Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Denne rapporten ble finansiert av Luminex Corporation (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) for vitenskapelig redigeringshjelp.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni og Sherry Dunbar er ansatte i Luminex Corporation som produserer noen av reagensene og instrumentene som ble brukt i denne studien. Open Access-publisering av denne artikkelen ble sponset av Luminex Corporation

Denne studien utvidet funksjonaliteten til en multipleks fluorescerende mikrosfæreanalyse, 3Flex, som kvalitativt vurderer IgG-responsen på infeksjon av SARS-CoV-21. Mens mange serologiske analyser for COVID-19 oppdager et enkelt antigen, evaluerer denne analysen samtidig S-, RBD- og Nc-antigener, og inkluderer en intern antistoffisotypekontroll7. I tillegg brukes ACE2 som en indikator for å oppdage nøytraliserende antistofftitratorer til SARS-CoV-2.
Multiantigenanalyser kan være spesielt nyttige i fremtiden for å diskriminere immunresponser mellom smittede og vaksinerte personer. Med SARS-CoV-2, hvis bare S- og RBD-antistoffer evalueres, ville det være umulig å skjelne om dette skyldtes en tidligere infeksjon eller en vaksinasjonsantistoffrespons. Ingen av vaksinene som for tiden er i bruk retter seg mot nc-antigenet, så ved å evaluere S/RBD- og Nc-antigener er det mulig å skille tidligere virusinfeksjon (nc- og S/RBD-positiv) fra en vaksinasjonsrespons (kun S/RBD-positiv; Nc-negativ).
I den nåværende studien ble 3Flex serologiske og nøytraliseringsanalyser (avsnitt 5 og 6) overført til et nytt dobbelt reporterstrømningsanalyseinstrument (avsnitt 7 og 8). Typiske immunoassayprotokoller for perlebaserte multipleksanalyser ligner på standard ELISA-protokoller, etter sammenlignbare trinn for prøveinkubasjon, deteksjonsantistoff/reporterinkubasjon og analyse av resultatene8. Tidligere studier har også vist hvordan standard ELISA-analyser kan overføres til en perlebasert multipleksingsplattform9.
Analyseprotokollene kan overføres sømløst fra forgjengerens enkeltreporterinstrument til det nye dobbeltreportersystemet, som vist i resultatene som er oppnådd for testprøvene og kontrollene (figur 4 og figur 5). I den serologiske analysen viste alle positive serumprøver en karakteristisk doseresponsiv reduksjon i signalet som tilsvarer både en høyere prøvefortynning og en lavere deteksjonsantistoffkonsentrasjon, mens signalene for de negative prøvene forble på bakgrunnsnivå. Tilsvarende, for nøytraliseringsanalysen, bemerket synkende signaler for S og RBD, men ikke Nc, økende konsentrasjoner av ACE2-konkurrenten, mens IgG-strippet serum var mye mindre påvirket av tillegg av ACE2. Pre-inkubering av perler med ACE2 i 2 min før tilsetning av serumprøven (som beskrevet i avsnitt 6 og 8), ble også sammenlignet med å kombinere perlene med ACE2 og serum samtidig og ga liten forskjell i resultatene (data ikke vist). Men fordi resultatene oppnådd med perlene pluss ACE2 pre-inkubasjonstrinn var mer konsistente, var det den endelige prosedyren som ble vedtatt for nøytraliseringsanalyseprotokollen (avsnitt 6 og 8).
