Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
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このレポートは、ルミネックス株式会社(テキサス州オースティン)が資金を提供しました。著者らは、マシュー・シルバーマン博士(バイオメディカル・パブリッシング・ソリューションズ、デルレイ・ビーチ、フロリダ州)に科学的編集支援を感謝している。

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

スティーブン・アンジェロニとシェリー・ダンバーは、この研究で使用された試薬や器具の一部を生産するLuminex Corporationの従業員です。この記事のオープンアクセス出版物は、ルミネックス株式会社が主催しました

本研究は、SARS-CoV-21による感染に対するIgG応答を定性的に評価する多重蛍光微小球アッセイ3Flexの機能を拡張した。COVID-19に関する多くの血清学的アッセイは単一の抗原を検出するが、このアッセイは同時にS、RBD、Nc抗原を評価し、内部抗体アイソタイプコントロール7を含む。さらに、ACE2はSARS-CoV-2に対する中和抗体力素を検出する指標として使用されています。
多抗原アッセイは、感染者とワクチン接種者の免疫応答を識別するために、将来的に特に有用である可能性があります。SARS-CoV-2では、S抗体とRBD抗体のみが評価されれば、これが過去の感染によるものなのか、ワクチン接種抗体反応によるものなのかを見分けることは不可能です。現在使用されているワクチンはいずれもNc抗原を標的としませんので、S/RBDおよびNc抗原を評価することで、過去のウイルス感染(Nc-およびS/RBD陽性)とワクチン接種応答(S/RBD陽性のみ)を区別することが可能です。nc-負)。
現在の研究では、3Flex血清学的および中和アッセイ(セクション5および6)を新しいデュアルレポーターフロー分析装置(セクション7および8)に移した。ビーズベースの多重アッセイに対する典型的な免疫アッセイプロトコルは、標準的なELISAプロトコルに類似しており、サンプルインキュベーション、検出抗体/レポーターインキュベーション、および結果8の分析に対する同等のステップに従う。これまでの研究では、標準的なELISAアッセイをビーズベースの多重化プラットフォーム9に転送する方法も実証されています。
テストサンプルとコントロールの結果が示すように、アッセイプロトコルは、前身の単一レポーター装置から新しいデュアルレポーターシステムにシームレスに転送できます(図4 および 図5)。血清学的アッセイでは、すべての陽性血清サンプルは、より高いサンプル希釈と低い検出抗体濃度の両方に対応するシグナルの特徴的な用量応答性低下を示したが、陰性サンプルのシグナルはバックグラウンドレベルにとどまった。同様に、中和アッセイについては、SおよびRBDのシグナルを減少させるが、Ncではないが、ACE2競合の濃度の増加に対応したのに対し、IgGストリップ血清はACE2の添加による影響をはるかに少なかった。血清サンプルの添加前に2分間ACE2でビーズをプレインキュベート(セクション6および8に記載)も、ACE2と血清とビーズを同時に組み合わせたものと比較し、結果にほとんど差を生じなかった(データは示さない)。しかし、ビーズ+ACE2プレインキュベーションステップで得られた結果はより一貫していたため、中和アッセイプロトコル(セクション6および8)に採用された最終手順であった。
デュアルレポーターシステムは2つ目の蛍光レポーターチャンネルを組み込むため、両方のアッセイをアイソタイピングアッセイに変換してIgG応答とIgM応答の両方を同時に測定しました。フローアナライザのデュアルレポーター機能により、各サンプルのマルチプレックス内の各分析物に対して2つのレポーター検出試薬から蛍光シグナルを収集することができ、アッセイでサンプルごとに生成されるデータを効果的に倍増させることができます。デュアルレポーターアッセイプロトコルの開発と最適化のために、いくつかの市販のレポーター色素と検出抗体を新しいRP2チャネルについて評価し、利用可能な最良の選択肢を決定しました。DL 405レポーター色素と共役した抗IgM抗体は、RP2チャネル(図7)では良好に機能しなかったので、SASBを有するビオチン抗IgGは、その後RP2チャネルで検出について評価された(図8)。RP1とRP2検出試薬の3つの組み合わせを、デュアルレポーター中和アッセイ(表1および図9)で比較し、IgGおよびIgM中和抗体の同時検出に最適な組み合わせを決定しました。PE-anti IgMを用いたRP1チャネルとDL549反IgMを用いたRP2チャネルの間の信号強度には大きな差があったが、ACE2による結合阻害率の測定には有意差はなかった。
