Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

이 보고서는 루미넥스 코퍼레이션(오스틴, 텍사스)이 지원했습니다. 저자는 과학적 편집 지원을 매튜 실버먼 박사 (생물 의학 출판 솔루션, 델레이 비치, 플로리다)에 감사드립니다.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

스티븐 안젤로니와 셰리 던바는 루미넥스 코퍼레이션의 직원으로, 이 연구에서 사용된 시약과 계측기의 일부를 생산하고 있습니다. 이 기사의 오픈 액세스 출판은 루미넥스 (Luminex) 회사가 후원했습니다.

이 연구는 SARS-CoV-21에의한 감염에 대한 IgG 반응을 질적으로 평가하는 멀티플렉스 형광 마이크로스피어 분석3Flex의 기능을 확장시켰다. COVID-19에 대한 많은 혈청 분석이 단일 항원검출을 감지하지만, 이 분석은 동시에 S, RBD 및 Nc 항원을 평가하고 내부 항체 동형 대조군7을포함한다. 또한, ACE2는 SARS-CoV-2로 의 중화 항체 티터를 검출하기 위한 지표로서 사용된다.
다중 항원 세포는 감염되고 예방 접종된 사람 사이 면역 반응을 차별하기 위한 미래에 특히 유용할 수 있습니다. SARS-CoV-2를 사용하면 S 및 RBD 항체만 평가하면 과거 감염 또는 예방 접종 항체 반응 때문인지 여부를 분별하는 것은 불가능합니다. 현재 사용 중인 백신 중 어느 것도 Nc 항원을 표적으로 하지 않으므로 S/RBD 및 Nc 항원을 평가하여 과거 바이러스 감염(Nc-및 S/RBD 양성)을 백신 접종 반응(S/RBD 양성만)과 구별할 수 있습니다. Nc-네거티브).
현재 연구에서는, 3Flex 서론및 중화 분석(섹션 5 및 6)이 새로운 이중 리포터 흐름 분석 기기(섹션 7 및 8)로 옮겨졌다. 비드 기반 멀티플렉스 분석용 전형적인 면역분석 프로토콜은 샘플 배양, 검출 항체/리포터 인큐베이션 및 결과분석(8)에대한 유사한 단계에 따라 표준 ELISA 프로토콜과 유사하다. 이전 연구는 또한 표준 ELISA 에세이가 구드 기반 멀티플렉싱 플랫폼9로전송될 수 있는 방법을 입증했습니다.
분석 프로토콜은 시험 샘플 및제어(도 4 및 도 5)에대해 얻은 결과에 의해 나타난 바와 같이 전작 단일 리포터 기기에서 새로운 이중 리포터 시스템으로 원활하게 전송될 수 있다. 세로지학적 분석에서, 모든 양성 혈청 샘플은 더 높은 시료 희석과 더 낮은 검출 항체 농도 모두에 대응하는 신호의 특징적인 투여 반응 감소를 입증한 반면, 음의 샘플에 대한 신호는 배경 수준에 머물렀다. 마찬가지로, 중화 분석의 경우, S와 RBD에 대한 신호 감소, 하지만 Nc, ACE2 경쟁자의 농도 증가에 대응하는 반면, IgG 박탈 혈청은 ACE2의 첨가에 의해 훨씬 덜 영향을 받았다. 혈청 시료를 첨가하기 전에 2분 동안 ACE2로 구슬을 사전 배양하여(섹션 6 과 8에 설명된 바와 같이), 또한 구슬을 ACE2 및 혈청과 동시에 결합하는 것과 비교하여 결과에 거의 차이가 없는 결과를 생성하였다(데이터는 도시되지 않음). 그러나, 구슬 플러스 ACE2 사전 배양 단계로 얻은 결과가 더 일관되었기 때문에 중화 분석 프로토콜(섹션 6 및 8)에 채택된 최종 절차였다.
