Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Dieser Bericht wurde von der Luminex Corporation (Austin, TX) finanziert. Die Autoren danken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) für die wissenschaftliche Unterstützung bei der Redaktion.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni und Sherry Dunbar sind Mitarbeiter der Luminex Corporation, die einige der Reagenzien und Instrumente herstellt, die in dieser Studie verwendet wurden. Die Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels wurde von der Luminex Corporation gesponsert

Diese Studie erweiterte die Funktionalität eines Multiplex-Fluoreszenz-Mikrosphärenassays, 3Flex, der die IgG-Reaktion auf eine Infektion mit SARS-CoV-21qualitativ bewertet. Während viele serologische Assays für COVID-19 ein einzelnes Antigen nachweisen, bewertet dieser Assay gleichzeitig S-, RBD- und Nc-Antigene und enthält eine interne Antikörper-Isotypkontrolle7. Darüber hinaus wird ACE2 als Indikator zum Nachweis neutralisierender Antikörpertiter gegen SARS-CoV-2 verwendet.
Multi-Antigen-Assays könnten in Zukunft besonders nützlich sein, um Immunantworten zwischen infizierten und geimpften Personen zu unterscheiden. Wenn bei SARS-CoV-2 nur S- und RBD-Antikörper ausgewertet werden, wäre es unmöglich zu erkennen, ob dies auf eine frühere Infektion oder auf eine Impfantikörperreaktion zurückzuführen ist. Keiner der derzeit verwendeten Impfstoffe zielt auf das Nc-Antigen ab, so dass es durch die Bewertung von S/RBD- und Nc-Antigenen möglich ist, vergangene Virusinfektionen (Nc- und S/RBD-positiv) von einer Impfreaktion (nur S/RBD-positiv; Nc-negativ).
In der aktuellen Studie wurden die serologischen und Neutralisationsassays 3Flex (Abschnitte 5 und 6) auf ein neues Dual-Reporter-Flow-Analysegerät (Abschnitte 7 und 8) übertragen. Typische Immunoassay-Protokolle für perlenbasierte Multiplex-Assays ähneln Standard-ELISA-Protokollen und folgen vergleichbaren Schritten für die Probeninkubation, die Nachweisantikörper-/Reporterinkubation und die Analyse der Ergebnisse8. Frühere Studien haben auch gezeigt, wie Standard-ELISA-Assays auf eine perlenbasierte Multiplexing-Plattform übertragen werden können9.
Die Assay-Protokolle konnten nahtlos vom Vorgänger-Einzel-Reporter-Instrument auf das neue Dual-Reporter-System übertragen werden, wie die Ergebnisse für die Testproben und Kontrollen zeigen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Im serologischen Assay zeigten alle positiven Serumproben eine charakteristische dosisabhängige Signalabnahme, die sowohl einer höheren Probenverdünnung als auch einer niedrigeren Antikörperkonzentration entsprach, während die Signale für die negativen Proben auf Hintergrundniveau blieben. In ähnlicher Weise entsprachen für den Neutralisationsassay abnehmende Signale für S und RBD, aber nicht Nc, steigenden Konzentrationen des ACE2-Konkurrenten, während das IgG-gestreifte Serum durch die Zugabe von ACE2 viel weniger beeinflusst wurde. Die Vorinkubation der Perlen mit ACE2 für 2 min vor der Zugabe der Serumprobe (wie in den Abschnitten 6 und 8 beschrieben) wurde auch mit der gleichzeitigen Kombination der Perlen mit ACE2 und Serum verglichen und führte zu geringen Unterschieden in den Ergebnissen (Daten nicht gezeigt). Da die mit den Perlen plus ACE2-Vorinkubationsschritt erzielten Ergebnisse jedoch konsistenter waren, war dies das endgültige Verfahren für das Neutralisationsassayprotokoll (Abschnitte 6 und 8).