現在の方法とこの研究にいくつかの制限が認められています。まず、試験し、メソッド開発と最適化で使用したサンプルは、8-11サンプルのセットに限定されました。より多くのサンプルは、メソッドが完全に最適化されていることを確認するために、拡張された研究でテストされます。第二に、限られた数のレポーターフルオロフォアとレポーターペアをテストした。すべての可能な組み合わせで利用可能なすべてのレポーターのさらなるテストは、この方法で正常に使用できる試薬を決定します。ビオチンにコンジュゲートされた抗IgG抗体は、BV421レポーターにコンジュゲートされた抗IgG抗体とは異なっていた。したがって、BV 421抗IgGのシグナル強度にはばらつきが存在していたが、抗体の特異性に起因する可能性があり、レポーター色素とは関係ない。他の利用可能なBV 421結合抗体を試験すると、RP2チャネルで良好に作用する別の抗体を同定する可能性があります。今後の研究では、RP1とRP2で検出するためのBV 421抗ヒトIgGとのPE抗IgMの組み合わせをそれぞれ評価します。最後に、装置のデュアルレポーター機能を有しても、アッセイは反応ごとに2つのアイソタイプ(2つのパラメータ)に制限される。追加のアイソタイプを測定するか、完全なアイソタイピングが望ましい場合は、同じ2つのレポーターチャンネルを使用して追加の反応を別々のウェルで実行する必要があります。
ビーズベースの多重化技術は、ルーチンの実験室のワークフロー3、4、10に簡単に実装して迅速かつ柔軟なアッセイ設計を可能にします。本研究では、SARS-CoV-2に関する前述の3Flex血清学的および中和アッセイを、単一のレポーターでIgGを測定するフロー分析システムに、またはわずかな修正を行って、2人のレポーターを用いてIgG応答とIgM応答の両方を同時に測定する容易性を実証した。デュアルレポーターオプションは、サンプルあたりの2倍のデータをサンプルボリュームの半分、反応ウェルの半分の数で提供できるため、単一のレポータープラットフォームよりも明確な利点があります。適切なレポーター色素と検出抗体を使用すると、アイソタイピングアッセイを簡単に開発し、デュアルレポーターフロー解析装置で実行できます。

COVID-19パンデミックは、SARS-CoV-2などの新しい病原体の診断と監視に使用できる高速で高スループットで高性能な血清学的検査を迅速に開発し、実施できることの重要性を強調しています。多重血清学的検査は、複数の抗原に対する抗体を同時に分析できるため、大流行において非常に有用であり、広範な病原体のカバレッジを提供し、生物のばらつきと感染に対する宿主の反応を制御します。多重蛍光ビーズベースアッセイの開発により、スパイク(S)タンパク質に対する抗体を検出できるSARS-CoV-2 IgG 3Flex(3Flex)、スパイクアンジオテンシン変換酵素-2(ACE2)受容体結合ドメイン(RBD)、およびSARS-CoV-2のヌクレオキャプシド(Nc)が最近報告された。3Flexは、症状発症から21日目 ≥に得られた血清に対するSARS-CoV-2 IgGアッセイに匹敵する性能を有することが示されたが、症状発症から≤5日で採取されたサンプルでより高い感度を有していた。さらに、中和アッセイ形式で可溶性ACE2を用いたSおよびRBD抗原に対する抗体結合の阻害が実証された。マルチプレックスビーズベースの技術は、多重血清学的検査のための実証済みの技術として広く採用されており、短時間から結果までの結果、小さなサンプル要件、および削減された労働2、3、4を含む大規模スクリーニングのための明確な利点を有する。
最近では、前作1で示したシステムと同じ高プレックス、ハイスループット能力を提供する新しいフロー分析計測器が利用可能になりましたが、2つのレポーターチャンネルの利点が追加されました。1つの反応で2つの蛍光レポーター信号を測定する能力は、各サンプルの検体当たり2つの結果の評価を可能にし、アイソタイピング用途に理想的であり、通常は別々の反応ウェル5で行う必要がある。デュアルレポーター機能は、サンプル量要件の半分の反応井戸の半分の2倍のデータをサンプルに提供するため、単一のレポーターシステムに対して明確な利点があります。本研究は、標準的な血清学的アッセイプロトコルを詳述し、中和アッセイへの適応について説明する。