Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

इस रिपोर्ट को ल्यूमिनेक्स कॉर्पोरेशन (ऑस्टिन, TX) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक वैज्ञानिक संपादन सहायता के लिए मैथ्यू सिल्वरमैन पीएचडी (बायोमेडिकल पब्लिशिंग सॉल्यूशंस, डेलरे बीच, एफएल) का शुक्रिया अदा करते हैं।

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

स्टीफन एंजेलोनी और शेरी डंबर ल्यूमिनेक्स कॉरपोरेशन के कर्मचारी हैं जो इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए कुछ रिएजेंट्स और इंस्ट्रूमेंट्स का उत्पादन करते हैं । इस लेख का ओपन एक्सेस प्रकाशन ल्यूमिनेक्स कॉर्पोरेशन द्वारा प्रायोजित किया गया था

इस अध्ययन ने एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर परख, 3फ्लेक्स की कार्यक्षमता का विस्तार किया, जो सार्स-सीओवी-21द्वारा संक्रमण के लिए आईजीजी प्रतिक्रिया का गुणात्मक आकलन करता है। जबकि COVID-19 के लिए कई सीरोलॉजिकल परख एक ही एंटीजन का पता लगाते हैं, यह परख एक साथ एस, आरबीडी और एनसी एंटीजन का मूल्यांकन करती है, और इसमें एक आंतरिक एंटीबॉडी आइसोटाइप नियंत्रण7शामिल है। इसके अलावा, ACE2 का उपयोग सार्स-सीओवी-2 को बेअसर एंटीबॉडी टाइटर्स का पता लगाने के लिए एक संकेतक के रूप में किया जाता है।
संक्रमित और टीका लगाए गए व्यक्तियों के बीच प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ भेदभाव करने के लिए भविष्य में बहु-एंटीजन परख विशेष रूप से उपयोगी हो सकती है। सार्स-CoV-2 के साथ, यदि केवल एस और आरबीडी एंटीबॉडी का मूल्यांकन किया जाता है, तो यह विचार करना असंभव होगा कि क्या यह पिछले संक्रमण के कारण था या टीकाकरण एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के लिए। वर्तमान में उपयोग में आने वाले टीकों में से कोई भी एनसी एंटीजन को लक्षित नहीं करता है, इसलिए एस/आरबीडी और एनसी एंटीजन का मूल्यांकन करके, पिछले वायरल संक्रमण (एनसी-और एस/आरबीडी-पॉजिटिव) को टीकाकरण प्रतिक्रिया (एस/आरबीडी-पॉजिटिव) से अलग करना संभव है; नेकां नकारात्मक) ।
वर्तमान अध्ययन में, 3फ्लेक्स सीरोलॉजिकल और बेअसर परख (वर्ग 5 और 6) को एक नए दोहरे रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण उपकरण (वर्ग 7 और 8) पर स्थानांतरित कर दिया गया था। मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए विशिष्ट इम्यूनोसे प्रोटोकॉल मानक एलिसा प्रोटोकॉल के समान हैं, नमूना इनक्यूबेशन के लिए तुलनीयकदम के बाद, एंटीबॉडी का पता लगाने इनक्यूबेशन/ पिछले अध्ययनों से यह भी पता चला है कि कैसे मानक एलिसा परख को मनका आधारित मल्टीप्लेक्सिंग प्लेटफॉर्म9में स्थानांतरित किया जा सकता है ।