Da das duale Reportersystem einen zweiten fluoreszierenden Reporterkanal enthält, wurden beide Assays in Isotypisierungsassays umgewandelt, um gleichzeitig IgG- und IgM-Reaktionen zu messen. Die Dual-Reporter-Funktionalität des Durchflussanalysators ermöglicht die Erfassung von fluoreszierenden Signalen von zwei Reporter-Detektionsreagenzien für jeden Analyten im Multiplex für jede Probe, wodurch die pro Probe in einem Assay generierten Daten effektiv verdoppelt werden. Für die Entwicklung und Optimierung der Dual-Reporter-Assay-Protokolle wurden mehrere kommerziell erhältliche Reporterfarbstoffe und Nachweisantikörper für den neuen RP2-Kanal (Abbildung 7 und Abbildung 8) evaluiert, um die besten verfügbaren Optionen zu bestimmen. Der mit dem DL 405-Reporterfarbstoff konjugierte Anti-IgM-Antikörper funktionierte im RP2-Kanal nicht gut (Abbildung 7), so dass Biotin-Anti-IgG mit SASB anschließend für den Nachweis im RP2-Kanal bewertet wurde (Abbildung 8). Drei Kombinationen von RP1- und RP2-Nachweisreagenzien wurden im Dual-Reporter-Neutralisationsassay (Tabelle 1 und Abbildung 9) verglichen, um die leistungsstärksten Kombinationen für den gleichzeitigen Nachweis von IgG- und IgM-neutralisierenden Antikörpern zu bestimmen. Während es signifikante Unterschiede in der Signalintensität zwischen dem RP1-Kanal mit PE-anti IgM und dem RP2-Kanal mit DL 549 anti-IgM gab, gab es keinen signifikanten Unterschied bei der Messung der prozentualen Bindungshemmung durch ACE2.
Mehrere Einschränkungen der aktuellen Methode und dieser Studie werden anerkannt. Zunächst wurden die getesteten und in der Methodenentwicklung und -optimierung verwendeten Proben auf Sätze von 8-11 Proben beschränkt. Weitere Proben werden in erweiterten Studien getestet, um zu überprüfen, ob die Methode vollständig optimiert ist. Zweitens wurde eine begrenzte Anzahl von Reporterfluorophoren und Reporterpaaren getestet. Weitere Tests aller verfügbaren Reporter in allen möglichen Kombinationen werden bestimmen, welche Reagenzien bei dieser Methode erfolgreich eingesetzt werden können. Der mit Biotin konjugierte Anti-IgG-Antikörper unterschied sich von dem Anti-IgG-Antikörper, der mit dem BV 421-Reporter konjugiert wurde. Obwohl also variabel in der Signalintensität für das BV 421 Anti-IgG existierte, könnte dies auf die Spezifität des Antikörpers zurückzuführen sein und nicht mit dem Reporterfarbstoff zusammenhängen. Das Testen anderer verfügbarer BV 421-konjugierter Antikörper kann einen anderen Antikörper identifizieren, der im RP2-Kanal gut funktionieren würde. Zukünftige Studien werden auch die Kombination von PE-Anti-IgM mit BV 421 Anti-Human-IgG für den Nachweis in RP1 bzw. RP2 bewerten. Schließlich sind die Assays selbst bei der Dual-Reporter-Fähigkeit des Instruments auf zwei Isotypen (zwei Parameter) pro Reaktion beschränkt. Wenn zusätzliche Isotypen gemessen werden sollen oder eine vollständige Isotypisierung gewünscht wird, müssten zusätzliche Reaktionen mit den gleichen zwei Reporterkanälen in separaten Bohrkanälen durchgeführt werden.
Die perlenbasierte Multiplexing-Technologie ermöglicht ein schnelles und flexibles Assay-Design mit einfacher Implementierung in routinemäßige Laborabläufe3,4,10. Diese Studie zeigte die Einfache Übertragung der zuvor beschriebenen serologischen und Neutralisationsassays von 3Flex für SARS-CoV-2 auf ein Strömungsanalysesystem zur Messung von IgG mit einem einzigen Reporter oder mit leichter Modifikation, wobei gleichzeitig sowohl IgG- als auch IgM-Reaktionen mit zwei Reportern gemessen wurden. Die Dual-Reporter-Option hat klare Vorteile gegenüber Einzel-Reporter-Plattformen, da sie doppelt so viele Daten pro Probe liefern kann, wobei das halbe Probenvolumen und die Hälfte der Anzahl der Reaktionsbohrungen verwendet werden. Mit den entsprechenden Reporterfarbstoffen und Nachweisantikörpern können Isotypisierungsassays einfach entwickelt und auf dem Dual-Reporter-Flow-Analysegerät durchgeführt werden.