さらに、このレポートでは、単一レポーターアッセイをデュアルレポーター血清学的アッセイに変換し、その後、デュアルレポーター中和アッセイを使用して、IGGおよびIgMアイソタイプの両方の中和抗体を同時に測定する方法を説明しています。アッセイプロトコルの視覚的概要を 図1に示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19パンデミックは、SARS-CoV-2のような新しい病原体による感染の敏感で特異的な血清学的検出のための迅速なハイスループット方法の必要性を強調している。多重血清学的検査は、病原体のカバレッジを最適化する複数の抗原に対する抗体を同時に分析し、生物および個々の宿主応答の変動を制御することができるため、特に有用である可能性があります。ここでは、3つの主要なSARS-CoV-2抗原-スパイク(S)タンパク質、スパイクアンジオテンシン変換酵素-2(RB2)受容体結合ドメイン(RBD)、およびヌクレオキャプシド(Nc)に対するIgM抗体およびIgG抗体の両方を検出できるSARS-CoV-2-Plex蛍光微小球ベースのアッセイについて述べた。このアッセイは、症状発症から ≥21日目に得られた血清中のIgGのSARS-CoV-2基準アッセイに匹敵する性能を有することが示されたが、症状発症から≤5日で採取されたサンプルでより高い感受性を有していた。また、中和アッセイ形式で可溶性ACE2を用い、SおよびRBDに対する抗体結合の阻害が実証された。

単一レポーター血清学的アッセイの最適化。 すべてのSARS-CoV-2抗原の結合戦略は、キャメロン、ら、20201 および上記のステップ2.1に記載されている。カップリング確認のストラテジーは、上記のステップ2.3で説明します。効率的なカップリングのために、蛍光強度の中央値(MFI)値は、無血清/抗体非陰性対照反応よりも有意に高く、検出試薬量の減少に伴うMFIシグナルの低下の用量応答を示すべきである。約1,000 MFI単位以上のMFI単位のMFIは、一般的に効率的なタンパク質結合を示し、使用される検出試薬の濃度および特異性に依存する。この方法を用いて、S、RBD、Nc抗原結合の確認を2ロットのビーズについて試験した(図2)。全ての抗原に対するMFIシグナルは、バックグラウンドMFIより有意に高く、検出試薬の滴定による用量応答を示した。データはまた、結合ビーズの2つの異なるロット間のMFIレベルの良好な再現性を示した。
単一のレポーターアッセイの最適化は、キャメロン、他、20201.各抗原は、高、中、低、および陰性のサンプルを表すいくつかの血清サンプルの異なる希釈を有する異なる結合濃度で試験した。また、アッセイはIgGの測定用のIgGの測定を行うので、IgG剥がされた血清を追加の陰性試料として用いた。異なる抗原結合レベルを有する代表的なサンプル希釈系列の結果を図3に示す。この初期希釈シリーズは、代表的な抗原特異的およびバックグラウンドMFIレベルの潜在的範囲を得るために、検出試薬の固定濃度で試験された。これらのデータから、追加サンプル希釈範囲および抗原結合レベルを決定し、さらに追加サンプルで試験した(データは示されていない)。
次に、検出試薬の濃度を、異なる血清希釈および抗原結合レベルとの併用に最適化した。6 つの正と 2 つの負のサンプルを使用した代表的なデータを 図 4に示します。数百の陰性前COVID-19血清サンプルを用いた追加の試験の後、最終最適抗原結合レベルおよび検出摂起濃度を最終アッセイプロトコルに選択した。
単一レポーター中和アッセイへの転換 血清サンプルを添加する前に、ACE2(競合試薬として)を用いたインキュベーションステップを添加することにより、単一レポーター血清学的アッセイを中和アッセイに変換した。ACE2添加量を計数することにより、 図5に示すようにS抗原およびRBD抗原へのIgG結合の阻害が認められた。11人の患者セラはIgGの異なる力素を有していたが、それぞれACE2濃度の増加に伴ってMFIシグナルの有意な減少を示した。予想通り、ACE2はSおよびRBDのMFI信号にのみ影響を与えますが、Nc抗原には影響しません。
全サンプルの0 μg/mL ACE2 に対する MFI 残存率のパーセントを 図6に示します。ほとんどのサンプルでは、ACE2濃度の上昇に伴い、SおよびRBDに対してシグナル損失>30%が認められた。予想通り、NC信号にACE2の影響はなかった。
