Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
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Questo rapporto è stato finanziato da Luminex Corporation (Austin, TX). Gli autori ringraziano Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) per l'assistenza all'editing scientifico.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni e Sherry Dunbar sono dipendenti di Luminex Corporation che produce alcuni dei reagenti e degli strumenti utilizzati in questo studio. La pubblicazione Open Access di questo articolo è stata sponsorizzata da Luminex Corporation

Questo studio ha ampliato la funzionalità di un test multisplo di microsfere fluorescenti, 3Flex, che valuta qualitativamente la risposta IgG all'infezione da SARS-CoV-21. Mentre molti test sierologici per COVID-19 rilevano un singolo antigene, questo test valuta contemporaneamente gli antigeni S, RBD e Nc e include un controllo interno dell'isotipo anticorpale7. Inoltre, ACE2 viene utilizzato come indicatore per rilevare i titoli anticorpali neutralizzanti a SARS-CoV-2.
I saggi multigenici possono essere particolarmente utili in futuro per discriminare le risposte immunitarie tra persone infette e vaccinate. Con SARS-CoV-2, se vengono valutati solo gli anticorpi S e RBD, sarebbe impossibile discernere se ciò fosse dovuto a un'infezione passata o a una risposta anticorpale vaccinale. Nessuno dei vaccini attualmente in uso ha come bersaglio l'antigene Nc, quindi valutando gli antigeni S/RBD e Nc, è possibile distinguere l'infezione virale passata (Nc- e S/RBD-positiva) da una risposta vaccinale (solo S/RBD-positiva; Nc-negativo).
Nel presente studio, i saggi sierologici e di neutralizzazione 3Flex (sezioni 5 e 6) sono stati trasferiti su un nuovo strumento di analisi del flusso a doppio reporter (sezioni 7 e 8). I protocolli di immunosaggio tipici per i saggi multiplex basati su perle sono simili ai protocolli ELISA standard, seguendo passaggi comparabili per l'incubazione del campione, l'incubazione di anticorpi / reporter di rilevamento e l'analisi dei risultati8. Studi precedenti hanno anche dimostrato come i saggi ELISA standard possono essere trasferiti su una piattaforma di multiplexing basata su perle9.
I protocolli di analisi potrebbero essere trasferiti senza soluzione di continuità dal precedente strumento a singolo reporter al nuovo sistema a doppio reporter, come dimostrano i risultati ottenuti per i campioni e i controlli di prova (Figura 4 e Figura 5). Nel test sierologico, tutti i campioni di siero positivi hanno dimostrato una caratteristica diminuzione del segnale dose-responsiva corrispondente sia a una maggiore diluizione del campione che a una minore concentrazione di anticorpi di rilevamento, mentre i segnali per i campioni negativi sono rimasti a livelli di fondo. Allo stesso modo, per il test di neutralizzazione, i segnali decrescenti per S e RBD, ma non Nc, corrispondevano a concentrazioni crescenti del concorrente ACE2, mentre il siero spogliato di IgG era molto meno influenzato dall'aggiunta di ACE2. La pre-incubazione delle perle con ACE2 per 2 minuti prima dell'aggiunta del campione di siero (come descritto nei paragrafi 6 e 8), è stata anche confrontata con la combinazione delle perle con ACE2 e siero allo stesso tempo e ha prodotto una piccola differenza nei risultati (dati non mostrati). Tuttavia, poiché i risultati ottenuti con le perle più la fase di pre-incubazione ACE2 erano più coerenti, è stata la procedura finale adottata per il protocollo di test di neutralizzazione (sezioni 6 e 8).