Fordi det doble reportersystemet inkorporerer en annen fluorescerende reporterkanal, ble begge analysene konvertert til isotypinganalyser for samtidig å måle både IgG- og IgM-svar. Den doble reporterfunksjonaliteten til strømningsanalysatoren gjør det mulig å samle fluorescerende signaler fra to reporterdeteksjonsreagenser for hver analytt i multipleksen for hver prøve, og effektivt doble dataene som genereres per prøve i en analyse. For utvikling og optimalisering av de doble reporteranalyseprotokollene ble flere kommersielt tilgjengelige reporterfarger og deteksjonsantistoffer evaluert for den nye RP2-kanalen (figur 7 og figur 8) for å finne de beste alternativene som er tilgjengelige. Anti-IgM-antistoffet som ble konjugert med DL 405-reporterfargen, fungerte ikke bra i RP2-kanalen (figur 7), så biotin anti-IgG med SASB ble senere evaluert for deteksjon i RP2-kanalen (figur 8). Tre kombinasjoner av RP1- og RP2-deteksjonsreagenser ble sammenlignet i dual reporternøytraliseringsanalysen (tabell 1 og figur 9) for å finne de beste kombinasjonene for samtidig påvisning av IgG- og IgM-nøytraliserende antistoffer. Mens det var signifikante forskjeller i signalintensiteten mellom RP1-kanalen ved hjelp av PE-anti IgM og RP2-kanalen ved hjelp av DL 549 anti-IgM, var det ingen signifikant forskjell i målingen av prosentandelbindingshemmingen av ACE2.
Flere begrensninger i dagens metode og denne studien er anerkjent. Først ble prøvene testet og brukt i metodeutvikling og optimalisering begrenset til sett med 8-11 prøver. Flere prøver vil bli testet i utvidede studier for å bekrefte at metoden er fullt optimalisert. For det andre ble et begrenset antall reporterfluoreoriforer og reporterpar testet. Videre testing av alle tilgjengelige reportere i alle mulige kombinasjoner vil avgjøre hvilke reagenser som kan brukes med hell i denne metoden. Anti-IgG-antistoffet som ble konjugert til biotin var forskjellig fra anti-IgG-antistoffet som ble konjugert til BV 421-reporteren. Så selv om variasjon i signalintensiteten for BV 421 anti-IgG eksisterte, kan det skyldes antistoffets spesifisitet og ikke relatert til reporterfargen. Testing av andre tilgjengelige BV 421-konjugiserte antistoffer kan identifisere et annet antistoff som vil fungere godt i RP2-kanalen. Fremtidige studier vil også evaluere kombinasjonen av PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG for deteksjon i henholdsvis RP1 og RP2. Til slutt, selv med instrumentets doble reporterkapasitet, er analysene begrenset til to isotyper (to parametere) per reaksjon. Hvis ytterligere isotyper skal måles eller full isotyping ønskes, må ytterligere reaksjoner ved hjelp av de samme to reporterkanalene kjøres i separate brønner.
Perlebasert multipleksingsteknologi gir rask og fleksibel analysedesign med enkel implementering i rutinemessige laboratoriearbeidsflyter3,4,10. Denne studien viste hvor enkelt det var å overføre de tidligere beskrevne 3Flex serologiske og nøytraliseringsanalysene for SARS-CoV-2 til et strømningsanalysesystem for måling av IgG med en enkelt reporter, eller med liten modifikasjon, samtidig som både IgG- og IgM-svarene ble målt ved hjelp av to reportere. Alternativet for dobbel reporter har klare fordeler i forhold til enkeltreporterplattformer fordi det kan gi dobbelt så mye data per prøve, ved hjelp av halvparten av prøvevolumet, og i halvparten av antall reaksjonsbrønner. Med de riktige reporterfargene og deteksjonsantistoffene kan isotypingsanalyser enkelt utvikles og utføres på det doble reporterstrømningsanalyseinstrumentet.

COVID-19-pandemien har understreket viktigheten av å raskt utvikle og implementere raske, høygjennomstrømningstester med høy ytelse som kan brukes til diagnostisering og overvåking av nye patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testing kan være ekstremt nyttig i en pandemi, da den samtidig kan analysere antistoffer mot flere antigener, noe som gir bred patogendekning og kontroller for variasjon i organismen og vertsresponsen på infeksjon. Utviklingen av en multipleks fluorescerende perlebasert analyse, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), som kan oppdage antistoffer mot spike (S) proteinet, spike angiotensin-konverterende enzyme-2 (ACE2) reseptorbindingsdomene (RBD) og nukleocapsid (Nc) av SARS-CoV-2 ble nylig rapportert1. 3Flex ble vist å ha sammenlignbar ytelse med en referanse SARS-CoV-2 IgG-analyse for serum oppnådd ved ≥21 dager fra symptomde begynnelse, men hadde høyere følsomhet med prøver samlet inn ved ≤5 dager fra symptomde begynnelse. I tillegg ble hemming av antistoffbinding demonstrert for S- og RBD-antigener ved bruk av løselig ACE2 i et nøytraliseringsanalyseformat. Multiplex perlebasert teknologi har blitt allment tatt i bruk som en anerkjent teknologi for multiks serologisk testing og har klare fordeler for storskala screening, inkludert korte tid-til-resultater, små utvalgskrav og redusert arbeidskraft2,3,4.