デュアルレポーターIgGとIgM血清学的アッセイへの転換 デュアルレポーターIgGおよびIgMアッセイでは、2つのレポーターチャネルの異なる抗体とレポーターの組み合わせをテストするために、標準的な単一のレポーターアッセイ条件を使用しました。RP1チャネルは、PEなどのレポーター色素の「オレンジ色」蛍光を検出した以前のフロー分析機器に似ています。第2チャネルRP2は、421-441 nm範囲の発光スペクトルピークを有する402nmで励起された色素の「青」蛍光を検出するために使用できる紫色励起レーザーを採用しています。
いくつかの異なる抗ヒトIgGおよびIgM抗体の組み合わせは、セクション6で詳述された標準的な2,000倍のサンプル希釈およびインキュベーション条件で様々な濃度で試験された。RP2チャネルに対するDyLight 405レポーター色素(DL 405;400nmでの励起および420nmでの放出)に結合した抗IgMの初期試験を、5〜>60日のDFSOを有する11個のPCR陽性サンプルとIgG-剥離血清サンプルを用いて実施した。この検出試薬は、図7A、B、Cに示すように、RP2チャネルに高い信号を生成しなかった。高いIgM RP2 MFIを有するサンプルでは、RBDおよびNc(図7B,C)に対して最も高い信号が見られた。IgMの気座は、この時点で一部のサンプルでは上昇する必要がありますが、観察されたMFIレベルはIgM検出試薬で140 MFI単位を超えませんでした。さらに、IgM用のコントロールビーズは、同じ濃度で使用されるPE標識アンチIgM RP1レポーターと比較して、反IgMに結合したDL 405を使用する場合のMFIに対する有意なダイナミックレンジを欠いていた(図7D)。
IgM用の適切なRP2レポーター標識検出試薬が利用できなかったため、SASBを用いた元のビオチン抗IgGをRP2チャネルで使用するための試験を行った。SASB を使用した RP2 チャネルの IgG の信号は、SAPE と同じダイナミック レンジを持っていませんが、S、RBD、Nc の IgG 力価を測定するのに適した範囲を持っていました (図 8)。これらのデータは、以下に説明するように、異なるRP1 IgMおよびRP2 IgG検出試薬の組み合わせをテストすることにつながりました。
デュアルレポーター中和アッセイへの転換 二重レポーター血清学的アッセイは、血清サンプルを添加する前に、ACE2およびビーズでインキュベーションステップを添加することによって中和アッセイに変換された。16 μg/mlから始まるACE2の2倍希釈シリーズを使用し、上記のように11サンプルのセットとセラを剥ぎ取った。さらに、RP1 IgMとRP2 IgG検出抗体ミックスの3つの異なる組み合わせが11サンプルのセットでテストされ、血清制御が除去されました。最適と判断された最終的な組み合わせと試薬濃度を 表1に詳述する。
IgG検出では、元の単一レポーターアッセイで使用されたビオチン抗ヒトIgG/SASBを、BVレポーター色素に結合した別の反IgGと共に試験した。BVコンジュゲートは高いRP2 MFI信号を持っていましたが、IgG滴定のMFI信号強度はACE2滴定にまたがって変化しました(図9A、C、E)。ビオチン抗ヒトIgG/SASBの組み合わせは、BVコンジュゲートと比較してACE2滴定全体でより一貫したMFIシグナル減少を示し、MFIレベルは低かったが用量応答を示した。ACE2濃度にわたるBVコンジュゲートによる信号変動はまた、ビオチン抗ヒトIgG/SASBの組み合わせと比較してIgG価の範囲にわたるACE2による阻害率を決定することを妨げた(図9B、D、F)。DFSO 3 サンプルのような低い MFI 信号を持つサンプルは、これらの試薬の性能を評価したり、IgG 中和能力を測定するのに十分な高力価を持っていません。
RP1チャネルにおけるIgMの測定のために、PE共役型反IgMをDyLight 549レポーター色素に結合した抗ヒトIgM(DL 549;562nmで励起し、576nmで放出する)と比較した。これら2つの試薬のうち、PE抗IgMは、テストしたサンプルに対してDL 549抗ヒトIgMによって生成されたものよりも高いMFIを表示した(図9A、C、E)。これらの試薬の添加を測定するIgMコントロールビーズは、PE抗IgMに対して≈17,000、DL 549コンジュゲートに対して2,723の異なる平均MFIを有していた。これらの違いがあっても、MFIに対する様々なACE2濃度の影響は、DL 549コンジュゲートで測定可能であった。IgM結合のACE2%阻害を決定するために、2つのIgM検出試薬の間にわずかな有意な差があった(図9B、D、F)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">コンビネーション</td>