Poiché il sistema dual reporter incorpora un secondo canale reporter fluorescente, entrambi i saggi sono stati convertiti in saggi di isotipizzazione per misurare contemporaneamente le risposte IgG e IgM. La funzionalità dual reporter dell'analizzatore di flusso consente la raccolta di segnali fluorescenti da due reagenti di rilevamento reporter per ciascun analita nel multiplex per ciascun campione, raddoppiando efficacemente i dati generati per campione in un test. Per lo sviluppo e l'ottimizzazione dei protocolli di analisi dual reporter, sono stati valutati diversi coloranti reporter disponibili in commercio e anticorpi di rilevamento per il nuovo canale RP2 (Figura 7 e Figura 8) per determinare le migliori opzioni disponibili. L'anticorpo anti-IgM coniugato con il colorante reporter DL 405 non ha funzionato bene nel canale RP2 (Figura 7), quindi la biotina anti-IgG con SASB è stata successivamente valutata per il rilevamento nel canale RP2 (Figura 8). Tre combinazioni di reagenti di rilevamento RP1 e RP2 sono state confrontate nel test di neutralizzazione a doppio reporter (Tabella 1 e Figura 9) per determinare le combinazioni più performanti per il rilevamento simultaneo di anticorpi neutralizzanti IgG e IgM. Mentre c'erano differenze significative nell'intensità del segnale tra il canale RP1 che utilizzaVA PE-anti IgM e il canale RP2 che utilizzava DL 549 anti-IgM, non vi era alcuna differenza significativa nella misurazione dell'inibizione percentuale del legame da parte di ACE2.
Diverse limitazioni al metodo attuale e questo studio sono riconosciuti. In primo luogo, i campioni testati e utilizzati nello sviluppo e nell'ottimizzazione del metodo erano limitati a serie di 8-11 campioni. Altri campioni saranno testati in studi ampliati per verificare che il metodo sia completamente ottimizzato. In secondo luogo, è stato testato un numero limitato di fluorofori reporter e coppie di reporter. Ulteriori test di tutti i reporter disponibili in tutte le possibili combinazioni determineranno quali reagenti possono essere utilizzati con successo in questo metodo. L'anticorpo anti-IgG coniugato alla biotina era diverso dall'anticorpo anti-IgG coniugato al reporter BV 421. Quindi, sebbene esistesse variabilità nell'intensità del segnale per l'anti-IgG BV 421, potrebbe essere dovuta alla specificità dell'anticorpo e non correlata al colorante reporter. Il test di altri anticorpi coniugati BV 421 disponibili può identificare un altro anticorpo che funzionerebbe bene nel canale RP2. Studi futuri valuteranno anche la combinazione di PE anti-IgM con BV 421 anti-human IgG per il rilevamento in RP1 e RP2, rispettivamente. Infine, anche con la capacità di doppio reporter dello strumento, i saggi sono limitati a due isotipi (due parametri) per reazione. Se devono essere misurati isotipi aggiuntivi o si desidera un isotipizzazione completa, allora ulteriori reazioni utilizzando gli stessi due canali reporter dovrebbero essere eseguite in pozzi separati.
La tecnologia di multiplexing basata su perle consente una progettazione rapida e flessibile del saggio con una facile implementazione nei flussi di lavoro di laboratorio di routine3,4,10. Questo studio ha dimostrato la facilità nel trasferire i saggi sierologici e di neutralizzazione 3Flex precedentemente descritti per SARS-CoV-2 su un sistema di analisi del flusso per misurare IgG con un singolo reporter, o con lievi modifiche, misurando contemporaneamente sia le risposte IgG che IgM utilizzando due reporter. L'opzione dual reporter ha chiari vantaggi rispetto alle piattaforme a singolo reporter perché può fornire il doppio dei dati per campione, utilizzando metà del volume del campione e metà del numero di pozzi di reazione. Con i coloranti reporter appropriati e gli anticorpi di rilevamento, i saggi di isotipizzazione possono essere facilmente sviluppati ed eseguiti sullo strumento di analisi del flusso a doppio reporter.