Die COVID-19-Pandemie hat die Bedeutung der schnellen Entwicklung und Implementierung schneller, leistungsstarker serologischer Tests mit hohem Durchsatz und derEntstehung unterstrichen, die zur Diagnose und Überwachung neuartiger Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 eingesetzt werden können. Multiplex-serologische Tests können in einer Pandemie äußerst nützlich sein, da sie gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene analysieren können, was eine breite Pathogenabdeckung und Kontrollen für die Variabilität im Organismus und die Reaktion des Wirts auf Infektionen ermöglicht. Die Entwicklung eines multiplex-fluoreszierenden Perlen-basierten Assays, des SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), der Antikörper gegen das Spike(S)-Protein, die Spike-Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) Rezeptor-bindende Domäne (RBD) und Nukleokapsid (Nc) von SARS-CoV-2 nachweisen kann1. 3Flex zeigte eine vergleichbare Leistung wie ein SarS-CoV-2-IgG-Referenzassay für Serum, das nach ≥21 Tagen nach Symptombeginn erhalten wurde, hatte jedoch eine höhere Empfindlichkeit mit Proben, die nach ≤5 Tagen nach Symptombeginn gesammelt wurden. Zusätzlich wurde die Hemmung der Antikörperbindung für S- und RBD-Antigene unter Verwendung von löslichem ACE2 in einem Neutralisationsassay-Format nachgewiesen. Die auf Multiplex-Perlen basierende Technologie wurde weithin als bewährte Technologie für serologische Multiplex-Tests eingesetzt und hat deutliche Vorteile für das großflächige Screening, einschließlich kurzer Zeit bis zu den Ergebnissen, geringem Probenbedarf und reduziertem Arbeitsaufwand2,3,4.
Vor kurzem ist ein neues Durchflussanalysegerät verfügbar, das die gleiche High-Plex-Hochdurchsatzfähigkeit des Systems bietet, die in früheren Arbeiten1demonstriert wurde, jedoch mit dem zusätzlichen Vorteil von zwei Reporterkanälen. Die Fähigkeit, zwei fluoreszierende Reportersignale in einer einzigen Reaktion zu messen, ermöglicht die Bewertung von zwei Ergebnissen pro Analyt für jede Probe und ist ideal für Isotypisierungsanwendungen, die typischerweise in separaten Reaktionsbohrungen durchgeführt werden müssen5. Die Dual-Reporter-Fähigkeit liefert doppelt so viele Daten für jede Probe in halb so vielen Reaktionsbohrungen mit der Hälfte des Probenvolumenbedarfs und hat damit einen klaren Vorteil gegenüber Einzel-Reporter-Systemen. Diese Studie beschreibt das serologische Standard-Assay-Protokoll und beschreibt die Anpassung an einen Neutralisationsassay. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht die Umwandlung des Einzelreporter-Assays in einen serologischen Dual-Reporter-Assay und anschließend in einen Dual-Reporter-Neutralisierungsassay, um gleichzeitig neutralisierende Antikörper sowohl der IgG- als auch der IgM-Isotypen gegen die SARS-CoV-2 S-, RBD- und Nc-Antigene zu messen. Eine visuelle Übersicht über das Assay-Protokoll finden Sie in Abbildung 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

Die COVID-19-Pandemie hat die Notwendigkeit schneller Hochdurchsatzmethoden für den sensitiven und spezifischen serologischen Nachweis von Infektionen mit neuartigen Krankheitserregern wie SARS-CoV-2 unterstrichen. Multiplex-serologische Tests können besonders nützlich sein, da sie gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene analysieren können, die die Pathogenabdeckung optimieren und die Variabilität im Organismus und die individuelle Wirtsreaktion steuern. Hier beschreiben wir einen SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluoreszierenden Mikrosphären-basierten Assay, der sowohl IgM- als auch IgG-Antikörper gegen drei wichtige SARS-CoV-2-Antigene nachweisen kann - das Spike(S)-Protein, die Spike-Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) und das Nukleokapsid (Nc). Es wurde gezeigt, dass der Assay eine vergleichbare Leistung wie ein SARS-CoV-2-Referenzassay für IgG im Serum aufweist, der nach ≥21 Tagen nach Symptombeginn erhalten wurde, aber eine höhere Empfindlichkeit mit Proben aufwies, die nach ≤5 Tagen nach Symptombeginn gesammelt wurden. Darüber hinaus wurde unter Verwendung von löslichem ACE2 in einem Neutralisationsassay-Format eine Hemmung der Antikörperbindung für S und RBD nachgewiesen.

Optimierung des Single Reporter Serological Assays. Die Kopplungsstrategie für alle SARS-CoV-2-Antigene wird in Cameron et al., 20201 und in Schritt 2.1 oben beschrieben. Die Strategie zur Kopplungsbestätigung wird in Schritt 2.3 oben beschrieben. Für eine effiziente Kopplung sollten die werte der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) signifikant höher sein als die negative Kontrollreaktion(en) ohne Serum/keine Antikörper und eine Dosisreaktion mit abnehmendem MFI-Signal mit abnehmenden Mengen an Nachweisreagenz aufweisen. MFIs von etwa 1.000 MFI-Einheiten oder mehr über Hintergrund-MFI weisen im Allgemeinen auf eine effiziente Proteinkopplung hin und sind abhängig von der Konzentration und Spezifität des verwendeten Nachweisreagenzes. Mit dieser Methode wurde die Bestätigung der S-, RBD- und Nc-Antigenkopplung für zwei Perlenlose getestet(Abbildung 2). Die MFI-Signale für alle Antigene waren signifikant höher als die Hintergrund-MFI und zeigten eine Dosisreaktion mit Titration der Nachweisreagenzien. Die Daten zeigten auch eine gute Reproduzierbarkeit der MFI-Werte zwischen den beiden verschiedenen Losen gekoppelter Perlen.