이중 기자 시스템은 두 번째 형광 기자 채널을 통합하기 때문에 두 가지 아사약이 Isotyping assays로 변환되어 IgG와 IgM 응답을 동시에 측정했습니다. 유량 분석기의 이중 리포터 기능을 사용하면 각 샘플에 대한 멀티플렉스의 각 분석물의 각 분석체에 대한 두 개의 리포터 검출 시약으로부터 형광 신호의 수집을 허용하여 분석에서 샘플당 생성된 데이터를 효과적으로 두 배로 늘릴 수 있습니다. 이중 기자 분석 프로토콜의 개발 및 최적화를 위해, 여러 시판 되는 리포터 염료 및 검출 항체는 새로운 RP2채널(도 7 및 도 8)에대해 평가되어 사용 가능한 최선의 옵션을 결정하였다. DL 405 리포터 염료와 결합된 항-IgM 항체는 RP2 채널(도7)에서잘 수행되지 않았기 때문에 SASB를 가진 비오틴 안티-IgG는 이후 RP2 채널(도8)에서검출을 평가하였다. RP1 및 RP2 검출 시약의 3개의 조합은 이중 리포터 중화분석(표 1 및 도 9)에서비교하여 IgG 및 IgM 중화 항체의 동시 검출을 위한 최상의 성능 조합을 결정하였다. PE-anti IgM을 이용한 RP1 채널과 DL 549 안티-IgM을 이용한 RP2 채널 간의 신호 강도에는 상당한 차이가 있었지만, ACE2에 의한 퍼센트 결합 억제측정에는 큰 차이가 없었다.
현재 방법과이 연구에 몇 가지 제한이 인정됩니다. 먼저, 시험 및 방법 개발 및 최적화에 사용되는 샘플은 8-11 샘플 세트로 제한되었다. 확장된 연구에서 더 많은 샘플을 테스트하여 방법이 완전히 최적화되었는지 확인합니다. 둘째, 제한된 수의 기자 형광과 기자 쌍이 테스트되었습니다. 가능한 모든 조합에서 사용 가능한 모든 리포터를 추가로 테스트하면 이 방법으로 성공적으로 사용할 수 있는 시약을 결정합니다. 바이오틴에 공주된 안티-IgG 항체는 BV 421 리포터에게 공주된 안티-IgG 항체와 달랐다. 따라서 BV 421 항-IgG에 대한 신호 강도의 가변성이 존재하지만, 항체의 특이성 및 리포터 염료와 관련이 없을 수 있다. 다른 사용 가능한 BV 421-공주 항체를 테스트하면 RP2 채널에서 잘 수행될 다른 항체를 식별할 수 있다. 향후 연구는 또한 RP1 및 RP2에서 검출을 위해 BV 421 항인간 IgG와 PE 안티-IgM의 조합을 평가할 것입니다. 마지막으로, 기기의 이중 리포터 능력에도 불구하고, 분석은 반응당 2개의 등형(2개의 매개변수)으로 제한됩니다. 추가 동종형을 측정하거나 전체 isotyping이 원하는 경우 동일한 두 리포터 채널을 사용하는 추가 반응을 별도의 우물에서 실행해야 합니다.
비드 기반 멀티플렉싱 기술을 통해 일상적인 실험실 워크플로우3,4,10에쉽게 구현할 수 있는 빠르고 유연한 분석 설계를 수행할 수 있습니다. 이 연구는 SARS-CoV-2에 대한 이전에 설명된 3Flex 세로지학적 및 중화 분석을 단일 리포터로 IgG를 측정하기 위한 유량 분석 시스템으로 옮기거나, 약간의 수정으로 두 명의 기자를 사용하여 IgG 및 IgM 응답을 모두 측정하는 용이함을 입증했습니다. 듀얼 리포터 옵션은 샘플 당 두 배의 데이터를 제공 할 수 있기 때문에 단일 리포터 플랫폼에 비해 명확한 장점이 있습니다. 적절한 리포터 염료 및 검출 항체를 통해 이중 리포터 유량 분석 기기에서 이소타이핑 분석분석을 쉽게 개발하고 수행할 수 있다.

