Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

דו"ח זה מומן על ידי תאגיד לומינקס (אוסטין, TX). המחברים מודים למתיו סילברמן PhD (פתרונות הוצאה לאור ביו-רפואיים, דלריי ביץ ', FL) על סיוע בעריכה מדעית.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

סטיבן אנג'לוני ושרי דנבר הם עובדים של חברת Luminex המייצרת חלק מהריגנטים והמכשירים ששימשו במחקר זה. פרסום גישה פתוחה של מאמר זה היה בחסות תאגיד Luminex

מחקר זה הרחיב את הפונקציונליות של בדיקת מיקרוספרה פלואורסצנטית מולטיפלקס, 3Flex, כי איכות מעריך את תגובת IgG לזיהום על ידי SARS-CoV-21. בעוד בדיקות סרולוגיות רבות עבור COVID-19 לזהות אנטיגן יחיד, הבדיקה הזו בו זמנית מעריכה אנטיגנים S, RBD ו- Nc, וכוללת בקרת איזוטיפ נוגדנים פנימית7. בנוסף, ACE2 משמש אינדיקטור לזיהוי טיטרים נוגדנים מנטרלים ל SARS-CoV-2.
בדיקות אנטיגנים מרובות עשויות להיות שימושיות במיוחד בעתיד להפלות תגובות חיסוניות בין אנשים נגועים לחיסון. עם SARS-CoV-2, אם רק נוגדני S ו- RBD מוערכים, לא ניתן יהיה להבחין אם זה היה בגלל זיהום בעבר או לתגובת נוגדנים חיסונית. אף אחד מהחיסונים הנמצאים כעת בשימוש לא מתמקד באנטיגן Nc, ולכן על ידי הערכת אנטיגנים S/RBD ו- Nc, ניתן להבחין בין זיהום ויראלי בעבר (Nc - ו- S / RBD-חיובי) מתגובת חיסון (S / RBD חיובי בלבד; NC שלילי).
במחקר הנוכחי הועברו 3 הבדיקות הסרולוגיות והמנטרלות של 3Flex (סעיפים 5 ו-6) למכשיר ניתוח זרימה דו-ספרתי חדש (סעיפים 7 ו-8). פרוטוקולי אימונואסה אופייניים לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים דומים לפרוטוקולי ELISA סטנדרטיים, בעקבות שלבים דומים לדגירה מדגם, גילוי נוגדנים / דגירה של כתבים וניתוח תוצאות8. מחקרים קודמים הדגימו גם כיצד ניתן להעביר בדיקות ELISA סטנדרטיות לפלטפורמת מולטיפלקסינג מבוססת חרוזים9.
ניתן היה להעביר את פרוטוקולי הבדיקה בצורה חלקה ממכשיר הכתב הבודד שקדם לו למערכת הכתבים הכפולים החדשה, כפי שניתן לראות מהתוצאות שהושגו עבור דגימות הבדיקה והפקדים(איור 4 ואיור 5). ב-serological assay, כל דגימות הסרום החיוביות הדגימו ירידה אופיינית במינון-תגובה לאות המקביל הן לדילול מדגם גבוה יותר והן לריכוז נוגדנים בזיהוי נמוך יותר, בעוד האותות לדגימות השליליות נותרו ברמות הרקע. באופן דומה, עבור בדיקת נטרול, הפחתת אותות עבור S ו RBD, אבל לא Nc, התאים ריכוזים גוברים של המתחרה ACE2, בעוד סרום IgG הופשט הושפע הרבה פחות על ידי תוספת של ACE2. לפני הדגירה של החרוזים עם ACE2 במשך 2 דקות לפני הוספת דגימת הסרום (כמתואר בסעיפים 6 ו -8), הושוותה גם לשילוב החרוזים עם ACE2 וסרום בו זמנית והפיקה הבדל קטן בתוצאות (נתונים שלא הוצגו). עם זאת, מכיוון שהתוצאות שהושגו עם החרוזים בתוספת שלב טרום הדגירה של ACE2 היו עקביות יותר, היה זה ההליך הסופי שאומץ לפרוטוקול ההסתגרות לנטרול (סעיפים 6 ו-8).