Die Optimierung des Einzelreporter-Assays wurde wie in Cameron, et al., 20201beschrieben durchgeführt. Jedes Antigen wurde bei unterschiedlichen Kopplungskonzentrationen mit unterschiedlichen Verdünnungen mehrerer Serumproben getestet, die hohe, mittlere, niedrige und negative Proben darstellen. Da der Assay IgG-Titer misst, wurde außerdem ein IgG-gestreiftes Serum als zusätzliche negative Probe verwendet. Die Ergebnisse einer repräsentativen Probenverdünnungsreihe mit unterschiedlichen Antigenkopplungsstufen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese erste Verdünnungsserie wurde mit einer festen Konzentration von Nachweisreagenzien getestet, um einen potenziellen Bereich repräsentativer antigenspezifischer und Hintergrund-MFI-Werte zu erhalten. Aus diesen Daten wurden zusätzliche Probenverdünnungsbereiche und Antigenkopplungswerte bestimmt und mit zusätzlichen Proben weiter getestet (Daten nicht gezeigt).
Als nächstes wurde die Konzentration des Nachweisreagenzes für die Verwendung mit den verschiedenen Serumverdünnungen und Antigenkopplungsstufen optimiert. Repräsentative Daten mit 6 positiven und 2 negativen Proben sind in Abbildung 4 dargestellt. Nach zusätzlichen Tests mit mehreren hundert negativen Prä-COVID-19-Serumproben wurden die endgültigen optimalen Antigenkopplungsniveaus und Nachweisregentkonzentrationen für das endgültige Assay-Protokoll ausgewählt, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
Umstellung auf einen einzigen Reporter-Neutralisationsassay Die Umwandlung des serologischen Einzelreporter-Assays in einen Neutralisationsassay wurde durch Zugabe eines Inkubationsschritts mit ACE2 (als konkurrierendes Reagenz) mit den Perlen vor der Zugabe der Serumprobe erreicht. Durch Titrieren der zugesetzten ACE2-Menge wurde eine Hemmung der IgG-Bindung an die S- und RBD-Antigene beobachtet, wie in Abbildung 5gezeigt. Während die 11 Patientenseren unterschiedliche IgG-Titer aufwiesen, zeigte jede eine signifikante Abnahme des MFI-Signals mit zunehmender ACE2-Konzentration. Wie erwartet, beeinflusst ACE2 nur die MFI-Signale von S und RBD, nicht aber das Nc-Antigen.
Das prozentuale Rest-MFI-Signal relativ zu 0 μg/ml ACE2 für alle Proben ist in Abbildung 6 dargestellt. Für die meisten Proben wurde ein Signalverlust >30% für S und RBD mit steigender ACE2-Konzentration beobachtet. Wie erwartet, gab es keinen Einfluss von ACE2 auf das Nc-Signal.
Umstellung auf einen dualen Reporter IgG und IgM serologischen Assay Für den Dual-Reporter-IgG- und IgM-Assay wurden die Standard-Single-Reporter-Assay-Bedingungen verwendet, um verschiedene Antikörper- und Reporter-Kombinationen für die beiden Reporterkanäle zu testen. Der RP1-Kanal ähnelt früheren Strömungsanalysegeräten mit detektion von "oranger" Fluoreszenz für Reporterfarbstoffe wie PE. Der zweite Kanal, RP2, verwendet einen violetten Anregungslaser, der zum Nachweis der "blauen" Fluoreszenz von Farbstoffen verwendet werden kann, die bei 402 nm mit Emissionsspektrenspitzen im Bereich von 421-441 nm angeregt werden.