COVID-19 전염병은 SARS-CoV-2와 같은 새로운 병원균의 진단 및 감시에 사용할 수 있는 빠른 고처리량, 고성능 혈청 학적 검사를 신속하게 개발하고 구현할 수 있다는 중요성을 강조했습니다. 멀티플렉스 혈청 학적 테스트는 동시에 유기체및 감염에 대한 숙주 반응에 대한 광범위한 병원균 적용 및 제어를 제공하는 여러 항원으로 항체를 동시에 분석 할 수 있기 때문에 전염병에서 매우 유용 할 수 있습니다. 다중형 비드 계 분석, SARS-CoV-2 IgG 3Flex(3Flex)의 개발, 즉 스파이크(S) 단백질, 스파이크 안지오텐신-변환 효소-2(ACE2) 수용체 결합 도메인(RBD), 및 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드(NC)를 검출할 수 있는것으로 최근 1보고되었다. 3Flex는 증상 발병후 ≥21일 이내에 얻은 혈청에 대한 SARS-CoV-2 IgG 분석과 유사한 성능을 보였지만 증상 발병으로부터 ≤5일 이내에 수집된 샘플로 더 높은 감도를 보였다. 또한, 중화 분석 형식으로 용용 ACE2를 사용하는 S 및 RBD 항원용 항체 결합억제가 입증되었다. 멀티플렉스 비드 기반 기술은 멀티플렉스 세로지학적 테스트를 위한 입증된 기술로 널리 채택되었으며 짧은 결과, 작은 샘플 요구 사항 및 저노동2,3,4를포함한 대규모 스크리닝에 뚜렷한 장점이 있다.
최근에는 이전 작업1에서입증된 시스템의 동일한 하이플렉스, 높은 처리량 기능을 제공하지만 두 리포터 채널의 추가 이점을 제공하는 새로운 유동 분석 기기가 출시되었습니다. 단일 반응에서 두 개의 형광 기자 신호를 측정하는 능력은 각 샘플에 대한 별화당 두 가지 결과를 평가할 수 있으며 일반적으로 별도의 반응 웰5에서수행해야 하는 이소타이핑 응용 분야에 이상적입니다. 이중 리포터 기능은 샘플 볼륨 요구량의 절반으로 각 샘플의 두 배의 데이터를 제공하므로 단일 리포터 시스템에 비해 명확한 이점이 있습니다. 이 연구는 표준 서학적 분석 프로토콜을 자세히 설명하고 중화 분석에 대한 적응을 설명합니다. 또한, 이 보고서는 단일 기자 분석의 이중 기자 분석체를 이중 기자 종양 분석으로 변환한 후, 이중 기자 중화 분석, SARS-CoV-2 S, RBD 및 Nc 항원에 대한 IgG 및 IgM 등산화 항체의 중화를 동시에 측정한다. 분석 프로토콜의 시각적 개요는 그림 1에서제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19 전염병은 SARS-CoV-2와 같은 새로운 병원체를 가진 감염의 민감하고 특정 혈청학적 검출을 위한 신속한 고처리방법의 필요성을 강조하고 있다. 멀티플렉스 세로지학적 검사는 병원체 커버리지를 최적화하는 여러 항원에게 항체를 동시에 분석하고 유기체 및 개별 숙주 반응의 가변성을 조절할 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 여기서 우리는 3개의 주요 SARS-CoV-2 항원-스파이크 (S) 단백질, 스파이크 안지오텐신 변환 효소-2 (ACE2) 수용체 결합 도메인 (RBD), 및 뉴클레오캡 (NCD)에 IgM과 IgG 항체 둘 다 검출할 수 있는 SARS-CoV-2 IgG 3-플렉스 형광 마이크로스피어 기지를 둔 분석체를 기술합니다. 분석은 증상 발병으로부터 ≥21일 에서 얻은 혈청에서 IgG에 대한 SARS-CoV-2 참조 분석과 유사한 성능을 보였지만 증상 발병으로부터 ≤5일 이내에 수집된 샘플로 더 높은 감도를 보였다. 또한, 중화 분석 형식으로 용용 성 ACE2를 사용하여, 항체 결합의 억제는 S 및 RBD에 대해 입증되었다.

단일 기자 세로지컬 분석의 최적화. 모든 SARS-CoV-2 항원을 위한 결합 전략은 카메론, 외, 20201 및 2.1 단계에서 위에서 설명된다. 커플링 확인 전략은 위의 2.3 단계에서 설명됩니다. 효율적인 커플링의 경우, 중앙형광 강도(MFI) 값은 혈청/무항체 음성 제어 반응보다 현저히 높어야 하며 검출 시약의 양이 감소하는 MFI 신호 감소의 용량 반응을 보여줘야 한다. 약 1,000MFI 단위 이상의 MFI는 일반적으로 효율적인 단백질 커플링을 나타내며 사용되는 검출 시약의 농도 및 특이성에 의존한다. 이 방법을 사용하여, S, RBD 및 Nc 항원 커플링의 확인은 구슬의 두 제비(그림 2)에대한 테스트되었다. 모든 항원을 위한 MFI 신호는 배경 MFI보다 현저히 높았으며 검출 시약의 적정을 통해 투여 반응을 보였다. 데이터는 또한 결합된 구슬의 두 개의 다른 제비 사이 MFI 수준의 좋은 재현성을 보여주었습니다.
