rapporteurs devront être exécutées dans des puits distincts.
La technologie de multiplexage à base de billes permet une conception de test rapide et flexible avec une mise en œuvre facile dans les flux de travail de laboratoire de routine3,4,10. Cette étude a démontré la facilité de transfert des tests sérologiques et de neutralisation 3Flex décrits précédemment pour le SARS-CoV-2 sur un système d’analyse de débit pour mesurer les IgG avec un seul rapporteur, ou avec une légère modification, mesurant simultanément les réponses IgG et IgM à l’aide de deux rapporteurs. L’option à double rapporteur présente des avantages évidents par rapport aux plates-formes de rapporteur unique, car elle peut fournir deux fois plus de données par échantillon, en utilisant la moitié du volume d’échantillon et la moitié du nombre de puits de réaction. Avec les colorants rapporteurs et les anticorps de détection appropriés, les tests d’isotypage peuvent être facilement développés et effectués sur l’instrument d’analyse de flux à double rapporteur.

La pandémie de COVID-19 a souligné l’importance de pouvoir développer et mettre en œuvre rapidement des tests sérologiques rapides, à haut débit et très performants qui peuvent être utilisés pour le diagnostic et la surveillance de nouveaux agents pathogènes tels que le SRAS-CoV-2. Les tests sérologiques multiplex peuvent être extrêmement utiles en cas de pandémie, car ils peuvent analyser simultanément les anticorps dirigés contre plusieurs antigènes, ce qui permet une large couverture des agents pathogènes et des contrôles de la variabilité de l’organisme et de la réponse de l’hôte à l’infection. Le développement d’un test multiplex à base de billes fluorescentes, le SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), qui peut détecter les anticorps dirigés contre la protéine spike (S), le domaine de liaison aux récepteurs (RBD) de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE2) et la nucléocapside (Nc) du SARS-CoV-2 a récemment été rapporté1. Il a été démontré que 3Flex avait des performances comparables à celles d’un test de référence sars-CoV-2 IgG pour le sérum obtenu à ≥21 jours après l’apparition des symptômes, mais présentait une sensibilité plus élevée avec des échantillons prélevés à ≤5 jours après l’apparition des symptômes. De plus, l’inhibition de la liaison des anticorps a été démontrée pour les antigènes S et RBD à l’aide d’ACE2 soluble dans un format de test de neutralisation. La technologie à base de billes multiplex a été largement adoptée comme une technologie éprouvée pour les tests sérologiques multiplex et présente des avantages distincts pour le dépistage à grande échelle, notamment un court délai d’accès aux résultats, de petits échantillons et une main-d’œuvre réduite2,3,4.
Récemment, un nouvel instrument d’analyse de débit est devenu disponible qui offre la même capacité de haut niveau et à haut débit du système démontrée dans les travauxprécédents 1, mais avec l’avantage supplémentaire de deux canaux de rapporteur. La capacité de mesurer deux signaux rapporteurs fluorescents dans une seule réaction permet d’évaluer deux résultats par analyte pour chaque échantillon et est idéale pour les applications d’isotypage, qui doivent généralement être effectuées dans des puits de réaction distincts5. La capacité de double rapporteur fournit deux fois plus de données pour chaque échantillon dans deux fois moins de puits de réaction avec la moitié du volume d’échantillon requis, et présente donc un net avantage sur les systèmes de rapporteur unique. Cette étude détaille le protocole de dosage sérologique standard et décrit l’adaptation à un test de neutralisation. De plus, le présent rapport décrit la conversion du test rapporteur unique en un essai sérologique à double rapporteur et, par la suite, un essai de neutralisation à double rapporteur, afin de mesurer simultanément les anticorps neutralisants des isotypes IgG et IgM contre les antigènes SARS-CoV-2 S, RBD et Nc. Un aperçu visuel du protocole d’essai est fourni à la figure 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