Mehrere verschiedene anti-humane IgG- und IgM-Antikörperkombinationen wurden in verschiedenen Konzentrationen mit den in Abschnitt 6 beschriebenen Standard-2.000-fachen Probenverdünnungs- und Inkubationsbedingungen getestet. Ein erster Test von Anti-IgM, konjugiert mit dem DyLight 405 Reporterfarbstoff (DL 405; Anregung bei 400 nm und Emission bei 420 nm) für den RP2-Kanal wurde mit einem Satz von 11 PCR-positiven Proben mit DFSO im Bereich von 5 bis >60 Tagen und einer IgG-gestreiften Serumprobe durchgeführt. Dieses Detektionsreagenz erzeugte kein hohes Signal im RP2-Kanal, wie in Abbildung 7A,B, C dargestellt. Bei Proben mit dem hohen IgM RP2 MFI wurden die höchsten Signale für RBD und Nc beobachtet (Abbildung 7B,C). Während die IgM-Titer zu diesem Zeitpunkt in einigen Proben erhöht sein sollten, überschritten die beobachteten MFI-Werte mit dem IgM-Nachweisreagenz 140 MFI-Einheiten nicht. Darüber hinaus fehlte der Kontrollperle für IgM ein signifikanter Dynamikbereich für MFI, wenn DL 405 verwendet wurde, konjugiert mit Anti-IgM im Vergleich zu einem PE-markierten Anti-IgM RP1-Reporter, der bei den gleichen Konzentrationen verwendet wurde (Abbildung 7D).
Da kein geeignetes RP2-Reporter-markiertes Nachweisreagenz für IgM verfügbar war, wurde das ursprüngliche Biotin-Anti-IgG mit SASB für den Einsatz im RP2-Kanal getestet. Das Signal für IgG im RP2-Kanal mit SASB hatte nicht den gleichen Dynamikbereich wie bei SAPE, aber es hatte immer noch einen geeigneten Bereich zur Messung von IgG-Titern für S, RBD und Nc (Abbildung 8). Diese Daten führten zum Testen verschiedener RP1 IgM- und RP2 IgG-Erkennungsreagenzienkombinationen, wie unten beschrieben.
Umstellung auf Dual-Reporter-Neutralisationsassay Der serologische Dual-Reporter-Assay wurde in einen Neutralisationsassay umgewandelt, indem ein Inkubationsschritt mit ACE2 und Perlen hinzugefügt wurde, bevor die Serumprobe hinzugefügt wurde. Eine 2-fache Verdünnungsserie von ACE2 ab 16 μg/ml wurde verwendet und dann mit Sätzen von 11 Proben und entfernten Seren wie oben beschrieben getestet. Darüber hinaus wurden 3 verschiedene Kombinationen von RP1 IgM und RP2 IgG Nachweisantikörpermischungen an einem Satz von 11 Proben und entfernten Serumkontrollen getestet. Die endgültigen Kombinationen und Reagenzkonzentrationen, die als optimal bestimmt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Für den IgG-Nachweis wurde das Biotin-Anti-Human-IgG / SASB, das im ursprünglichen Einzelreporter-Assay verwendet wurde, zusammen mit einem anderen Anti-IgG getestet, das mit dem BV-Reporterfarbstoff konjugiert wurde. Während das BV-Konjugat hohe RP2-MFI-Signale aufweist, variierte die MFI-Signalintensität für den IgG-Titer über die ACE2-Titrationen hinweg (Abbildung 9A, C, E). Die Biotin-Anti-Human-IgG/SASB-Kombination hatte eine konsistentere MFI-Signalabnahme über die ACE2-Titration im Vergleich zum BV-Konjugat, was eine Dosisreaktion zeigte, obwohl die MFI-Spiegel niedriger waren. Die Signalfluktuation durch das BV-Konjugat über ACE2-Konzentrationen hinweg störte auch die Bestimmung der prozentualen Hemmung durch ACE2 im Bereich der IgG-Titer im Vergleich zur Biotin-Anti-Human-IgG/SASB-Kombination (Abbildung 9B, D , F). Proben mit niedrigen MFI-Signalen, wie die DFSO 3-Probe, haben nicht genügend Titer, um die Leistung dieser Reagenzien zu bewerten oder die IgG-Neutralisierungskapazität zu messen.