מכיוון שמערכת הכתבים הכפולה משלבת ערוץ עיתונאי פלואורסצנטי שני, שתי ההבחנות הוסבו לתגובת איסוטיפינג כדי למדוד בו זמנית גם את תגובות IgG וגם את ה-IgM. הפונקציונליות הכפולה של מנתח הזרימה מאפשרת איסוף אותות פלואורסצנטיים משני ריאגנטים לזיהוי כתבים עבור כל ניתוח במולטיפלקס עבור כל מדגם, ולמעשה מכפילה את הנתונים הנוצרים לכל דגימה בבדיקה. לצורך פיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקולי ה-assay של הכתבים הכפולים, נבדקו מספר צבעי כתבים ונוגדני זיהוי זמינים מסחרית עבור ערוץ RP2 החדש (איור 7 ואיור 8) כדי לקבוע את האפשרויות הטובות ביותר הזמינות. נוגדן האנטי-IgM שהורכב עם צבע הכתב DL 405 לא הצליח בערוץ RP2 (איור 7),כך שביוטין אנטי-IgG עם SASB הוערך לאחר מכן לגילוי בערוץ RP2 (איור 8). שלושה שילובים של ריאגנטים לזיהוי RP1 ו-RP2 הושוו בבחנת נטרול הכתבים הכפולה (טבלה 1 ואיור 9) כדי לקבוע את השילובים בעלי הביצועים הטובים ביותר לזיהוי סימולטני נוגדנים מנטרלים של IgG ו-IgM. אמנם היו הבדלים משמעותיים בעוצמת האות בין ערוץ RP1 באמצעות PE-anti IgM לבין ערוץ RP2 באמצעות DL 549 אנטי-IgM, לא היה הבדל משמעותי במדידת עיכוב הכריכה אחוז על ידי ACE2.
מספר מגבלות לשיטה הנוכחית ומחקר זה מוכרים. ראשית, הדגימות שנבדקו ושימשו בפיתוח השיטה ואופטימיזציה הוגבלו ערכות של 8-11 דגימות. דגימות נוספות ייבדקו במחקרים מורחבים כדי לוודא שהשיטה ממוטבת במלואה. שנית, מספר מוגבל של פלואורופורים עיתונאים וזוגות עיתונאים נבדקו. בדיקה נוספת של כל הכתבים הזמינים בכל השילובים האפשריים תקבע אילו ריאגנטים ניתן להשתמש בהצלחה בשיטה זו. נוגדן האנטי-IgG שהוכנס לביוטין היה שונה מהנוגדן האנטי-IgG שהוכנס לכתב BV 421. אז, למרות השונות בעוצמת האות עבור BV 421 אנטי IgG קיים, זה יכול להיות בגלל הספציפיות של הנוגדן ולא קשור צבע הכתב. בדיקת נוגדנים זמינים אחרים BV 421-מצומד עשוי לזהות נוגדן אחר שיתפקד היטב בערוץ RP2. מחקרים עתידיים גם להעריך את השילוב של PE אנטי IgM עם BV 421 אנטי אנושי IgG לגילוי RP1 ו RP2, בהתאמה. לבסוף, אפילו עם יכולת הכתב הכפולה של המכשיר, ההסתה מוגבלת לשני איזוטיפים (שני פרמטרים) לכל תגובה. אם יש למדוד איזוטיפים נוספים או רצוי איזוטיפינג מלא, אז תגובות נוספות באמצעות אותם שני ערוצי כתב יצטרכו להיות מנוהלות בבארות נפרדות.
טכנולוגיית מולטיפלקסינג מבוססת חרוזים מאפשרת תכנון מהיר וגמיש של בדיקות עם יישום קל לזרימות עבודה שגרתיות במעבדה3,4,10. מחקר זה הדגים את הקלות בהעברת הבדיקות הסרולוגיות והנטרלות של 3Flex שתוארו בעבר עבור SARS-CoV-2 למערכת ניתוח זרימה למדידת IgG עם כתב אחד, או עם שינוי קל, בו זמנית מדידת תגובות IgG ו- IgM באמצעות שני כתבים. לאפשרות הכתב הכפול יש יתרונות ברורים על פני פלטפורמות עיתונאיות בודדות מכיוון שהיא יכולה לספק כמות כפולה של נתונים לדגימה, תוך שימוש במחצית מנפח המדגם, ובמחצית ממספר בארות התגובה. עם צבעי הכתב המתאימים ונוגדני זיהוי, ניתן לפתח בקלות את הבדיקות האיזוטיפיות על מכשיר ניתוח זרימת הכתב הכפול.