परख प्रोटोकॉल मूल पूर्ववर्ती एकल रिपोर्टर साधन से नए दोहरे रिपोर्टर प्रणाली के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है, के रूप में परीक्षण के नमूनों और नियंत्रण के लिए प्राप्त परिणामों द्वारा दिखाया गया है(चित्रा 4 और चित्रा 5)। सीरोलॉजिकल परख में, सभी सकारात्मक सीरम नमूनों ने एक उच्च नमूना कमजोर पड़ने और कम पहचान एंटीबॉडी एकाग्रता दोनों के अनुरूप संकेत में एक विशेषता खुराक-उत्तरदायी कमी का प्रदर्शन किया, जबकि नकारात्मक नमूनों के लिए संकेत पृष्ठभूमि के स्तर पर बने रहे। इसी तरह, बेअसर परख के लिए, एस और आरबीडी के लिए संकेतों को कम करना, लेकिन नेकां नहीं, ACE2 प्रतियोगी की बढ़ती सांद्रता से मेल खाती है, जबकि आईजीजी छीन लिया सीरम ACE2 के अलावा से बहुत कम प्रभावित था । सीरम नमूने के अलावा (जैसा कि वर्ग 6 और 8 में वर्णित) के अलावा से पहले 2 मिनट के लिए ACE2 के साथ मोतियों को पूर्व-इनक्यूबेटिंग करना, एक ही समय में ACE2 और सीरम के साथ मोतियों के संयोजन की तुलना में भी किया गया था और परिणामों में थोड़ा अंतर उत्पन्न किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया)। हालांकि, क्योंकि मोतियों के साथ प्राप्त परिणाम प्लस ACE2 पूर्व इनक्यूबेशन कदम अधिक सुसंगत थे, यह अंतिम प्रक्रिया बेअसर परख प्रोटोकॉल (वर्ग 6 और 8) के लिए अपनाया गया था ।
क्योंकि दोहरी रिपोर्टर प्रणाली एक दूसरे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चैनल को शामिल किया गया है, दोनों परख isotyping परख में परिवर्तित करने के लिए एक साथ दोनों IgG और IgM प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए किया गया । फ्लो एनालाइजर की दोहरी रिपोर्टर कार्यक्षमता प्रत्येक नमूने के लिए मल्टीप्लेक्स में प्रत्येक विश्लेषण के लिए दो रिपोर्टर डिटेक्शन रिएजेंट्स से फ्लोरोसेंट संकेतों के संग्रह की अनुमति देती है, जो एक परख में प्रति नमूने उत्पन्न डेटा को प्रभावी ढंग से दोगुना कर देता है। दोहरे रिपोर्टर परख प्रोटोकॉल के विकास और अनुकूलन के लिए, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिपोर्टर रंगों और डिटेक्शन एंटीबॉडी का मूल्यांकन नए RP2 चैनल(चित्रा 7 और चित्रा 8)के लिए किया गया था ताकि उपलब्ध सर्वोत्तम विकल्प (एस) का निर्धारण किया जा सके। डीएल 405 रिपोर्टर डाई के साथ संयुग्म विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी ने आरपी2 चैनल(चित्रा 7)में अच्छा प्रदर्शन नहीं किया, इसलिए एसएएएसबी के साथ बायोटिन एंटी-आईजीजी का मूल्यांकन बाद में आरपी2 चैनल(चित्रा 8)में पता लगाने के लिए किया गया। आईजीजी और आईजीएम बेअसर एंटीबॉडी का एक साथ पता लगाने के लिए सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन संयोजन निर्धारित करने के लिए दोहरे रिपोर्टर बेअसर परख(तालिका 1 और चित्रा 9)में RP1 और RP2 डिटेक्शन रिएजेंट्स के तीन संयोजनों की तुलना की गई । जबकि पीई-एंटी आईजीएम और डीएल 549 एंटी-आईजीएम का उपयोग करके आरपी 1 चैनल के बीच सिग्नल तीव्रता में महत्वपूर्ण अंतर थे, लेकिन ACE2 द्वारा प्रतिशत बाध्यकारी अवरोध के माप में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।