Zur Bestimmung von IgM-Titern im RP1-Kanal wurde ein PE-konjugiertes Anti-IgM mit einem anti-humanen IgM verglichen, das mit dem DyLight 549-Reporterfarbstoff (DL 549; Anregung bei 562 nm und Emission bei 576 nm) in den in Tabelle 1aufgeführten Konzentrationen konjugiert wurde. Von diesen beiden Reagenzien zeigte das PE-Anti-IgM höhere MFIs als die von DL 549 Anti-Human-IgM für die getesteten Proben erzeugten(Abbildung 9A,C, E). Die IgM-Kontrollperle, die die Zugabe dieser Reagenzien misst, hatte unterschiedliche durchschnittliche MFIs von ≈17.000 für das PE-Anti-IgM und 2.723 für das DL 549-Konjugat. Trotz dieser Unterschiede war der Einfluss der verschiedenen ACE2-Konzentrationen auf MFI mit dem DL 549-Konjugat messbar. Zur Bestimmung der ACE2-prozentigen Hemmung der IgM-Bindung gab es einen leichten, aber unbedeutenden Unterschied zwischen den beiden IgM-Nachweisreagenzien (Abbildung 9B, D, F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kombination</td>
			<td rowspan="2">Reporter</td>
			<td colspan="2">Endkonzentration im Bohrbrunnen (μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE Anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Brilliant Violet 421 Anti-Human IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der getesteten RP1- und RP2-Reporterfarbstoffkombinationen. Für die Messung von IgG- und IgM-Titern wurden mehrere verschiedene RP1- und RP2-Reporterfarbstoffe bewertet. Die drei oben gezeigten Kombinationen wurden in verschiedenen RP1-Detektionsmodi und zur Optimierung des Neutralisationsassays getestet. Für RP2-Kombinationen mit SASB werden Konzentrationen für den biotinylierten Nachweisantikörper und SASB gezeigt. *Die Endkonzentration stellt die Endkonzentration in der Reaktionsbohrung dar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm, in dem die wichtigsten Assay-Protokollschritte hervorgehoben werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Abbildung 2: Bestätigung der Antigenkopplung. Antigene wurden bei 100, 10 und 1 pmol/106 Perlen gekoppelt. Für S- und RBD-Antigene wurde Kaninchen-Anti-Seren verwendet und mit PE-Anti-Kaninchen-IgG nachgewiesen. Für Nc wurde ein Protein G-gereinigtes Kaninchen polyklonales Anti-Nc verwendet. Die Titrationskurven für Perlen gekoppelt mit 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) und 100 pmol Nc (C) sind dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Abbildung 3: Optimierung der Serumverdünnung mit verschiedenen Antigenkopplungsstufen. Serumproben, die hohe, mittlere, niedrige und negative Proben darstellen, wurden mit den verschiedenen pmol-Antigen/10 6-Perlenkupplungen getestet. Eine 4-fache Serumtitration wurde mit einer Multiplexmischung aus Antigen-gekoppelten Perlen unter Verwendung des in Abschnitt 5 beschriebenen Assay-Protokolls getestet. Die MFI-Werte der Titrationskurven für S (A), RBD (B) und Nc (C) werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Abbildung 4: Bestimmung der optimalen Serumverdünnung und Der Nachweisreagenzkonzentration. Acht Serumproben, darunter negative Patienten (2 Proben) und niedrig- bis hochpositive (6 Proben), wurden an zusätzlichen Serumverdünnungen mit drei verschiedenen Rektivkonzentrationen getestet. Die MFI-Ergebnisse werden für S (A), RBD (B) und Nc ( C )angezeigt. Basierend auf diesen und anderen Daten (nicht gezeigt) wurde eine Probenverdünnung von 1:2.000 und eine Biotin-Nachweisantikörperkonzentration von 0,62 μg/ml ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Abbildung 5: Optimierung des Einzelreporter-Neutralisationstests. Die Modifikation des serologischen Einzelreporter-Assays zu einem neutralisierenden Antikörper-Nachweisassay wurde durch Hinzufügen eines Inkubationsschritts mit ACE2 als Wettbewerber durchgeführt, wie in Abschnitt 6 beschrieben. Ein Satz von 11 Proben, die von niedrigen bis zu hochpositiven Titerseren reichten, und eine IgG-gestreifte Serumprobe wurden mit einer zweifachen Verdünnungsserie von ACE2 ab 4 μg/ml unter Verwendung von Standard-Assay-Bedingungen getestet. Über diesen Bereich der ACE2-Konzentrationen ist eine Abnahme des MFI bei erhöhtem ACE2 für S (A) und RBD (B) zu sehen, nicht jedoch für Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Abbildung 6: Prozentuale Signalhemmung mit ACE2. Die prozentualen Restsignale für den Satz von 11 Proben (aus Abbildung 4)sind dargestellt. Für jede Probe wurde unabhängig von ihrem IgG-Titer eine maximale Abnahme von ≥30% MFI-Signal für S (A) und