מגפת COVID-19 הדגישה את החשיבות של היכולת לפתח וליישם במהירות בדיקות סרולוגיות מהירות, בעלות תפוקה גבוהה ובעלות ביצועים גבוהים, שניתן להשתמש בהן לאבחון ומעקב אחר פתוגנים חדשניים כגון SARS-CoV-2. בדיקות סרולוגיות מולטיפלקס יכול להיות שימושי מאוד במגיפה, כפי שהוא יכול בו זמנית לנתח נוגדנים אנטיגנים מרובים, אשר מספק כיסוי פתוגן רחב ובקרות על שונות באורגניזם ואת התגובה המארחת לזיהום. הפיתוח של בדיקה מבוססת חרוזים פלואורסצנטית מולטיפלקס, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), שיכול לזהות נוגדנים לחלבון ספייק (S), האנזים הממיר אנגיוטנסין ספייק-2 (ACE2) קולטן מחייב תחום (RBD), ו nucleocapsid (Nc) של SARS-CoV-2 דווח לאחרונה1. 3Flex הוכח שיש ביצועים דומים לבדיקת SARS-CoV-2 IgG ייחוס עבור סרום המתקבל ב -≥21 ימים מתחילת הסימפטומים, אך היה רגישות גבוהה יותר עם דגימות שנאספו ב -≤5 ימים מתחילת הסימפטומים. בנוסף, עיכוב של כריכת נוגדנים הודגם עבור אנטיגנים S ו- RBD באמצעות ACE2 מסיס במתכונת של נטרול. טכנולוגיה מבוססת חרוזים מולטיפלקס אומצה באופן נרחב כטכנולוגיה מוכחת לבדיקות סרולוגיות מולטיפלקס ויש לה יתרונות ברורים עבור הקרנה בקנה מידה גדול, כולל זמן קצר לתוצאות, דרישות מדגם קטן, ועבודה מופחתת2,3,4.
לאחרונה, מכשיר ניתוח זרימה חדש הפך זמין המספק את אותה יכולת גבוהה plex, תפוקה גבוהה של המערכת הפגין בעבודההקודמת 1, אבל עם היתרון הנוסף של שני ערוצי עיתונאי. היכולת למדוד שני אותות כתב פלואורסצנטיים בתגובה אחת מאפשרת הערכה של שתי תוצאות לכל ניתוח עבור כל מדגם והיא אידיאלית עבור יישומי isotyping, אשר בדרך כלל חייב להתבצע בארות תגובה נפרדת5. יכולת הכתב הכפול מספקת נתונים כפולים עבור כל מדגם במחצית מבארות תגובה רבות עם מחצית מדרישות נפח המדגם, ולכן יש לה יתרון ברור על פני מערכות עיתונאיות בודדות. מחקר זה מפרט את פרוטוקול הבחינה הסרולוגית הסטנדרטית ומתאר את ההסתגלות לתפרור. בנוסף, דו"ח זה מתאר את ההמרה של כתב יחיד בבדיקה סרולוגית של כתב, ולאחר מכן, בדיקה כפולה של נטרול כתבים, כדי למדוד בו זמנית נוגדנים מנטרלים של איזוטיפים IgG ו- IgM נגד האנטיגנים SARS-CoV-2 S, RBD ו- Nc. סקירה חזותית של פרוטוקול ה-assay מסופקת באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