वर्तमान विधि और इस अध्ययन के लिए कई सीमाएं स्वीकार कर रहे हैं । सबसे पहले, विधि विकास और अनुकूलन में परीक्षण और उपयोग किए गए नमूनों को 8-11 नमूनों के सेट तक सीमित किया गया था। विधि को पूरी तरह से अनुकूलित करने के लिए विस्तारित अध्ययनों में अधिक नमूनों की जांच की जाएगी। दूसरा, रिपोर्टर फ्लोरोफोरस और रिपोर्टर जोड़ों की सीमित संख्या का परीक्षण किया गया । सभी संभव संयोजनों में सभी उपलब्ध संवाददाताओं का आगे परीक्षण यह निर्धारित करेगा कि इस विधि में कौन से अभिकर्षकों का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। बायोटिन के लिए संजीदेबी एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी बीवी ४२१ रिपोर्टर के साथ संजीदेबी से अलग था । इसलिए, हालांकि बीवी 421 एंटी-आईजीजी के लिए सिग्नल तीव्रता में परिवर्तनशीलता मौजूद थी, यह एंटीबॉडी की विशिष्टता के कारण हो सकता है और रिपोर्टर डाई से संबंधित नहीं हो सकता है। अन्य उपलब्ध बीवी 421-संयुग्मित एंटीबॉडी का परीक्षण करना एक अन्य एंटीबॉडी की पहचान कर सकता है जो आरपी2 चैनल में अच्छा प्रदर्शन करेगा। भविष्य के अध्ययन भी क्रमशः RP1 और RP2 में पता लगाने के लिए बीवी ४२१ एंटी ह्यूमन आईजीजी के साथ पीई एंटी-आईजीएम के संयोजन का मूल्यांकन करेंगे । पिछले, यहां तक कि साधन की दोहरी रिपोर्टर क्षमता के साथ, परख प्रतिक्रिया प्रति दो आइसोटाइप (दो पैरामीटर) तक सीमित हैं। यदि अतिरिक्त आइसोटाइप को मापा जाना है या पूर्ण आइसोटाइपिंग वांछित है, तो एक ही दो रिपोर्टर चैनलों का उपयोग करके अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं को अलग कुओं में चलाने की आवश्यकता होगी ।
मनका आधारित मल्टीप्लेक्सिंग तकनीक नियमितप्रयोगशाला कार्यप्रवाह3,4,10में आसान कार्यान्वयन के साथ तेजी से और लचीला परख डिजाइन के लिए अनुमति देता है। इस अध्ययन में पहले वर्णित 3Flex सीरोलॉजिकल और बेअसर परख सार्स के लिए एक एकल रिपोर्टर के साथ IgG मापने के लिए एक प्रवाह विश्लेषण प्रणाली पर पर, या मामूली संशोधन के साथ, एक साथ दोनों IgG और IgM प्रतिक्रियाओं को मापने में आसानी का प्रदर्शन दो संवाददाताओं का उपयोग कर । ड्यूल रिपोर्टर विकल्प एकल रिपोर्टर प्लेटफार्मों पर स्पष्ट लाभ है क्योंकि यह नमूना प्रति दो बार के रूप में अधिक डेटा प्रदान कर सकते हैं, आधे नमूना मात्रा का उपयोग कर, और प्रतिक्रिया कुओं की आधी संख्या में । उपयुक्त रिपोर्टर रंगों और पता लगाने एंटीबॉडी के साथ, आइसोटाइपिंग परख आसानी से विकसित किया जा सकता है और दोहरी रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण उपकरण पर प्रदर्शन किया जा सकता है।