RBD (B) bei der höchsten ACE2-Konzentration erreicht. Für das Nc-Antigen (C) gab es keine signifikante Signalhemmung mit einer beliebigen Menge an ACE2 getestet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Abbildung 7: Test von DyLight 405 Anti-IgM als RP2 IgM-Erkennungsreagenz. Ein Satz von 11 Proben und IgG-gestreiften Seren wurde verwendet, um DL 405-konjugiertes Anti-IgM als RP2-Nachweisreagenz zu testen. Die RP2 IgM MFI Signale für S (A), RBD (B) und Nc (C) werden angezeigt. Das höchste MFI-Signal für jedes Antigen mit einer Probe betrug ungefähr 140 MFI-Einheiten für RBD mit Probe H (B). Selbst das Signal auf dem IgM-Kontrollperlensatz betrug weniger als 1.000 MFI im RP2-Kanal über den gesamten Antikörpertiterbereich und zeigte nicht den erhöhten Dynamikbereich, der mit dem PE-Anti-IgM-Nachweisantikörper im RP1-Kanal beobachtet wurde (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Abbildung 8: Optimierung von SASB als RP2-Reporter mit Biotin Anti-IgG. Ein Satz von 11 Proben und IgG-gestreiften Seren wurde verwendet, um eine Verdünnungsserie von SASB mit dem Standard 0,62 μg / ml Biotin Anti-IgG zu testen. Die resultierenden IgG-MFIs im RP2-Kanal für S (A), RBD (B) und Nc (C) werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Abbildung 9: Vergleich von drei verschiedenen Kombinationen von RP1 IgM und RP1 IgG Detektionsmischungen. Drei verschiedene Nachweisantikörpermischungen wurden an 11 Proben und IgG-entfernten Seren getestet. Die verwendeten Kombinationen und Endkonzentrationen sind in Tabelle 1beschrieben. Alle Proben wurden mit einer 2-fachen ACE2-Verdünnung ab 16 μg/ml getestet. Es werden Daten für Proben am DFSO von 3, 12 und 30 Tagen angezeigt. Die MFI-Signale für RP1 IgM (orange) und RP2 IgG (blau) sind in A (DFSO 3), C (DFSO 12) und E (DFSO 30) dargestellt. Die ACE2-Prozent-Rest-MFIs sind in B (DFSO 3), D (DFSO 12) und F (DFSO 30) dargestellt. Signale, die eine Abnahme von >30 % im Vergleich zu No ACE2-Steuerelementen darstellen, werden hellgrün hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Unseres Wissens ist dies das erste Beispiel für ein perlenbasiertes Multiplexing-Protokoll, das zwei Reportersignale verwendet, um gleichzeitig zwei Ergebnisse pro Analyt zu messen. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, antigenspezifisches IgM und IgG gleichzeitig zu messen, mit weniger Probe und einer kürzeren Zeit bis zu den Ergebnissen. Während diese Dual-Reporter-Methode spezifisch für die Antikörper-Isotypisierung ist, könnte sie angepasst werden, um andere Analytpaare zu messen, wie post-translationale Modifikationen oder freie versus gebundene Wirkstoffformen.Dr. Steve Angeloni, ein leitender Feldanwendungswissenschaftler der Luminex Corporation, demonstriert heute unser Verfahren. Um mit dem dualen IgG- und IgM-serologischen Assay zu beginnen, bereiten Sie die erforderlichen Multiplex-Perlenmischungen aus den einzelnen Paarperlen vor und kontrollieren Sie die Perlenbestände in einer Konzentration von einmal 10 bis zu den sechs Perlen pro Milliliter. Als nächstes verdünnen Sie die Serumproben 100-fach, indem Sie 10 Mikroliter Serum zu 990 Mikroliter PBS-TBN-Puffer hinzufügen, und verdünnen Sie die Proben dann um das Zehnfache, indem Sie 20 Mikroliter der 1:100-Verdünnung auf 180 Mikroliter PBS-TBN hinzufügen.Wenn die Perlenmischungen und Serumproben fertig sind, fügen Sie 50 Mikroliter der Multiplexperlenmischungen zu den zugewiesenen Vertiefungen einer 96-Well-unverbindlichen Mikrotiterplatte hinzu und fügen Sie dann 50 Mikroliter der verdünnten Serumproben zu den entsprechenden Vertiefungen hinzu. Sobald alle Proben hinzugefügt wurden, decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Trennen Sie dann die Perlen vom Reaktionsgemisch, indem Sie die Platte für zwei Minuten auf einen Magnetplattenabscheider legen.Halten Sie die Platte auf dem Magneten, entfernen Sie die Foliendichtung. Dann kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen. Während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten, flecken Sie die Platte auf saugfähigem Papier.Um die Reaktionsschnüchte zu waschen, entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 Mikroliter PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu. Decken Sie die Platte mit einer frischen Foliendichtung ab und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang auf dem beheizten Shaker, bevor Sie sie für weitere zwei Minuten wieder auf den Plattenmagneten legen. Während