단일 리포터 분석의 최적화는 카메론, 등, 20201에설명된 대로 수행되었다. 각 항원들은 높은, 중간, 낮음 및 음의 샘플을 나타내는 여러 혈청 샘플의 상이한 희석과 다른 결합 농도에서 시험되었다. 또한, 분석이 IgG 티터를 측정하기 때문에, IgG-박탈된 혈청을 추가 음수 샘플로 사용되었다. 상이한 항원 커플링 수준을 가진 대표적인 샘플 희석 계열의 결과는 도 3에도시된다. 이 초기 희석 계열은 대표적인 항원 특이적 및 배경 MFI 수준의 잠재적 범위를 얻기 위해 검출 시약의 고정 농도로 테스트되었습니다. 이러한 데이터로부터, 추가 시료 희석 범위 및 항원 커플링 수준은 추가 샘플(도시되지 않은 데이터)을 통해 추가 적인 샘플로 결정되고 더 테스트하였다.
다음으로, 검출 시약의 농도는 상이한 혈청 희석제 및 항원 커플링 수준으로 사용하기 위해 최적화되었다. 6개의 양수 및 2개의 음수 샘플을 이용한 대표적인 데이터는 도 4에도시된다. 수백 개의 음수 사전 COVID-19 혈청 샘플로 추가 테스트를 거친 후, 최종 최적의 항원 커플링 수준 및 검출 리젠트 농도가 섹션 5에 설명된 바와 같이 최종 분석 프로토콜에 대해 선택되었다.
단일 리포터 중화 분석으로 전환 단일 리포터 의 혈청 분석체를 중화 분석으로 변환하여 혈청 샘플을 첨가하기 전에 비즈와 함께 ACE2(경쟁 시약로서)를 사용하여 인큐베이션 단계를 추가하여 달성하였다. ACE2 첨가물의 양을 적시시킴으로써, 도 5에도시된 바와 같이, S 및 RBD 항원에 대한 IgG 결합의 억제가 관찰되었다. 11 명의 환자 세라가 IgG의 다른 티터를 가지고 있었지만, 각각 ACE2 농도가 증가함에 따라 MFI 신호가 현저한 감소를 보였습니다. 예상대로 ACE2는 S와 RBD의 MFI 신호에만 영향을 미치지만 Nc 항원은 영향을 미치지 않습니다.
모든 샘플에 대해 0 μg/mL ACE2를 기준으로 백분율 잔류 MFI 신호가 도 6에도시된다. 대부분의 시료의 경우, S및 RBD에 대해 신호 손실 >30%가 관찰되었으며 ACE2 농도가 증가하였다. 예상대로 NC 신호에 ACE2의 영향은 없었다.
이중 기자 IgG와 IgM 세로지컬 분석으로 전환 이중 기자 IgG와 IgM 분석의 경우, 표준 단일 기자 분석 조건은 두 리포터 채널에 대해 상이한 항체 및 기자 조합을 테스트하는 데 사용되었습니다. RP1 채널은 PE와 같은 리포터 염료에 대한 "주황색" 형광을 감지한 이전 유량 분석 기기와 유사합니다. 두 번째 채널인 RP2는 421-441 nm 범위에서 배출 스펙트럼 피크가 있는 402 nm에서 흥분되는 염료의 "파란색" 형광을 감지하는 데 사용할 수 있는 바이올렛 여기 레이저를 사용합니다.