			<td rowspan="2">記者</td>
			<td colspan="2">ウェルでの最終濃度(μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PEアンチIgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ビオチン-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>サスブ</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>ダイライト 549 抗ヒト IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ブリリアントバイオレット421抗ヒトIgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>ダイライト 549 抗ヒト IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ビオチン-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>サスブ</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:RP1とRP2レポーターの色素の組み合わせがテストされたリスト。IgGおよびIgMの測定用に、いくつかの異なるRP1およびRP2レポーター色素を評価した。上記の3つの組み合わせは、異なるRP1検出モードで、および中和アッセイの最適化のために試験した。SASBを用いたRP2の組み合わせについて、ビオチン化検出抗体およびSASBの濃度が示されている。*最終濃度は、反応ウェルの最終濃度を表します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> 図1:主要なアッセイプロトコルステップを強調するフローチャート <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> 図2:抗原結合の確認 抗原は100、10および1 pmol/106 ビーズで結合した。SおよびRBD抗原については、ウサギの抗Sセラを使用し、PE抗ウサギIgGで検出した。Ncの場合、プロテインG精製ウサギポリクローナル抗Ncが使用された。10 pmol S(A)、100pmol RBD(B)、および 100 pmol Nc (C) と結合したビーズの滴定曲線を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> 図3:異なる抗原結合レベルでの血清希釈の最適化 高、中、低、および陰性のサンプルを表す血清サンプルを、異なるpmol抗原/106 ビーズカップリングで試験した。4倍の血清滴定を、セクション5に記載されたアッセイプロトコルを用いて、抗原結合ビーズのマルチプレックスミックスで試験した。S (A)、RBD(B)、Nc(C) の滴定曲線の MFI 値を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> 図4: 最適な血清希釈および検出試薬濃度の測定 陰性患者(2サンプル)および低陽性から高陽性(6サンプル)を含む8つの血清サンプルを、3つの異なる検出試薬濃度を有する追加の血清希釈液で試験した。MFI の結果は、S (A) 、 RBD (B) および Nc (C) に対して表示されます。これらおよび他のデータ(図示せず)に基づいて、1:2,000のサンプル希釈と0.62μg/mLのビオチン検出抗体濃度を選択した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> 図5:単一レポーター中和アッセイの最適化中和抗体検出アッセイに対する単一レポーター血清学的アッセイの改変は、セクション6に記載されているように、競合者としてACE2とのインキュベーションステップを加えることによって行った。低陽性から高陽性の価数のサイターseraに至るまでの11サンプルのセットとIgGストライプの血清サンプルを、標準的なアッセイ条件を使用して、4 μg/mLから始まるACE2の2倍希釈シリーズで試験しました。ACE2濃度のこの範囲にわたって、MFIの減少は、S(A)およびRBD(B)の増加したACE2で見ることができますが、Nc(C)については見られません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> 図6:ACE2によるシグナルの阻害率11個のサンプルのセットに対するパーセント残差信号(図4)を示します。