COVID-19 महामारी तेजी से विकसित करने और तेजी से विकसित करने और तेजी से लागू करने में सक्षम होने के महत्व पर बल दिया है, उच्च थ्रूपुट, उच्च प्रदर्शन सीरोलॉजिकल परीक्षण है कि निदान और सार्स-CoV-2 जैसे उपन्यास रोगजनकों की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल परीक्षण एक महामारी में बेहद उपयोगी हो सकता है, क्योंकि यह एक साथ कई एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का विश्लेषण कर सकता है, जो जीव में परिवर्तनशीलता और संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के लिए व्यापक रोगजनक कवरेज और नियंत्रण प्रदान करता है। एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट मनका आधारित परख का विकास, सार्स-सीओवी-2 आईजीजी 3फ्लेक्स (3फ्लेक्स), जो स्पाइक (एस) प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का पता लगा सकता है, स्पाइक एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम-2 (ACE2) रिसेप्टर-बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी), और न्यूक्लियोकैप्सिड (एनसी) सार्स-सीओवी-2 कीरिपोर्टकी गई थी । 3Flex लक्षण शुरुआत से ≥21 दिनों में प्राप्त सीरम के लिए एक संदर्भ सार्स-CoV-2 IgG परख के लिए तुलनीय प्रदर्शन किया है दिखाया गया था, लेकिन लक्षण शुरुआत से ≤५ दिनों में एकत्र नमूनों के साथ उच्च संवेदनशीलता थी । इसके अतिरिक्त, एक बेअसर परख प्रारूप में घुलनशील ACE2 का उपयोग कर एस और आरबीडी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी बाइंडिंग के अवरोध का प्रदर्शन किया गया था। मल्टीप्लेक्स मनका आधारित प्रौद्योगिकी को मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल परीक्षण के लिए एक सिद्ध तकनीक के रूप में व्यापक रूप से अपनाया गया है और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अलग फायदे हैं, जिनमें कम समय-से-परिणाम, छोटे नमूना आवश्यकताएं, और कम श्रम2,3,4शामिल हैं।
हाल ही में, एक नया प्रवाह विश्लेषण उपकरण उपलब्ध हो गया है जो पिछले काम1में प्रदर्शित सिस्टम की एक ही उच्च-प्लेक्स, उच्च-थ्रूपुट क्षमता प्रदान करता है, लेकिन दो रिपोर्टर चैनलों के अतिरिक्त लाभ के साथ। एक ही प्रतिक्रिया में दो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर संकेतों को मापने की क्षमता प्रत्येक नमूने के लिए प्रति विश्लेषण दो परिणामों के मूल्यांकन की अनुमति देती है और आइसोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए आदर्श है, जिसे आमतौर पर अलग-अलग प्रतिक्रिया कुओं में किया जाना चाहिए5। दोहरी रिपोर्टर क्षमता आधे नमूना मात्रा आवश्यकताओं के साथ आधे के रूप में कई प्रतिक्रिया कुओं में प्रत्येक नमूने के लिए दो बार डेटा प्रदान करता है, और इस तरह एकल रिपोर्टर सिस्टम पर एक स्पष्ट लाभ है । यह अध्ययन मानक सीरोलॉजिकल परख प्रोटोकॉल का विवरण देता है और एक बेअसर परख के अनुकूलन का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, इस रिपोर्ट में एक दोहरी रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख के लिए एकल रिपोर्टर परख के रूपांतरण का वर्णन है, और बाद में, एक दोहरी रिपोर्टर बेअसर परख, एक साथ दोनों आईजीजी और IgM isotypes के बेअसर एंटीबॉडी को मापने के लिए सार्स-CoV-2 एस, RBD, और नेकां एंटीजन के खिलाफ । परख प्रोटोकॉल का एक दृश्य सिंहावलोकन चित्र 1में प्रदान किया गया है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19 महामारी ने सार्स-सीओवी-2 जैसे उपन्यास रोगजनकों के साथ संक्रमण के संवेदनशील और विशिष्ट सीरोलॉजिकल डिटेक्शन के लिए तेजी से उच्च-थ्रूपुट विधियों की आवश्यकता को रेखांकित किया है । मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल परीक्षण विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है क्योंकि यह एक साथ कई एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का विश्लेषण कर सकता है जो रोगजनक कवरेज का अनुकूलन करता है, और जीव और व्यक्तिगत मेजबान प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रण करता है। यहां हम एक सार्स-सीओवी-2 आईजीजी 3-प्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर आधारित परख का वर्णन करते हैं जो आईजीएम और आईजीजी एंटीबॉडी दोनों को तीन प्रमुख सार्स-सीओवी-2 एंटीजन-स्पाइक (एस) प्रोटीन, स्पाइक एंजियोटेनसिन-कन्वर्टिंग एंजाइम-2 (ACE2) रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी), और न्यूक्लियोकैप्सिड (एनसीडी) दोनों का पता लगा सकता है । परख लक्षण शुरुआत से ≥21 दिनों में प्राप्त सीरम में IgG के लिए एक सार्स-CoV-2 संदर्भ परख के लिए तुलनीय प्रदर्शन किया है दिखाया गया था, लेकिन लक्षण शुरुआत से ≤५ दिनों में एकत्र नमूनों के साथ उच्च संवेदनशीलता थी । इसके अलावा, एक बेअसर परख प्रारूप में घुलनशील ACE2 का उपयोग कर, एंटीबॉडी बाध्यकारी के निषेध एस और आरबीडी के लिए प्रदर्शन किया गया था ।