몇몇 다른 항인간 IgG 및 IgM 항체 조합은 섹션 6에 상세한 표준 2,000 배 견본 희석 및 잠복 조건을 가진 각종 농도에서 시험되었습니다. RP2 채널용 DyLight 405 리포터 염료(DL 405; 400 nm에서 의 흥분 및 420 nm에서 배출)에 접합된 안티 IgM의 초기 테스트는 DFSO가 5일에서 >60일까지 11개의 PCR 양성 샘플 세트를 사용하여 수행되었으며, IgG-박탈 된 스럼 샘플. 이 검출 시약은 도 7A,B, C에도시된 바와 같이 RP2 채널에서 높은 신호를 생성하지 않았다. 높은 IgM RP2 MFI를 가진 견본을 위해, 가장 높은 신호는 RBD와 Nc(그림 7B,C)에대해 보였다. IgM 티터는 일부 샘플에서 이 시점에서 상승해야 하지만, 관찰된 MFI 수준은 IgM 검출 시약으로 140MFI 장치를 초과하지 않았습니다. 더욱이, IgM에 대한 제어 비드는 동일한농도(도 7D)에서사용되는 PE 라벨이 부착된 안티 IgM RP1 리포터에 비해 반대로 IgM에 공주된 DL 405를 사용할 때 MFI에 대한 상당한 동적 범위가 부족했다.
IgM에 적합한 RP2 리포터 라벨 검출 시약을 사용할 수 없기 때문에 SASB를 사용한 원래 비오틴 안티 이그G가 RP2 채널에서 사용하기 위해 테스트되었습니다. SASB를 갖는 RP2 채널에서 IgG에 대한 신호는 SAPE와 동일한 동적 범위를 가지고 있지 않았지만 여전히 S, RBD 및 Nc(그림 8)에대한 IgG 티터를 측정하기에 적합한 범위를 가지고 있었습니다. 이러한 데이터는 아래에 설명된 바와 같이 서로 다른 RP1 IgM 및 RP2 IgG 검출 시약 조합을 테스트하도록 이끌었습니다.
이중 기자 중화 분석으로 전환 이중 기자 혈청 분석체는 혈청 샘플을 첨가하기 전에 ACE2 및 구슬을 사용하여 인큐베이션 단계를 추가하여 중화 분석으로 변환되었습니다. 16 μg/ml에서 시작하여 2배 희석 시리즈ACE2가 사용되었고, 위에서 설명한 바와 같이 11개의 샘플 세트와 제거된 세라로 테스트하였다. 또한, RP1 IgM 및 RP2 IgG 검출 항체 믹스의 3가지 조합이 11개의 샘플 세트와 제거된 혈청 제어세트에서 테스트되었다. 최적으로 결정된 최종 조합 및 시약 농도는 표 1에상세하다.
IgG 검출을 위해, 원래 단일 리포터 분석에 사용된 비오틴 항인간 IgG/SASB는 BV 리포터 염료에 공주된 또 다른 안티 IgG와 함께 테스트되었다. BV 컨쥬게이트는 RP2 MFI 신호가 높았지만 IgG 티터의 MFI 신호 강도는 ACE2 적정(그림9A,C, E)에걸쳐 다양합니다. 비오틴 항인간 IgG/SASB 조합은 BV 컨쥬게이트에 비해 ACE2 적정전반에 걸쳐 보다 일관된 MFI 신호 감소가 있었으며, MFI 수준이 낮았지만 용량 반응을 입증하였다. ACE2 농도에 걸친 BV 컨쥬게이트에 의한 신호 변동은 또한 비오틴 항인간 IgG/SASB조합(도 9B,D, F)에비해 IgG 티터의 범위에 걸쳐 ACE2에 의한 백분율 억제를 결정하는 데 방해하였다. DFSO 3 샘플과 같은 MFI 신호가 낮은 샘플은 이러한 시약의 성능을 평가하거나 IgG 중화 용량을 측정하기에 충분한 티터가 없습니다.