La pandemia di COVID-19 ha sottolineato l'importanza di essere in grado di sviluppare e implementare rapidamente test sierologici rapidi, ad alto rendimento e ad alte prestazioni che possono essere utilizzati per la diagnosi e la sorveglianza di nuovi agenti patogeni come SARS-CoV-2. I test sierologici multiplex possono essere estremamente utili in una pandemia, in quanto possono analizzare contemporaneamente gli anticorpi contro più antigeni, il che fornisce un'ampia copertura patogena e controlli per la variabilità nell'organismo e la risposta dell'ospite all'infezione. Lo sviluppo di un test multiplo basato su perle fluorescenti, il SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), in grado di rilevare anticorpi contro la proteina spike (S), il dominio di legame del recettore (RBD) dell'enzima di conversione dell'angiotensina spike (ACE2) e il nucleocapside (Nc) di SARS-CoV-2 è stato recentemente riportato1. 3Flex ha dimostrato di avere prestazioni comparabili a un test di riferimento SARS-CoV-2 IgG per siero ottenuto a ≥21 giorni dall'insorgenza dei sintomi, ma ha avuto una sensibilità più elevata con campioni raccolti a ≤5 giorni dall'insorgenza dei sintomi. Inoltre, è stata dimostrata l'inibizione del legame anticorpale per gli antigeni S e RBD utilizzando ACE2 solubile in un formato di test di neutralizzazione. La tecnologia basata su perle multiplex è stata ampiamente adottata come tecnologia collaudata per i test sierologici multiplex e presenta vantaggi distinti per lo screening su larga scala, tra cui tempi brevi per i risultati, requisiti di piccoli campioni e manodopera ridotta2,3,4.
Recentemente, è diventato disponibile un nuovo strumento di analisi del flusso che fornisce la stessa capacità high-plex e ad alto throughput del sistema dimostrata nel precedente lavoro1, ma con l'ulteriore vantaggio di due canali reporter. La capacità di misurare due segnali reporter fluorescenti in una singola reazione consente la valutazione di due risultati per analita per ciascun campione ed è ideale per applicazioni di isotipizzazione, che in genere devono essere eseguite in pozzetti di reazione separati5. La capacità dual reporter fornisce il doppio dei dati per ciascun campione nella metà dei pozzi di reazione con la metà dei requisiti di volume del campione, e quindi ha un chiaro vantaggio rispetto ai sistemi a singolo reporter. Questo studio descrive in dettaglio il protocollo di test sierologico standard e descrive l'adattamento a un test di neutralizzazione. Inoltre, questo rapporto descrive la conversione del test del singolo reporter in un test sierologico a doppio reporter e, successivamente, un test di neutralizzazione del doppio reporter, per misurare simultaneamente gli anticorpi neutralizzanti degli isotipi IgG e IgM contro gli antigeni SARS-CoV-2 S, RBD e Nc. Una panoramica visiva del protocollo di analisi è fornita nella Figura 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

La pandemia di COVID-19 ha sottolineato la necessità di metodi rapidi ad alto rendimento per il rilevamento sierologico sensibile e specifico dell'infezione da nuovi agenti patogeni, come SARS-CoV-2. Il test sierologico multiplex può essere particolarmente utile perché può analizzare contemporaneamente gli anticorpi contro più antigeni che ottimizzano la copertura dei patogeni e controlla la variabilità nell'organismo e la risposta individuale dell'ospite. Qui descriviamo un test basato su microsfera fluorescente SARS-CoV-2 IgG 3-plex in grado di rilevare sia gli anticorpi IgM che IgG a tre principali antigeni SARS-CoV-2: la proteina spike (S), il dominio di legame del recettore (RBD) dell'enzima di conversione dell'angiotensina spike (ACE2) e il nucleocapside (Nc). Il test ha dimostrato di avere prestazioni comparabili a un test di riferimento SARS-CoV-2 per IgG nel siero ottenuto a ≥21 giorni dall'insorgenza dei sintomi, ma aveva una maggiore sensibilità con campioni raccolti a ≤5 giorni dall'insorgenza dei sintomi. Inoltre, utilizzando ACE2 solubile in un formato di test di neutralizzazione, è stata dimostrata l'inibizione del legame anticorpale per S e RBD.

Ottimizzazione del Test Sierologico Single Reporter. La strategia di accoppiamento per tutti gli antigeni SARS-CoV-2 è descritta in Cameron, et al., 20201 e nel passaggio 2.1 sopra. La strategia per la conferma dell'accoppiamento è descritta nel passaggio 2.3 precedente. Per un accoppiamento efficiente, i valori mediani di intensità di fluorescenza (IFM) devono essere significativamente superiori alle reazioni di controllo negative senza siero/senza anticorpi e devono dimostrare una risposta alla dose di segnale MFI decrescente con quantità decrescenti di reagente di rilevazione. Le IFM di circa 1.000 unità MFI o superiori rispetto alle IFM di fondo indicano generalmente un accoppiamento proteico efficiente e dipendono dalla concentrazione e dalla specificità del reagente di rilevazione utilizzato. Utilizzando questo metodo, la conferma dell'accoppiamento dell'antigene S, RBD e Nc è stata testata per due lotti di perle (Figura 2). I segnali MFI per tutti gli antigeni erano significativamente più alti dell'IFM di fondo e mostravano una risposta alla dose con titolazione dei reagenti di rilevazione. I dati hanno anche mostrato una buona riproducibilità dei livelli di IFM tra i due diversi lotti di perle accoppiate.