La pandémie de COVID-19 a souligné la nécessité de méthodes rapides à haut débit pour la détection sérologique sensible et spécifique de l’infection par de nouveaux agents pathogènes, tels que le SARS-CoV-2. Les tests sérologiques multiplex peuvent être particulièrement utiles car ils peuvent analyser simultanément les anticorps dirigés contre plusieurs antigènes, ce qui optimise la couverture des agents pathogènes et contrôle la variabilité de l’organisme et de la réponse individuelle de l’hôte. Nous décrivons ici un test basé sur la microsphère fluorescente 3-plex IgG 3-2 du SRAS-CoV-2 qui peut détecter à la fois les anticorps IgM et IgG dirigés contre trois antigènes majeurs du SARS-CoV-2 : la protéine spike (S), l’enzyme de conversion de l’angiotensine de pointe (ACE2) domaine de liaison aux récepteurs (RBD) et la nucléocapside (Nc). Il a été démontré que le test avait des performances comparables à celles d’un test de référence du SRAS-CoV-2 pour les IgG dans le sérum obtenu à ≥21 jours après l’apparition des symptômes, mais présentait une sensibilité plus élevée avec des échantillons prélevés à ≤5 jours après l’apparition des symptômes. De plus, en utilisant l’ACE2 soluble dans un format de test de neutralisation, l’inhibition de la liaison aux anticorps a été démontrée pour S et RBD.

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A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un système d’analyse de flux pour les essais multiplexés à base de billes qui fournit une lecture à deux rapporteurs a été utilisé pour le développement de tests sérologiques et de neutralisation des anticorps multiplex qui peuvent mesurer simultanément les anticorps IgG et IgM neutralisants pour le SARS-CoV-2.

Un test de neutralisation rapide et multiplex à double rapporteur IgG et IgM SARS-CoV-2 pour un système d’analyse de débit à base de billes multiplexées