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए एक प्रवाह विश्लेषण प्रणाली जो एक दो रिपोर्टर readout प्रदान करता है मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल और एंटीबॉडी बेअसर परख के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया था कि एक साथ सर्स-CoV-2 के लिए बेअसर IgG और IgM एंटीबॉडी को मापने कर सकते हैं ।

एक मल्टीप्लेक्स, मल्टीप्लेक्स ड्यूल रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम सार्स-सीओवी-2 बेअसर परख एक मल्टीप्लेक्स मनका आधारित प्रवाह विश्लेषण प्रणाली के लिए

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

हमारी जानकारी के लिए, यह एक मनका आधारित मल्टीप्लेक्सिंग प्रोटोकॉल का पहला उदाहरण है जो दो रिपोर्टर संकेतों का उपयोग करता है ताकि एक साथ दो परिणामों को एक साथ मापने के लिए विश्लेषण किया जा सके। यह तकनीक उपयोगकर्ता को एक ही समय में एंटीजन-विशिष्ट आईजीएम और आईजीजी को मापने की अनुमति देती है, जिसमें कम नमूना और परिणामों के लिए कम समय होता है। हालांकि यह दोहरी रिपोर्टर विधि एंटीबॉडी आइसोटाइपिंग के लिए विशिष्ट है, इसे अन्य विश्लेषणात्मक जोड़े को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन या मुक्त बनाम बाध्य दवा रूप।आज हमारी प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हुए हमारे पास ल्यूमिनेक्स कॉर्पोरेशन के लिए एक वरिष्ठ फील्ड एप्लीकेशन साइंटिस्ट डॉ स्टीव एंजेलोनी हैं। दोहरी रिपोर्टर IgG और IgM सीरोलॉजिकल परख शुरू करने के लिए, आवश्यक मल्टीप्लेक्स मनका व्यक्तिगत जोड़े मनका से घोला जा सकता है और एक बार 10 की एकाग्रता पर मनका स्टॉक नियंत्रण तैयार करने के लिए मिलीलीटर प्रति छह मोती । इसके बाद, पीबीएस-एलबीएन बफर के ९९० माइक्रोलीटर में सीरम के 10 माइक्रोलीटर जोड़कर सीरम के नमूनों को १०० गुना पतला करें, फिर पीबीएस-एलबीएन के १८० माइक्रोलीटर में १० ० कमजोर पड़ने के 20 माइक्रोलीटर जोड़कर नमूनों को और दस गुना पतला करें ।जब मनका घोला जा सकता है और सीरम के नमूने तैयार होते हैं, तो मल्टीप्लेक्स मनका के 50 माइक्रोलीटर को 96-अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेट के सौंपे गए कुओं में जोड़ें, फिर उचित कुओं में पतला सीरम नमूनों के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक बार सभी नमूनों को जोड़ दिया गया है, एक माइक्रोप्लेट पन्नी सील के साथ थाली को कवर और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली शेखर पर इनक्यूबेट । फिर, दो मिनट के लिए एक चुंबकीय प्लेट विभाजक पर थाली रखकर प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करें।चुंबक पर प्लेट रखते हुए, पन्नी सील हटा दें। फिर ध्यान से एक बेकार कंटेनर पर थाली उलटा और धीरे कुओं से बाहर supernatant झटका । जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े, शोषक कागज पर थाली दाग ।रिएक्शन कुओं को धोने के लिए प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक कुएं में पीबीएस-एलबीएन के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से ढकें और दो मिनट के लिए गर्म शेखर पर एक और दो मिनट के लिए प्लेट चुंबक पर वापस रखने से पहले इनक्यूबेट करें। चुंबक पर प्लेट रखते समय, प्लेट को सुपरनेट त्यागने के लिए उलटा करें, और शोषक कागज पर प्लेट को दाग दें।