L'ottimizzazione del test del singolo reporter è stata eseguita come descritto in Cameron, et al., 20201. Ogni antigene è stato testato a diverse concentrazioni di accoppiamento con diverse diluizioni di diversi campioni di siero che rappresentano campioni alti, medi, bassi e negativi. Inoltre, poiché il test misura i titoli IgG, un siero spogliato di IgG è stato utilizzato come ulteriore campione negativo. I risultati di una serie rappresentativa di diluizione del campione con diversi livelli di accoppiamento dell'antigene sono mostrati nella Figura 3. Questa serie iniziale di diluizione è stata testata con una concentrazione fissa di reagenti di rilevamento per ottenere una gamma potenziale di livelli rappresentativi di IFM antigene-specifici e di fondo. Da questi dati, sono stati determinati ulteriori intervalli di diluizione del campione e livelli di accoppiamento dell'antigene e testati ulteriormente con campioni aggiuntivi (dati non mostrati).
Successivamente, la concentrazione del reagente di rilevamento è stata ottimizzata per l'uso con le diverse diluizioni sieriche e i livelli di accoppiamento dell'antigene. I dati rappresentativi che utilizzano 6 campioni positivi e 2 negativi sono mostrati nella Figura 4. A seguito di ulteriori test con diverse centinaia di campioni di siero pre-COVID-19 negativi, i livelli ottimali di accoppiamento dell'antigene finale e le concentrazioni di regent di rilevamento sono stati selezionati per il protocollo di analisi finale, come descritto nella sezione 5.
Conversione in un singolo test di neutralizzazione del reporter La conversione del singolo saggio sierologico reporter in un test di neutralizzazione è stata ottenuta aggiungendo una fase di incubazione utilizzando ACE2 (come reagente concorrente) con le perle prima di aggiungere il campione di siero. Titolando la quantità di ACE2 aggiunta, è stata osservata l'inibizione del legame di IgG agli antigeni S e RBD, come mostrato nella Figura 5. Mentre gli 11 sieri dei pazienti avevano titoli diversi di IgG, ciascuno mostrava una significativa diminuzione del segnale MFI con l'aumento della concentrazione di ACE2. Come previsto, ACE2 influisce solo sui segnali MFI di S e RBD, ma non sull'antigene Nc.
La percentuale di segnale MFI residuo relativa a 0 μg/mL ACE2 per tutti i campioni è mostrata nella Figura 6. Per la maggior parte dei campioni, è stata osservata una perdita di segnale >30% per S e RBD con aumento della concentrazione di ACE2. Come previsto, non c'è stato alcun effetto di ACE2 sul segnale Nc.
Conversione in un doppio saggio sierologico IgG e IgM a doppio reporter Per il test IgG e IgM a doppio reporter, sono state utilizzate le condizioni standard del test del singolo reporter per testare diverse combinazioni di anticorpi e reporter per i due canali reporter. Il canale RP1 è simile ai precedenti strumenti di analisi del flusso con rilevamento della fluorescenza "arancione" per coloranti reporter come il PE. Il secondo canale, RP2, impiega un laser di eccitazione viola che può essere utilizzato per rilevare la fluorescenza "blu" di coloranti eccitati a 402 nm con picchi di spettri di emissione nell'intervallo 421-441 nm.