各サンプルについて、IgGの測定器に関係なく、最高ACE2濃度のS(A)およびRBD(B)に対して≥30%MFIシグナルの最大減少が達成された。Nc抗原(C)については、ACE2の任意の量をテストしたシグナルの有意な阻害はなかった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> 図7: RP2 IgM検出試薬としてのDyLight 405抗IgMの試験11サンプルとIgGストリップセラのセットを使用して、DL 405結合抗IgMをRP2検出試薬として試験しました。S (A)、RBD(B)、Nc(C)のRP2 IgM MFI信号を示します。任意のサンプルを有する任意の抗原の最高のMFI信号は、サンプルH(B)を有するRBDのための約140 MFI単位であった。IgMコントロールビーズセット上のシグナルも、抗体価範囲全体にわたってRP2チャネル中の1,000MFI未満であり、RP1チャネル(D)においてPE抗IgM検出抗体で観察されたダイナミックレンジの増加を示さなかった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> 図8: ビオチン反IgGによるRP2レポーターとしてのSASBの最適化11個のサンプルとIgGストリップセラのセットを使用して、標準の0.62 μg/mLビオチン抗IgGを用いた希釈系のSASBを試験しました。結果として得られた IgG MFI は、S(A)、RBD(B)、Nc(C) の RP2 チャネルに表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> 図9:RP1 IgMとRP1 IgG検出ミックスの3つの異なる組み合わせの比較3つの異なる検出抗体ミックスを11個のサンプルとIgG剥離セラで試験した。使用される組み合わせと最終濃度は、表1に記載されています。すべてのサンプルは、16 μg/mLから始まる2倍のACE2希釈液で試験しました。3、12、および 30 日の DFSO でのサンプルのデータが示されています。RP1 IgM(オレンジ)およびRP2 IgG(青)のMFI信号は、A(DFSO 3)、C(DFSO 12)、およびE(DFSO 30)で示されています。 ACE2 パーセント残余 MFI は、B (DFSO 3)、D (DFSO 12)、およびF (DFSO 30) に示されています。 ACE2 コントロールなしと比較して>30%減少を表す信号は、ライトグリーンでハイライト表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

私たちの知る限りでは、これは2つのレポーター信号を使用して同時に1つの検数法ごとに2つの結果を測定するビーズベースの多重化プロトコルの最初の例です。この技術により、抗原特異的IgMとIgGを同時に測定することができ、サンプルの数が少なく、結果までの時間が短くなります。このデュアルレポーター法は抗体アイソタイピングに特異的であるが、翻訳後修飾や自由結合薬物形態などの他の分析対象の対を測定するように適応することができる。今日の手順をデモンストレーションすると、Luminex Corporationのシニアフィールドアプリケーションサイエンティストであるスティーブ・アンジェロニ博士が参加しています。デュアルレポーターIgGとIgM血清学的アッセイを開始するには、個々のカップルビーズから必要なマルチプレックスビーズミックスを調製し、1ミリリットル当たり6個のビーズに1倍の濃度でビーズストックを制御します。次に、血清サンプルを10マイクロリットルのPBS-TBNバッファーの990マイクロリットルに加えて100倍希釈し、1:100希釈の20マイクロリットルをPBS-TBNの180マイクロリットルに加えてさらに10倍に希釈します。ビーズミックスと血清サンプルの準備ができたら、96ウェル非結合マイクロタイタープレートの割り当てられた井戸に多重ビーズミックスの50マイクロリットルを追加し、希釈された血清サンプルの50マイクロリットルを適切なウェルに追加します。すべてのサンプルを追加したら、マイクロプレートホイルシールでプレートを覆い、加熱プレートシェーカーで37°Cで15分間インキュベートします。次いで、2分間の磁気プレート分離器にプレートを置くことによって反応混合物からビーズを分離する。プレートを磁石の上に置いたままにして、ホイルシールを取り外します。