दूसरे पीबीएस-एचबीएन वॉश के बाद, प्लेट को चुंबक से हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा डिटेक्शन रिएजेंट मिक्स के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक माइक्रोप्लेट पन्नी सील के साथ प्लेट को कवर करने के बाद, इसे 15 मिनट के लिए एक गर्म प्लेट शेखर पर रखें, और फिर दो मिनट के लिए एक चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। जबकि प्लेट चुंबक पर है, एक अपशिष्ट कंटेनर पर प्लेट को उलटा करके और शोषक कागज पर दाग लगाकर डिटेक्शन रीएजेंट मिश्रण को त्यागें।पीबीएस-TBN के साथ प्रतिक्रिया कुओं को दो बार धोएं जैसा कि पहले प्रदर्शन किया गया था, फिर चुंबक से प्लेट हटा दें। प्रत्येक कुएं में पीबीएस-एचबीएन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर प्लेट को पन्नी सील से कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए हिलाएं। पन्नी सील निकालें और प्रवाह विश्लेषक में प्रत्येक अच्छी तरह से नमूने के 50 माइक्रोलीटर पढ़ने के लिए आगे बढ़ें।प्लेट को पढ़ने के लिए, ऊपरी-बाएं कोने में ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करें, प्लेट कॉन्फ़िगरेशन पर नेविगेट करें, पहले कॉन्फ़िगर प्लेट लोड करें, और रन प्लेट का चयन करें। रिजेक्ट आइकन का चयन करके प्लेट वाहक को बाहर निकालें, फिर प्लेट वाहक पर प्लेट लोड करें और प्लेट वाहक को वापस लेने के लिए रियाव आइकन का चयन करें। एक बार प्लेट वाहक एनालाइजर में लंबी हो गई है, तो प्लेट पढ़ना शुरू करने के लिए रन आइकन का चयन करें।दोहरी रिपोर्टर बेअसर परख के लिए, मल्टीप्लेक्स मनका के ५० माइक्रोलीटर जोड़ें एक ९६-अच्छी तरह से गैर बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं को सौंपा है, तो प्रत्येक अच्छी तरह से मिलीलीटर ACE2 प्रति दो माइक्रोग्राम के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक पन्नी सील के साथ थाली को कवर किया । एक गर्म प्लेट शेखर पर दो मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, सौंपा कुओं के लिए 1:500 सीरम कमजोर पड़ने के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें । एक बार सभी नमूनों को जोड़ दिया गया है, इनक्यूबेशन, धोने, पता लगाने, और विश्लेषण कदम के रूप में पहले सीरोलॉजिकल परख के लिए प्रदर्शन करते हैं ।एंटी-आईजीएम का एक परीक्षण डाइलाइट ४०५ रिपोर्टर डाई के लिए एक परीक्षण लक्षण शुरुआत से पांच से ६० दिनों के भीतर सीरम नमूनों का उपयोग कर और एक IgG पट्टी सीरम नमूना स्पाइक एंटीजन के लिए एक उच्च संकेत का उत्पादन नहीं किया । उच्च आईजीएम मध्यम फ्लोरेसेंस तीव्रता वाले नमूनों के लिए, रिसेप्टर बाध्यकारी डोमेन और न्यूकोकैप्सिड एंटीजन के लिए उच्चतम संकेत देखे गए। जबकि आईजीएम टाइटर को कुछ नमूनों में ऊंचा किया जाना चाहिए था, मनाया गया मध्यम फ्लोरेसेंस तीव्रता का स्तर 140 एमएफआई इकाइयों से अधिक नहीं था।