RP1 채널에서 IgM 티터를 결정하기 위해, PE-컨쥬게이드 안티 IgM은 다이라이트 549 기자 염료(DL 549; 562 nm에서 발아 및 576nm)에 공주된 반인간 IgM과 비교하였다. 이들 두 시약 중 PE 안티-IgM은 테스트된 샘플에 대해 DL 549 항인간 IgM에 의해 생성된 것보다 더 높은 MF를나타냈다(그림 9A,C, E). 이러한 시약의 첨가를 측정하는 IgM 대조구는 PE 안티 IgM의 경우 평균 MF≈17,000, DL 549 컨쥬게이트의 경우 2,723개의 서로 다른 평균 MFIs를 가졌다. 이러한 차이에도 불구하고, MFI에 대한 다양한 ACE2 농도의 영향은 DL 549 컨쥬게이트로 측정할 수 있었습니다. IGM 결합의 ACE2% 억제를 결정하기 위해 두 IgM 검출 시약(도9B,D, F)사이에는미미하지만 미미한 차이가 있었다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">조합</td>
			<td rowspan="2">기자</td>
			<td colspan="2">최종 농도 인 웰 (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE 안티 이그M</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>비오틴 이그</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>다이라이트 549 반인간 IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>브릴리언트 바이올렛 421 안티 휴먼 IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>다이라이트 549 반인간 IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>비오틴 이그</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: RP1 및 RP2 리포터 염료 조합 테스트 목록. 여러 가지 다른 RP1 및 RP2 리포터 염료는 IgG 및 IgM 티터를 측정하기 위해 평가되었습니다. 위에 표시된 세 가지 조합은 서로 다른 RP1 검출 모드와 중화 분석의 최적화를 위해 테스트되었습니다. SASB를 이용한 RP2 조합의 경우 생체화 검출 항체 및 SASB에 대한 농도가 표시됩니다. *최종 농도는 반응의 최종 농도를 잘 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> 그림 1: 주요 분석 프로토콜 단계를 강조 표시하는 순서도입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> 그림 2: 항원 커플링 확인. 항원들은 100, 10 및 1 pmol/106 구슬에 결합되었다. S 및 RBD 항원의 경우 토끼 항-S 세라가 PE 안티래빗 IgG로 사용되고 검출되었다. Nc의 경우, 단백질 G 정제 토끼 폴리클론 안티-NC가 사용되었다. 10 pmol S(A),100 pmol RBD(B),및 100 pmol Nc(C)와결합 된 구슬에 대한 적정 곡선이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> 그림 3: 다른 항원 커플링 수준으로 혈청 희석의 최적화. 높은, 중간, 낮음 및 음의 샘플을 나타내는 혈청 샘플은 상이한 pmol 항원/106 비드 커플링으로 테스트하였다. 4배의 혈청 적정은 5항에 기재된 분석 프로토콜을 사용하여 항원 결합 구슬의 멀티플렉스 혼합으로 시험되었다. S(A),RBD(B),NC(C)에대한 적정 곡선의 MFI 값이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> 그림 4: 최적의 혈청 희석 및 검출 시약 농도의 결정. 네거티브 환자(2샘플)와 저양성(6개 샘플)을 포함한 8개의 혈청 샘플은 3가지 검출 시약 농도를 가진 추가 혈청 희석제에서 시험되었다. MFI 결과는S(A),RBD(B),NC(C)에대해 표시됩니다. 이들 및 기타 데이터(도시되지 않음)에 기초하여, 1:2,000의 샘플 희석 및 0.62 μg/mL의 비오틴 검출 항체 농도가 선택되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> 그림 5: 단일 기자 중화 분석의 최적화. 중화 항체 검출 분석에 대한 단일 리포터 의 세로지학적 분석의 수정은 제6항에 설명된 바와 같이 ACE2를 가진 인큐베이션 단계를 경쟁사로 추가하여 수행되었다. 저음에서 고양성 티터 세라에 이르는 11개의 샘플 과 IgG 스트라이프 혈청 샘플은 표준 분석 조건을 사용하여 4 μg/mL에서 시작하여 ACE2의 2배 희석 계열로 테스트되었습니다. ACE2 농도의 이 범위에 걸쳐, MFI의 감소는 S(A)및 RBD(B)에대한 증가 ACE2와 함께 볼 수 있지만 NC(C)에대한. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> 그림 6: ACE2로 신호의 백분율 억제. 11개의 샘플 세트에 대한 백분율 잔류 신호(도4에서)가 표시됩니다. 각 샘플에 대해, IgG 티터에 관계없이, 최고 ACE2 농도에서S(A)및 RBD(B)에 대해 최대 ≥30% MFI 신호를 달성하였다. Nc항원(C)의경우 ACE2의 양이 테스트된 신호의 현저한 억제는 없었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> 그림 7: RP2 IgM 검출 시약으로 DyLight 405 안티 IgM의 테스트. 11개의 샘플과 IgG-박탈된 세라 세트를 사용하여 DL 405-공주 방지 IgM을 RP2 검출 시약으로 테스트했습니다. S(A),RBD(B),NC(C)에대한 RP2 IgM MFI 신호가 표시됩니다. 임의의 시료를 가진 모든 항원에 대한 가장 높은 MFI 신호는 샘플 H(B)를가진 RBD를 위한 대략 140MFI 단위이었습니다. IgM 대조군 비드 세트의 신호조차도 전체 항체 티터 범위에 걸쳐 RP2 채널에서 1,000MFI 미만이었고 RP1채널(D)에서PE 안티-IgM 검출 항체로 관찰된 증가된 동적 범위를 나타내지 않았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> 그림 8: 비오틴 안티 IgG와 RP2 리포터로 SASB의 최적화. 11개의 샘플 과 IgG-박탈세라 세트를 표준 0.62 μg/mL 비오틴 안티 IgG로 SASB의 희석 계열을 테스트하는 데 사용되었습니다. S(A),RBD(B),NC(C)용RP2 채널에서 생성된 IgG MFIs가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> 그림 9: RP1 IgM 및 RP1 IgG 검출 믹스의 세 가지 조합의 비교. 3개의 다른 검출 항체 혼량은 11개의 견본및 IgG 박탈된 세라에 시험되었습니다. 사용되는 조합 및 최종 농도는 표 1에설명되어 있습니다. 모든 샘플은 16 μg/mL에서 시작하여 2배 의 ACE2 희석으로 테스트되었습니다. 3일, 12일 및 30일의 DFSO 샘플에 대한 데이터가 표시됩니다. RP1 IgM(주황색) 및 RP2 IgG(파란색)에 대한 MFI 신호는 A(DFSO 3), C(DFSO 12), E(DFSO 30)에 표시됩니다. ACE2% 잔류 MFI는 B(DFSO 3), D(DFSO 12), F(DFSO 30)에 표시됩니다. ACE2 컨트롤 없음과 비교하여 >30% 감소하는 신호는 밝은 녹색으로 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

2리포터 판독값을 제공하는 비드계 멀티플렉스 분석분석을 위한 유량 분석 시스템은 SARS-CoV-2에 대한 중화 IgG 및 IgM 항체를 동시에 측정할 수 있는 멀티플렉스 세론및 항체 중화 분석분석의 개발에 사용되었다.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

우리의 지식에, 이것은 동시에 분석당 두 개의 결과를 측정하기 위해 두 개의 기자 신호를 사용하는 구슬 기반 멀티플렉스 프로토콜의 첫 번째 예입니다. 이 기술을 통해 사용자는 항원별 IgM 및 IgG를 동시에 측정할 수 있으며, 샘플이 적고 결과에 대한 시간이 짧습니다. 이 이중 리포터 방법은 항체 이소타이핑에 특이적이지만, 번역 후 변형 또는 자유 약물 형태와 같은 다른 문별 쌍을 측정하도록 조정할 수 있다.오늘 우리의 절차를 시연우리는 박사 스티브 안젤로니, 루미넥스 공사의 수석 필드 응용 과학자가있다. 이중 기자 IgG와 IgM serological assay를 시작하려면 개별 커플 비드에서 필요한 멀티플렉스 비드 믹스를 준비하고 밀리리터 당 6 개의 구슬에 1 회 10 의 농도로 비드 주식을 제어하십시오. 다음으로, PBS-TBN 버퍼의 990 마이크로리터에 혈청 10 마이크로리터를 추가하여 혈청 샘플을 100배 희석한 다음, PBS-TBN의 180 마이크로리터에 1:100 희석제 20마이크로리터를 추가하여 샘플을 10배 더 희석시 희석시 10배 더 희석시 희석시.비드 믹스 와 혈청 샘플이 준비되면 멀티플렉스 비드 믹스 50 마이크로리터를 96웰의 비결합 마이크로티터 플레이트의 할당된 웰에 추가한 다음 희석된 혈청 샘플 50마이크로리터를 적절한 우물에 추가합니다. 모든 샘플이 추가되면, 마이크로 플레이트 호일 씰로 접시를 덮고 15 분 동안 섭씨 37도에서 가열 플레이트 셰이커에 인큐베이션하십시오. 그런 다음, 플레이트를 자기 판 분리기위에 2분 동안 배치하여 반응 혼합물에서 구슬을 분리한다.