Nylig har et nytt strømningsanalyseinstrument blitt tilgjengelig som gir samme høy-plex, høy gjennomstrømningsevne som systemet demonstrerte i tidligere arbeid1, men med den ekstra fordelen av to reporterkanaler. Evnen til å måle to fluorescerende reportersignaler i en enkelt reaksjon tillater vurdering av to resultater per analytt for hver prøve og er ideell for isotypingsapplikasjoner, som vanligvis må utføres i separate reaksjonsbrønner5. Den doble reporterkapasiteten gir dobbelt så mye data for hvert utvalg i halvparten så mange reaksjonsbrønner med halvparten av kravene til prøvevolum, og har dermed en klar fordel i forhold til enkeltreportersystemer. Denne studien beskriver standard serologisk analyseprotokoll og beskriver tilpasningen til en nøytraliseringsanalyse. I tillegg beskriver denne rapporten konverteringen av enkeltreporteranalysen til en dobbel reporter serologisk analyse, og deretter en dual reporter nøytraliseringsanalyse, for samtidig å måle nøytraliserende antistoffer av både IgG- og IgM-isotyper mot SARS-CoV-2 S, RBD og Nc antigener. Du finner en visuell oversikt over analyseprotokollen i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19-pandemien har understreket behovet for raske høygjennomstrømningsmetoder for sensitiv og spesifikk serologisk deteksjon av infeksjon med nye patogener, for eksempel SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testing kan være spesielt nyttig fordi den samtidig kan analysere antistoffer mot flere antigener som optimaliserer patogendekningen, og kontroller for variasjon i organismen og den enkelte vertsresponsen. Her beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende mikrosfærebasert analyse som kan oppdage både IgM- og IgG-antistoffer mot tre store SARS-CoV-2 antigener- spike (S) protein, spike angiotensin-konverterende enzym-2 (ACE2) reseptorbindingsdomene (RBD) og nukleocapsid (Nc). Analysen viste seg å ha sammenlignbar ytelse med en SARS-CoV-2 referanseanalyse for IgG i serum oppnådd ved ≥21 dager fra symptomde begynnelse, men hadde høyere følsomhet med prøver samlet inn ved ≤5 dager fra symptomde begynnelse. Videre, ved hjelp av løselig ACE2 i et nøytraliseringsanalyseformat, ble hemming av antistoffbinding demonstrert for S og RBD.

Optimalisering av Single Reporter Serological Assay. Koblingsstrategien for alle SARS-CoV-2 antigener er beskrevet i Cameron, et al., 20201 og i trinn 2.1 ovenfor. Strategien for koblingsbekreftelse er beskrevet i trinn 2.3 ovenfor. For en effektiv kobling bør median fluorescensintensitet (MFI)-verdiene være betydelig høyere enn ingen serum/ingen antistoffnegative kontrollreaksjon(er) og bør demonstrere en doserespons av synkende MFI-signal med avtagende mengder deteksjonsreagens. MFI-er på ca. 1000 MFI-enheter eller mer over bakgrunnen MFI indikerer generelt effektiv proteinkobling og er avhengig av konsentrasjonen og spesifisiteten til deteksjonsreagenset som brukes. Ved hjelp av denne metoden ble bekreftelse av S-, RBD- og nc-antigenkobling testet for to mange perler (figur 2). MFI-signalene for alle antigener var signifikant høyere enn bakgrunnen MFI og viste en doserespons med titrering av deteksjonsreagensene. Dataene viste også god reproduserbarhet av MFI-nivåer mellom de to forskjellige mange koblede perlene.