מגפת COVID-19 הדגישה את הצורך בשיטות מהירות בעלות תפוקה גבוהה לגילוי סרולוגי רגיש וספציפי של זיהום עם פתוגנים חדשניים, כגון SARS-CoV-2. בדיקות סרולוגיות מולטיפלקס יכול להיות שימושי במיוחד כי זה יכול בו זמנית לנתח נוגדנים אנטיגנים מרובים כי מייעל כיסוי פתוגן, ובקרות על שונות באורגניזם ואת התגובה המארחת בודדים. כאן אנו מתארים בדיקה מבוססת מיקרוספרה SS-CoV-2 IgG 3-plex המבוססת על מיקרוספירה שיכולה לזהות הן נוגדני IgM והן IgG לשלושה אנטיגנים גדולים SARS-CoV-2 - ספייק (S), ספייק אנגיוטנסין-המרת אנזים-2 (ACE2) קולטן מחייב תחום (RBD), ונוקלאוקפסד (Nc). בדיקת ההוכחה יש ביצועים דומים לבדיקת ייחוס SARS-CoV-2 עבור IgG בסרום שהושג ב -≥21 ימים מתחילת הסימפטומים, אך הייתה רגישות גבוהה יותר עם דגימות שנאספו ב -≤5 ימים מתחילת הסימפטומים. יתר על כן, באמצעות ACE2 מסיס בפורמט בדיקה מנטרל, עיכוב של כריכת נוגדנים הודגם עבור S ו RBD.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