Diverse combinazioni di anticorpi anti-umani IgG e IgM sono state testate a varie concentrazioni con le condizioni standard di diluizione e incubazione del campione di 2.000 volte dettagliate nella sezione 6. Un test iniziale di anti-IgM coniugato al colorante reporter DyLight 405 (DL 405; eccitazione a 400 nm ed emissione a 420 nm) per il canale RP2 è stato eseguito utilizzando una serie di 11 campioni PCR-positivi con DFSO che vanno da 5 a >60 giorni e un campione di siero spogliato di IgG. Questo reagente di rilevamento non ha prodotto un segnale elevato nel canale RP2 come mostrato nella Figura 7A,B, C. Per i campioni con IgM RP2 MFI elevato, i segnali più alti sono stati osservati per RBD e Nc (Figura 7B,C). Mentre i titoli IgM dovrebbero essere elevati in questo momento in alcuni campioni, i livelli di IFM osservati non hanno superato le 140 unità MFI con il reagente di rilevamento IgM. Inoltre, il perle di controllo per IgM mancava di una gamma dinamica significativa per MFI quando si utilizzava DL 405 coniugato a anti-IgM rispetto a un reporter RP1 anti-IgM etichettato con PE utilizzato alle stesse concentrazioni (Figura 7D).
Poiché non era disponibile un reagente di rilevamento RP2 segnalatore adatto per IgM, l'anti-IgG originale di biotina con SASB è stato testato per l'uso nel canale RP2. Il segnale per IgG nel canale RP2 con SASB non aveva la stessa gamma dinamica di SAPE, ma aveva comunque un intervallo adatto per misurare i titoli IgG per S, RBD e Nc (Figura 8). Questi dati hanno portato a testare diverse combinazioni di reagenti di rilevamento RP1 IgM e RP2 IgG, come descritto di seguito.
Conversione al test di neutralizzazione del doppio reporter Il test sierologico a doppio reporter è stato convertito in un test di neutralizzazione aggiungendo una fase di incubazione con ACE2 e pere, prima di aggiungere il campione di siero. È stata utilizzata una serie di diluizione 2 volte di ACE2 a partire da 16 μg / ml, quindi testata con set di 11 campioni e sieri spogliati come descritto sopra. Inoltre, 3 diverse combinazioni di miscele di anticorpi di rilevamento RP1 IgM e RP2 IgG sono state testate su una serie di 11 campioni e controlli sierici spogliati. Le combinazioni finali e le concentrazioni di reagenti ritenute ottimali sono descritte in dettaglio nella Tabella 1.
Per il rilevamento di IgG, la biotina anti-umana IgG / SASB utilizzata nel test originale del singolo reporter è stata testata insieme a un altro anti-IgG coniugato al colorante BV reporter. Mentre il coniugato BV aveva segnali MFI RP2 elevati, l'intensità del segnale MFI per il titolo IgG variava tra le titolazioni ACE2 (Figura 9A, C, E). La combinazione IgG/SASB anti-human di biotina ha avuto una diminuzione del segnale MFI più consistente attraverso la titolazione ACE2 rispetto al coniugato BV, dimostrando una risposta alla dose, sebbene i livelli di MFI fossero più bassi. La fluttuazione del segnale da parte del coniugato BV tra le concentrazioni di ACE2 ha anche interferito nel determinare l'inibizione percentuale da parte di ACE2 nell'intervallo dei titoli IgG rispetto alla combinazione IgG/SASB anti-umana di biotina (Figura 9B,D, F). I campioni con segnali MFI bassi, come il campione DFSO 3, non hanno titoli abbastanza alti per valutare le prestazioni di questi reagenti o misurare la capacità di neutralizzazione IgG.