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

À notre connaissance, il s’agit du premier exemple de protocole de multiplexage à base de billes qui utilise deux signaux rapporteurs pour mesurer simultanément deux résultats par analyte. Cette technique permet à l’utilisateur de mesurer les IgM et les IgG spécifiques à l’antigène en même temps, avec moins d’échantillon et un délai de résultats plus court. Bien que cette méthode à double rapporteur soit spécifique à l’isotypage des anticorps, elle pourrait être adaptée pour mesurer d’autres paires d’analytes, telles que des modifications post-traductionnelles ou des formes médicamenteuses libres ou liées.Nous avons fait la démonstration de notre procédure aujourd’hui avec le Dr Steve Angeloni, un scientifique principal d’application sur le terrain pour Luminex Corporation. Pour commencer le double test sérologique IgG et IgM, préparez les mélanges de billes multiplex requis à partir des billes de couple individuelles et contrôlez les stocks de perles à une concentration d’une fois 10 à six perles par millilitre. Ensuite, diluez les échantillons de sérum 100 fois en ajoutant 10 microlitres de sérum à 990 microlitres de tampon PBS-TBN, puis diluez les échantillons encore dix fois en ajoutant 20 microlitres de la dilution 1:100 à 180 microlitres de PBS-TBN.Lorsque les mélanges de billes et les échantillons de sérum sont prêts, ajoutez 50 microlitres des mélanges de billes multiplex aux puits assignés d’une plaque de microtitrage non contraignante de 96 puits, puis ajoutez 50 microlitres des échantillons de sérum dilués aux puits appropriés. Une fois que tous les échantillons ont été ajoutés, recouvrir la plaque d’un joint en feuille de microplaque et incuber sur un agitateur à plaque chauffante à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, séparez les billes du mélange réactionnel en plaçant la plaque sur un séparateur de plaques magnétiques pendant deux minutes.En gardant la plaque sur l’aimant, retirez le joint d’aluminium. Ensuite, inversez soigneusement la plaque sur un conteneur à déchets et faites glisser doucement le surnageant hors des puits. Tout en maintenant la plaque sur l’aimant, épongez la plaque sur du papier absorbant.Pour laver les puits de réaction, retirez la plaque de l’aimant de la plaque et ajoutez 150 microlitres de PBS-TBN à chaque puits. Couvrez la plaque avec un joint d’aluminium frais et incubez sur le shaker chauffé pendant deux minutes avant de le replacer sur l’aimant de la plaque pendant deux minutes supplémentaires. Tout en gardant la plaque sur l’aimant, inversez la plaque pour jeter le surnageant et épongez la plaque sur du papier absorbant.Après le deuxième lavage PBS-TBN, retirez la plaque de l’aimant et ajoutez 100 microlitres de mélange de réactif de détection frais à chaque puits. Après avoir recouvert la plaque d’un joint en feuille de microplaque, placez-la sur un agitateur à plaque chauffante pendant 15 minutes, puis sur un séparateur de plaque magnétique pendant deux minutes. Pendant que la plaque est sur l’aimant, jetez le mélange de réactif de détection en inversant la plaque sur un récipient à déchets et en l’épongeant sur du papier absorbant.Lavez les puits de réaction avec pbS-TBN deux fois comme démontré précédemment, puis retirez la plaque de l’aimant. Ajouter 100 microlitres de PBS-TBN à chaque puits, puis couvrir la plaque avec un joint de feuille et agiter pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Retirez le joint d’étanchéité et procédez à la lecture de 50 microlitres de l’échantillon de chaque puits de l’analyseur de débit.Pour lire la plaque, sélectionnez le menu déroulant dans le coin supérieur gauche, accédez à Configuration de la plaque, chargez la plaque précédemment configurée, puis sélectionnez Exécuter la plaque. Éjectez le support de plaque en sélectionnant l’icône Éjecter, puis chargez la plaque sur le support de plaque et sélectionnez l’icône Rétracter pour rétracter le support de plaque. Une fois que le support de plaque s’est prolongé dans l’analyseur, sélectionnez l’icône Exécuter pour commencer à lire la plaque.Pour le test de neutralisation à double rapporteur, ajoutez 50 microlitres des mélanges de billes multiplex aux puits assignés d’une plaque de microtitrage non contraignante de 96 puits, puis ajoutez 25 microlitres de deux microgrammes par millilitre ACE2 à chaque puits et recouvrez la plaque d’un joint d’aluminium. Après une incubation de deux minutes sur un agitateur à plaque chauffante, ajouter 25 microlitres de dilutions sériques de 1:500 aux puits assignés. Une fois que tous les échantillons ont été ajoutés, effectuez les étapes d’incubation, de lavage, de détection et d’analyse comme démontré précédemment pour le test sérologique.Un test d’anti-IgM conjugué au colorant rapporteur DyLight 405 utilisant des échantillons de sérum dans les cinq à 60 jours suivant l’apparition des symptômes et un échantillon de sérum de bande d’IgG n’a pas produit de signal élevé pour l’antigène de pointe. Pour les échantillons avec une intensité de fluorescence moyenne IgM élevée, les signaux les plus élevés ont été observés pour le domaine de liaison au récepteur et les antigènes nucléocapsides. Bien que le titre d’IgM aurait dû être élevé dans certains échantillons, les niveaux d’intensité de fluorescence moyenne observés ne dépassaient pas 140 unités MFI.De plus, la bille témoin pour les IgM n’avait pas de plage dynamique significative pour l’intensité médiane de fluorescence lors de l’utilisation de DyLight 405 conjugué à des anti-IgM par rapport à une phycoérythrine marquée anti-IgM à la même concentration. Pour la détection des IgG, le conjugué violet brillant avait des signaux d’intensité de fluorescence médiane plus élevés que le conjugué de streptavidine du fluorphore Super Bright 436. Cependant, l’intensité du signal pour le conjugué violet brillant variait d’un titrage ACE2 à l’autre.Cette fluctuation du signal par le conjugué violet brillant à travers les concentrations d’ACE2 a également interféré avec la détermination du pourcentage d’inhibition par ACE2 dans la gamme des titres d’IgG. Pour la détection des IgM, les anti-IgM de phycoérythrine affichaient des signaux plus élevés que ceux générés par les IgM anti-humaines DyLight 549. Lors de la détermination de l’inhibition de l’ACE2 pour cent de la liaison aux IgM, il y avait une différence légère mais insignifiante entre les deux réactifs de détection des IgM.L’une des étapes les plus importantes de la procédure consiste donc à préparer votre mélange de billes multiplexes à partir de vos stocks de perles individuels et à vous assurer de le faire correctement. Ainsi, cette procédure peut également être utilisée pour mesurer l’efficacité des vaccins et surveiller les réponses immunitaires à d’autres agents pathogènes.

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Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imagerie vivante et quantification de l’infection virale chez des souris transgéniques K18 hACE2 à l’aide du SARS-CoV-2 recombinant exprimant le rapporteur

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Stratégie de diagnostic de la salive par PCR à transcriptase inverse quantitative efficace du SRAS-CoV-2 utilisant des robots de pipetage open source

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Détection simultanée de différentes classes d’anticorps dans un test sérologique multiplexé

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Virus pseudotypés en tant qu’outil moléculaire pour surveiller les réponses immunitaires humorales contre le SRAS-CoV-2 via un test de neutralisation

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Détection des anticorps antirabiques IgG et IgM à l’aide du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...