למיטב ידיעתנו, זוהי הדוגמה הראשונה לפרוטוקול מולטיפלקסינג מבוסס חרוזים המשתמש בשני אותות עיתונאים כדי למדוד בו זמנית שתי תוצאות לכל ניתוח. טכניקה זו מאפשרת למשתמש למדוד IgM ו- IgG ספציפיים אנטיגן בו זמנית, עם פחות מדגם וזמן קצר יותר לתוצאות. בעוד ששיטת כתב כפולה זו היא ספציפית לאיזוטיפינג נוגדנים, ניתן להתאים אותה למדידת זוגות ניתוח אחרים, כגון שינויים לאחר תרגום או צורות סמים חופשיות לעומת קשורות.מדגים את ההליך שלנו היום יש לנו ד"ר סטיב אנג'לוני, מדען יישום שדה בכיר עבור תאגיד Luminex. כדי להתחיל את הכתב הכפול IgG ו IgM סרולוגית, להכין את תערובות חרוז מולטיפלקס הנדרש מן זוג בודדים חרוזים ולשלוט במניות חרוזים בריכוז של פעם אחת פעמים 10 עד שש חרוזים למיליליטר. לאחר מכן, לדלל את דגימות הסרום פי 100 על ידי הוספת 10 microliters של סרום ל 990 microliters של חוצץ PBS-TBN, ולאחר מכן לדלל את הדגימות עוד פי עשרה על ידי הוספת 20 microliters של 1:100 דילול ל 180 microliters של PBS-TBN.כאשר תערובות החרוזים ודגימות הסרום מוכנות, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובות חרוזים מולטיפלקס לבארות שהוקצו של צלחת מיקרוטיטר 96-well לא מחייבת, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דגימות הסרום המדוללות לבארות המתאימות. לאחר שכל הדגימות נוספו, מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטיק ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, להפריד את החרוזים מתערובת התגובה על ידי הצבת הצלחת על מפריד צלחת מגנטית במשך שתי דקות.שומרים את הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף. לאחר מכן הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת ולהעיף בעדינות את supernatant מתוך בארות. בעודם מחזיקים את הצלחת על המגנט, מכתימים את הצלחת על נייר סופג.כדי לשטוף את בארות התגובה, להסיר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 microliters של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ודגרה על השייקר המחומם במשך שתי דקות לפני שמניחים אותו בחזרה על מגנט הצלחת למשך שתי דקות נוספות. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, הפוך את הצלחת כדי להשליך את supernatant, ולהכתים את הצלחת על נייר סופג.לאחר שטיפת PBS-TBN השנייה, הסירו את הצלחת מהמגנט והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תערובת ריאגנט לזיהוי טרי לכל באר. לאחר כיסוי הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטיק, מניחים אותו על שייקר צלחת מחומם במשך 15 דקות, ולאחר מכן על מפריד צלחת מגנטית במשך שתי דקות. בזמן שהצלחת על המגנט, יש להשליך את תערובת ריאגנט הזיהוי על ידי היפוך הצלחת מעל מיכל פסולת והשלכתה על נייר סופג.לשטוף את בארות התגובה עם PBS-TBN פעמיים כפי שהדגים בעבר, ולאחר מכן להסיר את הצלחת מן המגנט. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של PBS-TBN לכל באר, ואז מכסים את הצלחת עם חותם רדיד אלומיניום ומנערים במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את חותם רדיד הכסף ולהמשיך לקרוא 50 microliters של המדגם מכל באר מנתח הזרימה.כדי לקרוא את הצלחת, בחר את התפריט הנפתח בפינה הימנית העליונה, נווט לתצורת לוחית, טען את הצלחת שתצורתה נקבעה קודם לכן ובחר הפעל לוח. פלט את מנשא הלוח על-ידי בחירת סמל הוצאת, ולאחר מכן טען את הצלחת על נושא הלוח ובחר בסמל 'בטל' כדי לבטל את מנשא הלוח. לאחר שמנשא הלוחות התמשך לתוך המנתח, בחר את סמל ההפעלה כדי להתחיל לקרוא את הלוח.לבדיקת נטרול הכתב הכפול, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובות החרוזים המולטיפלקסיות לבארות שהוקצו של צלחת מיקרו-טייטר לא-מחייבת של 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של שני מיקרוגרם למיליליטר ACE2 לכל באר, וכיסו את הצלחת באטם רדיד אלומיניום. לאחר דגירה של שתי דקות על שייקר צלחת מחומם, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של דילול סרום 1:500 לבארות שהוקצו. לאחר שכל הדגימות נוספו, בצע את שלבי הדגירה, הכביסה, הזיהוי והניתוח כפי שהודגם בעבר לבדיקה הסרולוגית.בדיקה של אנטי-IgM מצומדת לצבע הכתב DyLight 405 באמצעות דגימות סרום תוך חמישה עד 60 יום מהתגלות הסימפטומים ודגימת סרום רצועת IgG לא הניב אות גבוה עבור אנטיגן ספייק. עבור דגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות בינונית IgM גבוהה, האותות הגבוהים ביותר נראו עבור תחום מחייב הקולטן אנטיגנים nucleocapsid. בעוד titer IgM היה צריך להיות גבוה בדגימות מסוימות, רמות עוצמת פלואורסצנטיות בינונית שנצפתה לא יעלה על 140 יחידות MFI.יתר על כן, חרוז השליטה עבור IgM היה חסר טווח דינמי משמעותי לעוצמת פלואורסצנטיות חציונית בעת שימוש DyLight 405 מצומד אנטי-IgM לעומת phycoerythrin שכותרתו אנטי-IgM באותו ריכוז. עבור זיהוי IgG, מצומד סגול מבריק היה אותות עוצמת פלואורסצנטיות חציונית גבוהה יותר מאשר מצומד סטרפטאבידין של פלואורפור סופר בהיר 436. עם זאת, עוצמת האות עבור ההמולה הסגולה המבריקה השתנתה על פני טיטריציות ACE2.תנודות אות זה על ידי מצומד סגול מבריק על פני ריכוזי ACE2 גם הפריע בקביעת עיכוב אחוז על ידי ACE2 על פני הטווח של titers IgG. עבור זיהוי IgM, phycoerythrin אנטי-IgM הציג אותות גבוהים יותר מאלה שנוצרו על ידי DyLight 549 אנטי-אנושי IgM. בעת קביעת עיכוב ACE2 אחוז של כריכת IgM, היה הבדל קל אך חסר משמעות בין שני ריאגנטים גילוי IgM.אז אחד השלבים החשובים ביותר בהליך הוא להכין את תערובת החרוזים מולטיפלקס שלך ממניות החרוזים האישיים שלך ולוודא שאתה עושה את זה נכון. אז הליך זה יכול לשמש גם כדי למדוד את היעילות של חיסונים וניטור התגובות החיסוניות לפתוגנים אחרים גם כן.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

חרוז מבוסס Assay מולטיפלקס לניתוח של פרופילים ציטוקין דמעה

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

יעיל SARS-CoV-2 כמותי הפוך Transcriptase PCR רוק אסטרטגיה אבחון באמצעות רובוטים צנרת קוד פתוח

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

זיהוי סימולטני של סוגי נוגדנים שונים בבדיקה סרולוגית מרובת משתתפים

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...