इसके अलावा, आईजीएम के लिए नियंत्रण मनका में औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता के लिए एक महत्वपूर्ण गतिशील सीमा का अभाव था जब डाइलाइट 405 का उपयोग करके एक ही एकाग्रता पर एंटी-आईजीएम लेबल की तुलना में एंटी-आईजीएम के लिए संयुग्म किया गया था। आईजीजी डिटेक्शन के लिए, शानदार वायलेट कंजूगेट में फ्लोरफोर सुपर ब्राइट 436 के स्ट्रेप्टाविडिन कंजूगेट की तुलना में उच्च औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता संकेत थे। हालांकि, शानदार बैंगनी संजूगेट के लिए सिग्नल तीव्रता ACE2 titrations भर में विविध ।ACE2 सांद्रता में शानदार वायलेट संयोजित द्वारा यह संकेत उतार-चढ़ाव भी IgG titers की सीमा में ACE2 द्वारा प्रतिशत अवरोध का निर्धारण करने के साथ हस्तक्षेप किया । आईजीएम डिटेक्शन के लिए, फाइकोरीथ्रिन एंटी-आईजीएम ने डाइलाइट 549 एंटी-ह्यूमन आईजीएम द्वारा उत्पन्न लोगों की तुलना में उच्च संकेत प्रदर्शित किए। जबकि IgM बाध्यकारी के ACE2 प्रतिशत निषेध का निर्धारण, वहां दो IgM पता लगाने अभिकर्मकों के बीच एक मामूली लेकिन तुच्छ अंतर था ।तो प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक अपने व्यक्तिगत मनका स्टॉक से अपने मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण तैयार करने के लिए और सुनिश्चित करें कि आप सही ढंग से करते हैं । इसलिए इस प्रक्रिया का उपयोग टीकों की प्रभावकारिता को मापने और अन्य रोगजनकों के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए भी किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

आईजीजी और आईजीएम Autoantibodies का एक साथ जांच के लिए दो-रंग एंटीजन प्रोटीन की पीढ़ी

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

आंसू Cytokine प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

सीटू संकरण में इम्यूनो आरएनए-फ्लोरेसेंस का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का दृश्य

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

सार्स-कोव-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन एंटीबॉडी का पता लगाना एक HiBiT-आधारित बायोरिपोर्टर का उपयोग करके

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग पुनः संयोजक सार्स-सीओवी-2 का उपयोग करते हुए के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में वायरल संक्रमण की लाइव इमेजिंग और मात्रा का ठहराव

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

कुशल SARS-CoV-2 मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पीसीआर लार नैदानिक रणनीति ओपन-सोर्स पिपेटिंग रोबोट का उपयोग कर

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

एक मल्टीप्लेक्स्ड सीरोलॉजिकल टेस्ट में विभिन्न एंटीबॉडी वर्गों का एक साथ पता लगाना

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

न्यूट्रलाइजेशन परख के माध्यम से SARS-CoV-2 के खिलाफ हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक आणविक उपकरण के रूप में छद्म टाइप वायरस

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

रेबीज का उपयोग करके रेबीज आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी का पता लगाना अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...