Per determinare i titoli IgM nel canale RP1, un anti-IgM coniugato con PE è stato confrontato con un IgM anti-umano coniugato al colorante reporter DyLight 549 (DL 549; eccitazione a 562 nm ed emissione a 576 nm) alle concentrazioni elencate nella Tabella 1. Di questi due reagenti, l'anti-IgM PE ha mostrato IFM più elevate di quelle generate da DL 549 IgM anti-umano per i campioni testati (Figura 9A,C,E). Il perle di controllo IgM che misurava l'aggiunta di questi reagenti aveva diverse IFM medie di ≈ 17.000 per l'anti-IgM PE e 2.723 per il coniugato DL 549. Anche con queste differenze, l'impatto delle varie concentrazioni di ACE2 sulle IFM è stato misurabile con il coniugato DL 549. Per determinare l'inibizione ACE2% del legame IgM, c'era una leggera ma insignificante differenza tra i due reagenti di rilevamento IgM (Figura 9B, D , F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Combinazione</td>
			<td rowspan="2">Cronista</td>
			<td colspan="2">Concentrazione finale nel pozzo (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB ·</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 IgM anti-umano</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Viola Brillante 421 Anti-Human IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 IgM anti-umano</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB ·</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Elenco delle combinazioni di coloranti reporter RP1 e RP2 testate. Diversi coloranti reporter RP1 e RP2 sono stati valutati per misurare i titoli IgG e IgM. Le tre combinazioni mostrate sopra sono state testate in diverse modalità di rilevamento RP1 e per l'ottimizzazione del test di neutralizzazione. Per le combinazioni di RP2 che utilizzano SASB, vengono mostrate le concentrazioni per l'anticorpo di rilevamento biotinilato e SASB. *La concentrazione finale rappresenta la concentrazione finale nel pozzo di reazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso che evidenzia i principali passaggi del protocollo di analisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Figura 2: Conferma dell'accoppiamento dell'antigene. Gli antigeni sono stati accoppiati a 100, 10 e 1 pmol/106 perme. Per gli antigeni S e RBD, i sieri anti-S di coniglio sono stati utilizzati e rilevati con PE anti-coniglio IgG. Per Nc, è stato utilizzato un policlonale di coniglio purificato con proteina G anti-Nc. Vengono mostrate le curve di titolazione per le perle accoppiate con 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) e 100 pmol Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Figura 3: Ottimizzazione della diluizione sierica con diversi livelli di accoppiamento dell'antigene. I campioni di siero che rappresentano campioni alti, medi, bassi e negativi sono stati testati con i diversi accoppiamenti antigene pmol/106 perle. Una titolazione sierica di 4 volte è stata testata con una miscela multiplex di perle accoppiate all'antigene utilizzando il protocollo di dosaggio descritto nel paragrafo 5. Vengono mostrati i valori IFM delle curve di titolazione per S (A), RBD (B) e Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Figura 4: Determinazione della diluizione sierica ottimale e concentrazione del reagente di rilevamento. Otto campioni di siero, tra cui pazienti negativi (2 campioni) e da bassi ad alti positivi (6 campioni), sono stati testati a ulteriori diluizioni sieriche con tre diverse concentrazioni di reagenti di rilevamento. I risultati delle IFM sono mostrati per S (A), RBD (B) e Nc (C). Sulla base di questi e di altri dati (non mostrati), è stata selezionata una diluizione del campione di 1:2.000 e una concentrazione di anticorpi per il rilevamento della biotina di 0,62 μg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Figura 5: Ottimizzazione del test di neutralizzazione del singolo reporter. La modifica del singolo saggio sierologico reporter in un test di rilevamento degli anticorpi neutralizzanti è stata eseguita aggiungendo una fase di incubazione con ACE2 come concorrente, come descritto nella Sezione 6. Una serie di 11 campioni, che vanno dai sieri a titolo basso ad alto positivo, e un campione di siero a strisce IgG sono stati testati con una serie di diluizione doppia di ACE2 a partire da 4 μg / mL, utilizzando condizioni di dosaggio standard. In questo intervallo di concentrazioni di ACE2, si può vedere una diminuzione dell'IFM con un aumento di ACE2 per S (A) e RBD (B), ma non per Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Figura 6: Inibizione percentuale del segnale con ACE2. Vengono mostrati i segnali residui percentuali per il set di 11 campioni (dalla Figura 4). Per ogni