その後、慎重に廃棄物容器の上にプレートを反転し、穏やかに井戸から上清をフリック。磁石の上にプレートを保持したまま、吸収性の紙にプレートをブロットします。反応ウェルを洗浄するには、プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150マイクロリットルのPBS-TBNを加えます。新鮮なホイルシールでプレートを覆い、加熱されたシェーカーで2分間インキュベートしてから、さらに2分間プレートマグネットに戻します。磁石の上にプレートを保持しながら、上清を捨てるプレートを反転し、吸収性の紙にプレートをブロットします。2回目のPBS-TBN洗浄後、磁石からプレートを取り出し、各ウェルに新鮮な検出試薬ミックスの100マイクロリットルを加えます。プレートをマイクロプレートホイルシールで覆った後、加熱プレートシェーカーの上に15分間置き、次いで磁気プレートセパレータに2分間置きます。プレートが磁石の上にある間、廃容器の上にプレートを反転させ、吸収性紙に吸い込んで検出試薬ミックスを捨てます。前に実証された2回PBS-TBNで反応ウェルを洗浄し、磁石からプレートを取り除きます。各井戸にPBS-TBNの100マイクロリットルを追加し、ホイルシールでプレートを覆い、37°Cで2分間振ります。ホイルシールを取り外し、フローアナライザ内の各ウェルからサンプルの50マイクロリットルを読み取るに進みます。プレートを読み込むには、左上隅のドロップダウン メニューを選択し、[プレート構成]に移動して、以前に設定したプレートをロードして、[プレートを実行]を選択します。イジェクト アイコンを選択してプレート キャリアを取り出し、プレートキャリアにプレートをロードし、プレートキャリアを引き込むには、リトラクト アイコンを選択します。プレートキャリアがアナライザーに長引いたら、[実行]アイコンを選択してプレートの読み取りを開始します。デュアルレポーター中和アッセイの場合は、96ウェル非結合マイクロタイタープレートの割り当てられた井戸に多重ビーズミックスの50マイクロリットルを追加し、各ウェルに1ミリリットルACE2あたり2マイクログラムの25マイクロリットルを追加し、ホイルシールでプレートを覆います。加熱プレートシェーカーで2分間のインキュベーションの後、割り当てられたウェルに25マイクロリットルの1:500血清希釈液を加えます。すべてのサンプルを追加したら、血清学的アッセイで既に示したようにインキュベーション、洗浄、検出、および分析のステップを実行します。症状発症から5~60日以内に血清サンプルを用いてDyLight 405レポーター色素に結合した抗IgMの試験と、IgGストリップ血清サンプルはスパイク抗原に対して高いシグナルを生成しなかった。高いIgM培地蛍光強度のサンプルでは、受容体結合ドメインおよびヌクレオキャプシド抗原に対して最も高いシグナルが見られた。IgM価価は一部のサンプルで上昇しているはずですが、観察された中蛍光強度レベルは140 MFI単位を超えませんでした。さらに、IgMの対照ビーズは、同じ濃度で標識されたフィコエリスリンと比較して、抗IgMにコンジュゲートされたDyLight 405を使用する場合の蛍光強度の中央値に対して有意なダイナミックレンジを欠いていた。IgG検出の場合、ブリリアントバイオレットコンジュゲートは、フルオルフォアスーパーブライト436のストレプトアビジンコンジュゲートよりも高い中央値蛍光強度信号を有していた。しかし、華麗なバイオレット共役の信号強度はACE2滴定にまたがって変化した。このACE2濃度にわたるブリリアントバイオレット共役によるこの信号変動は、IgG価の範囲にわたるACE2による阻害率を決定する際にも干渉した。IgM検出では、フィコエリスリン抗IgMはDyLight 549抗ヒトIgMによって生成されたものよりも高い信号を表示しました。IgM結合のACE2パーセント阻害を決定する一方で、2つのIgM検出試薬の間にわずかな有意差があった。したがって、手順の最も重要なステップの1つは、個々のビーズ株からマルチプレックスビーズミックスを準備し、それを正しく行う必要があります。したがって、この手順は、ワクチンの有効性を測定し、他の病原体に対する免疫応答を同様に監視するためにも使用することができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

狂犬病間接蛍光抗体検査を用いた狂犬病IgGおよびIgM抗体の検出

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...