자석에 접시를 유지, 호일 씰을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전하고 부드럽게 우물에서 상류를 쓸어. 여전히 자석에 접시를 들고있는 동안, 흡수 성 용지에 접시를 얼룩.반응 우물을 씻으려면 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 PBS-TBN 150 마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 가열 된 셰이커에 2 분 동안 배양한 후 다시 플레이트 자석에 2 분 동안 다시 놓습니다. 접시를 자석에 두면서 접시를 뒤집어 서퍼넌트를 버리고 흡수성 용지에 접시를 부수십시오.두 번째 PBS-TBN 세척 후 자석에서 플레이트를 제거하고 100 마이크로리터의 신선한 검출 시약 믹스를 각 웰에 추가합니다. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮은 후 15분 동안 가열된 플레이트 셰이커에 놓고 2분간 마그네틱 플레이트 분리기위에 놓습니다. 플레이트가 자석에 있는 동안, 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 흡수성 용지에 블롯하여 검출 시약 믹스를 폐기하십시오.이전에 시연된 것보다 두 번 PBS-TBN으로 반응 우물을 씻은 다음 자석에서 플레이트를 제거합니다. 각 우물에 PBS-TBN 100 마이크로리터를 추가한 다음 호일 씰로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 2분간 흔들어 줍니다. 호일 씰을 제거하고 유량 분석기에서 각 우물에서 샘플의 50 마이크로리터를 읽는 진행합니다.플레이트를 읽으려면 왼쪽 위 모서리에 있는 드롭다운 메뉴를 선택하고 플레이트 구성으로 이동하여 이전에 구성된 플레이트를 로드하고 실행 플레이트를 선택합니다. 배출 아이콘을 선택하여 플레이트 캐리어를 배출한 다음 플레이트 캐리어에 플레이트를 로드한 다음 리트랙트 아이콘을 선택하여 플레이트 캐리어를 회수합니다. 플레이트 캐리어가 분석기로 장기화되면 실행 아이콘을 선택하여 플레이트 읽기를 시작합니다.듀얼 리포터 중화 분석의 경우 멀티플렉스 비드 믹스 50마이크로리터를 96웰의 비구속미 마이크로티터 플레이트에 추가한 다음, 각 웰에 밀리리터 ACE2당 2마이크로그램의 마이크로리터 25마이크로리터를 추가하고 호일 씰로 플레이트를 덮었다. 가열 된 플레이트 셰이커에 2 분 인큐베이션 후 할당 된 우물에 1:500 혈청 희석제 25 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 샘플이 추가되면, 이전에 서학적 분석에 대해 설명한 대로 인큐베이션, 세척, 검출 및 분석 단계를 수행합니다.증상 발병으로부터 5~60일 이내에 혈청 샘플을 이용한 DyLight 405 리포터 염료에 공주된 항-IgM의 시험은 스파이크 항원에게 높은 신호를 생성하지 않았다. IgM 배지 형광 강도가 높은 샘플의 경우, 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 항원에서 가장 높은 신호가 보였다. IgM 티터는 일부 샘플에서 상승되어야하지만 관찰 된 중간 형광 강도 수준은 140 MFI 단위를 초과하지 않았습니다.더욱이, IgM에 대한 대조구는 동일한 농도에서 피컬리스린라벨이 부착된 안티IgM에 비해 다이라이트 405를 안티-IgM으로 공주할 때 중간 형광 강도에 대한 상당한 동적 범위가 부족했다. IgG 검출을 위해, 화려한 보라색 공주체는 형광 슈퍼 브라이트 436의 스트렙타비딘 컨쥬게이트보다 더 높은 중앙형광 강도 신호를 가졌다. 그러나, 화려한 바이올렛 컨쥬게이트에 대한 신호 강도는 ACE2 적정에 걸쳐 다양했다.ACE2 농도를 가로 지르는 화려한 보라색 컨쥬게이트에 의한 이 신호 변동은 또한 IgG 티터의 범위에 걸쳐 ACE2에 의한 백분율 억제를 결정하는 것을 방해했습니다. IgM 검출의 경우, 물리에리트린 안티-IgM은 DyLight 549 항인간 IgM에 의해 생성된 신호보다 더 높은 신호를 표시했다. IGM 결합의 ACE2 % 억제를 결정하는 동안, 두 IgM 검출 시약 사이에 약간의 그러나 사소한 차이가 있었다.따라서 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나는 개별 비드 주식에서 멀티플렉스 비드 믹스를 준비하고 올바르게 수행해야합니다. 그래서 이 절차는 또한 백신의 효험을 측정하고 그밖 병원체에 면역 반응을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

연구

면역학 및 감염병학

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...