Sie die Platte auf dem Magneten halten, kehren Sie die Platte um, um den Überstand zu verwerfen, und flecken Sie die Platte auf saugfähigem Papier.Nach der zweiten PBS-TBN-Wäsche entfernen Sie die Platte vom Magneten und fügen Sie 100 Mikroliter frische Erkennungsreagenzmischung zu jeder Vertiefung hinzu. Nachdem Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung abgedeckt haben, legen Sie sie für 15 Minuten auf einen beheizten Plattenschüttler und dann für zwei Minuten auf einen Magnetplattenabscheider. Während sich die Platte auf dem Magneten befindet, entsorgen Sie die Erkennungsreagenzmischung, indem Sie die Platte über einen Abfallbehälter invertieren und auf saugfähigem Papier abträgen.Waschen Sie die Reaktionsschüchte mit PBS-TBN zweimal, wie zuvor gezeigt, und entfernen Sie dann die Platte vom Magneten. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu, bedecken Sie dann die Platte mit Foliendichtung und schütteln Sie sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Foliendichtung und lesen Sie 50 Mikroliter der Probe aus jeder Vertiefung im Durchflussanalysator.Um die Platte zu lesen, wählen Sie das Dropdown-Menü in der oberen linken Ecke, navigieren Sie zu Plattenkonfiguration, laden Sie die zuvor konfigurierte Platte und wählen Sie Platte ausführen aus. Werfen Sie den Plattenträger aus, indem Sie das Symbol Auswerfen auswählen, laden Sie die Platte dann auf den Plattenträger und wählen Sie das Symbol Zurückziehen, um den Plattenträger zurückzuziehen. Sobald sich der Plattenträger in den Analysator hineingezogen hat, wählen Sie das Symbol Ausführen, um mit dem Lesen der Platte zu beginnen.Für den Dual-Reporter-Neutralisationstest fügen Sie 50 Mikroliter der Multiplex-Perlenmischungen zu zugewiesenen Vertiefungen einer 96-Well-nicht bindenden Mikrotiterplatte hinzu, fügen Sie dann 25 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter ACE2 zu jeder Vertiefung hinzu und beschichten Sie die Platte mit einer Foliendichtung. Nach einer zweiminütigen Inkubation auf einem beheizten Plattenschüttler werden 25 Mikroliter 1:500 Serumverdünnungen zu den zugewiesenen Vertiefungen hinzugefügt. Sobald alle Proben hinzugefügt wurden, führen Sie die Inkubations-, Wasch-, Detektions- und Analyseschritte durch, wie zuvor für den serologischen Assay gezeigt.Ein Test von Anti-IgM, der mit dem DyLight 405-Reporterfarbstoff unter Verwendung von Serumproben innerhalb von fünf bis 60 Tagen nach Symptombeginn konjugiert wurde, und eine IgG-Streifen-Serumprobe erzeugten kein hohes Signal für das Spike-Antigen. Für Proben mit einer hohen mittleren IgM-Fluoreszenzintensität wurden die höchsten Signale für die Rezeptorbindungsdomäne und Nukleokapsidantigene beobachtet. Während der IgM-Titer in einigen Proben erhöht sein sollte, überstieg die beobachtete mittlere Fluoreszenzintensität 140 MFI-Einheiten nicht.Darüber hinaus fehlte der Kontrollperle für IgM ein signifikanter Dynamikbereich für die mediane Fluoreszenzintensität, wenn DyLight 405 verwendet wurde, das mit Anti-IgM konjugiert war, verglichen mit einem Phycoerythrin-markierten Anti-IgM in der gleichen Konzentration. Für den IgG-Nachweis hatte das brillante Violettkonjugat Signale mit höherer medianer Fluoreszenzintensität als das Streptavidin-Konjugat von Fluorphor Super Bright 436. Die Signalintensität für das brillante violette Konjugat variierte jedoch über die ACE2-Titrationen hinweg.Diese Signalfluktuation durch das brillantviolette Konjugat über ACE2-Konzentrationen hinweg störte auch die Bestimmung der prozentualen Hemmung durch ACE2 im Bereich der IgG-Titer. Für den IgM-Nachweis zeigte das Phycoerythrin-Anti-IgM höhere Signale als die von DyLight 549 anti-humanem IgM erzeugten Signale. Bei der Bestimmung der ACE2-prozentigen Hemmung der IgM-Bindung gab es einen leichten, aber unbedeutenden Unterschied zwischen den beiden IgM-Erkennungsreagenzien.Einer der wichtigsten Schritte im Verfahren besteht also darin, Ihren Multiplex-Perlenmix aus Ihren individuellen Perlenbeständen vorzubereiten und sicherzustellen, dass Sie dies richtig tun. So kann dieses Verfahren auch zur Messung der Wirksamkeit von Impfstoffen und zur Überwachung der Immunantwort auf andere Krankheitserreger eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effiziente SARS-CoV-2 quantitative Reverse Transkriptase PCR Speicheldiagnostikstrategie unter Verwendung von Open-Source-Pipettierrobotern

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...