campione, indipendentemente dal titolo IgG, è stata raggiunta una diminuzione massima del segnale MFI ≥30% per S (A) e RBD (B) alla massima concentrazione di ACE2. Per l'antigene Nc (C) non vi è stata alcuna inibizione significativa del segnale con qualsiasi quantità di ACE2 testata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Figura 7: Test di DyLight 405 anti-IgM come reagente di rilevamento IgM RP2. Una serie di 11 campioni e sieri spogliati di IgG sono stati utilizzati per testare l'anti-IgM coniugato DL 405 come reagente di rilevamento RP2. Vengono mostrati i segnali IFM IgM RP2 per S (A), RBD (B) e Nc (C). Il segnale MFI più alto per qualsiasi antigene con qualsiasi campione era di circa 140 unità MFI per RBD con campione H (B). Anche il segnale sul set di perle di controllo IgM era inferiore a 1.000 MFI nel canale RP2 su tutta la gamma di titoli anticorpali e non mostrava l'aumento della gamma dinamica osservata con l'anticorpo di rilevamento anti-IgM PE nel canale RP1 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Figura 8: Ottimizzazione di SASB come reporter RP2 con Biotina anti-IgG. Una serie di 11 campioni e sieri spogliati di IgG sono stati utilizzati per testare una serie di diluizione di SASB con lo standard 0,62 μg / mL biotina anti-IgG. Vengono mostrate le IFM IgG risultanti nel canale RP2 per S (A), RBD (B) e Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Figura 9: Confronto di tre diverse combinazioni di miscele di rilevamento RP1 IgM e RP1 IgG. Tre diverse miscele di anticorpi di rilevamento sono state testate su 11 campioni e sieri spogliati di IgG. Le combinazioni e le concentrazioni finali utilizzate sono descritte nella Tabella 1. Tutti i campioni sono stati testati con una diluizione ACE2 2 volte superiore, a partire da 16 μg/mL. Vengono mostrati i dati per i campioni presso DFSO di 3, 12 e 30 giorni. I segnali MFI per RP1 IgM (arancione) e RP2 IgG (blu) sono mostrati in A (DFSO 3), C (DFSO 12) ed E (DFSO 30). Le IFM residue ACE2% sono mostrate in B (DFSO 3), D (DFSO 12) e F (DFSO 30). I segnali che rappresentano una diminuzione del >30% rispetto a Nessun controllo ACE2 sono evidenziati in verde chiaro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un sistema di analisi di flusso per saggi multiplexati basati su perle che fornisce una lettura a due reporter è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi sierologici multiplex e di neutralizzazione degli anticorpi in grado di misurare contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM neutralizzanti per SARS-CoV-2.

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Per quanto ne s knowledge, questo è il primo esempio di un protocollo multiplexing basato su perle che utilizza due segnali reporter per misurare contemporaneamente due risultati per analita. Questa tecnica consente all'utente di misurare IgM e IgG antigene-specifiche allo stesso tempo, con meno campione e un tempo più breve per i risultati. Mentre questo metodo dual reporter è specifico per l'isotipizzazione degli anticorpi, potrebbe essere adattato per misurare altre coppie di analiti, come modifiche post-traduzionali o forme di farmaci liberi rispetto a quelli legati.A dimostrare la nostra procedura oggi abbiamo il Dr.Steve Angeloni, uno scienziato senior delle applicazioni sul campo per Luminex Corporation. Per iniziare il test sierologico IgG e IgM a doppio reporter, preparare le miscele di perle multiplex richieste dalle singole perle di coppia e controllare le scorte di perle ad una concentrazione di una volta 10 alle sei perle per millilitro. Quindi, diluire i campioni di siero di 100 volte aggiungendo 10 microlitri di siero a 990 microlitri di tampone PBS-TBN, quindi diluire i campioni di altre dieci volte aggiungendo 20 microlitri della diluizione 1:100 a 180 microlitri di PBS-TBN.Quando le miscele di perle e i campioni di siero sono pronti, aggiungere 50 microlitri delle miscele di perle multiplex ai pozzetti assegnati di una piastra microtiter non legante a 96 pozzetti, quindi aggiungere 50 microlitri dei campioni di siero diluito ai pozzetti appropriati. Una volta aggiunti tutti i campioni, coprire la piastra con un sigillo di lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastra riscaldata a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, separare le perle dalla miscela di reazione posizionando la piastra su un separatore di piastre magnetiche per due minuti.Mantenendo la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo della lamina. Quindi capovolgere con cura la piastra su un contenitore per i rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti. Mentre si tiene ancora la piastra sul magnete, asciugare la piastra su carta assorbente.Per lavare i pozzi di reazione, rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzo. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e incubare sullo shaker riscaldato per due minuti prima di rimetterlo sul magnete della piastra per altri due minuti. Mantenendo la piastra sul magnete, invertire la piastra per scartare il surnatante e tamponare la piastra su carta assorbente.Dopo il secondo lavaggio PBS-TBN, rimuovere la piastra dal magnete e aggiungere 100 microlitri di miscela fresca di reagente di rilevamento a ciascun pozzo. Dopo aver coperto la piastra con un sigillo di lamina micropiastra, posizionarla su uno shaker a piastra riscaldata per 15 minuti, quindi su un separatore di piastre magnetiche per due minuti. Mentre la piastra è sul magnete, scartare la miscela di reagenti di rilevamento invertendo la piastra su un contenitore di rifiuti e tamponandola su carta assorbente.Lavare i pozzi di reazione con PBS-TBN due volte come precedentemente dimostrato, quindi rimuovere la piastra dal magnete. Aggiungere 100 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzo, quindi coprire la piastra con guarnizione di alluminio e agitare per due minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere il sigillo della lamina e procedere alla lettura di 50 microlitri del campione da ciascun pozzo nell'analizzatore di flusso.Per leggere la piastra, selezionare il menu a discesa nell'angolo in alto a sinistra, passare a Configurazione piastra, caricare la piastra configurata in precedenza e selezionare Esegui piastra. Espellere il portapiasle selezionando l'icona Espelli, quindi caricare la piastra sul supporto piastre e selezionare l'icona Retract per ritrarre il portapiatti. Una volta che il supporto della piastra si è protratto nell'analizzatore, selezionare l'icona Esegui per iniziare a leggere la piastra.Per il test di neutralizzazione a doppio reporter, aggiungere 50 microlitri delle miscele di perle multiplex ai pozzetti assegnati di una piastra microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti, quindi aggiungere 25 microlitri di due microgrammi per millilitro ACE2 a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un sigillo di lamina. Dopo un'incubazione di due minuti su uno shaker a piastre riscaldate, aggiungere 25 microlitri di diluizioni sieriche 1:500 ai pozzetti assegnati. Una volta aggiunti tutti i campioni, eseguire le fasi di incubazione, lavaggio, rilevamento e analisi come precedentemente dimostrato per il test sierologico.Un test di anti-IgM coniugato al colorante reporter DyLight 405 utilizzando campioni di siero entro cinque-60 giorni dall'insorgenza dei sintomi e un campione di siero a striscia IgG non ha prodotto un segnale elevato per l'antigene spike. Per i campioni con un'elevata intensità di fluorescenza media IgM, sono stati osservati i segnali più alti per il dominio di legame del recettore e gli antigeni nucleocapsidi. Mentre il titolo IgM avrebbe dovuto essere elevato in alcuni campioni, i livelli di intensità di fluorescenza media osservati non superavano le 140 unità MFI.Inoltre, il perle di controllo per IgM mancava di un intervallo dinamico significativo per l'intensità mediana di fluorescenza quando si utilizzaVa DyLight 405 coniugato ad anti-IgM rispetto a un anti-IgM etichettato con ficoeritrina alla stessa concentrazione. Per il rilevamento di IgG, il coniugato viola brillante aveva segnali di intensità di fluorescenza mediana più elevati rispetto al coniugato di streptavicina del fluorforo Super Bright 436. Tuttavia, l'intensità del segnale per il coniugato viola brillante variava tra le titolazioni ACE2.Questa fluttuazione del segnale da parte del coniugato viola brillante attraverso le concentrazioni di ACE2 ha anche interferito nel determinare l'inibizione percentuale da parte di ACE2 attraverso la gamma di titoli IgG. Per il rilevamento di IgM, l'anti-IgM di ficoeritrina ha mostrato segnali più elevati di quelli generati da DyLight 549 IgM anti-umano. Durante la determinazione dell'inibizione ACE2% del legame IgM, c'era una leggera ma insignificante differenza tra i due reagenti di rilevamento IgM.Quindi uno dei passaggi più importanti della procedura è preparare il mix di perle multiplex dalle singole scorte di perle e assicurarsi di farlo correttamente. Quindi questa procedura può essere utilizzata anche per misurare l'efficacia dei vaccini e monitorare le risposte immunitarie ad altri agenti patogeni.

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Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

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