Optimalisering av enkeltreporteranalysen ble gjort som beskrevet i Cameron, et al., 20201. Hvert antigen ble testet ved forskjellige koblingskonsentrasjoner med forskjellige fortynninger av flere serumprøver som representerer høye, middels, lave og negative prøver. I tillegg, fordi analysen måler IgG-titere, ble et IgG-strippet serum brukt som en ekstra negativ prøve. Resultater av en representativ prøvefortynningsserie med forskjellige antigenkoblingsnivåer er vist i figur 3. Denne første fortynningsserien ble testet med en fast konsentrasjon av deteksjonsreagenser for å få et potensielt utvalg av representative antigenspesifikke og bakgrunns-MFI-nivåer. Fra disse dataene ble ytterligere prøvefortynningsområder og antigenkoblingsnivåer bestemt og testet videre med ytterligere prøver (data ikke vist).
Deretter ble konsentrasjonen av deteksjonsreagenset optimalisert for bruk med de forskjellige serumfortynningene og antigenkoblingsnivåene. Representative data som bruker 6 positive og 2 negative prøver, vises i figur 4. Etter ytterligere testing med flere hundre negative pre-COVID-19 serumprøver ble de endelige optimale antigenkoblingsnivåene og deteksjonsregentkonsentrasjonene valgt ut til den endelige analyseprotokollen, som beskrevet i avsnitt 5.
Konvertering til en enkelt reporternøytraliseringsanalyse Konvertering av enkeltreporterens serologiske analyse til en nøytraliseringsanalyse ble oppnådd ved å legge til et inkubasjonstrinn ved hjelp av ACE2 (som et konkurrerende reagens) med perlene før du legger til serumprøven. Ved å titrere mengden ACE2 som tilsettes, ble hemming av IgG-binding til S- og RBD-antigener observert, som vist i figur 5. Mens 11 pasientsera hadde forskjellige titere av IgG, viste hver en betydelig nedgang i MFI-signalet med økende ACE2-konsentrasjon. Som forventet påvirker ACE2 bare MFI-signalene til S og RBD, men ikke nc-antigenet.
MFI-signalet i prosent i forhold til 0 μg/ml ACE2 for alle prøver er vist i figur 6. For de fleste prøver ble det observert et signaltap >30% for S og RBD med økende ACE2-konsentrasjon. Som forventet var det ingen effekt av ACE2 på Nc-signalet.
Konvertering til en dobbel reporter IgG og IgM serologisk analyse For den doble reporteren IgG og IgM-analysen ble standard enkeltreporteranalysetilstander brukt til å teste forskjellige antistoff- og reporterkombinasjoner for de to reporterkanalene. RP1-kanalen ligner på tidligere strømningsanalyseinstrumenter med deteksjon av "oransje" fluorescens for reporterfarger som PE. Den andre kanalen, RP2, bruker en fiolett eksitasjonslaser som kan brukes til å oppdage den "blå" fluorescensen av fargestoffer som er begeistret ved 402 nm med utslippsspektratopper i 421-441 nm-serien.
Flere forskjellige anti-menneskelige IgG- og IgM-antistoffkombinasjoner ble testet ved ulike konsentrasjoner med standard 2000 ganger prøvefortynning og inkubasjonsforhold beskrevet i avsnitt 6. En første test av anti-IgM konjugert til DyLight 405 reporter fargestoff (DL 405; eksitasjon ved 400 nm og utslipp på 420 nm) for RP2-kanalen ble utført ved hjelp av et sett med 11 PCR-positive prøver med DFSO fra 5 til >60 dager, og en IgG-strippet serumprøve. Dette deteksjonsreagenset ga ikke et høyt signal i RP2-kanalen som vist i figur 7A,B,C. For prøver med høy IgM RP2 MFI ble de høyeste signalene sett for RBD og Nc (Figur 7B,C). Mens IgM-titere skulle heves på dette tidspunktet i noen prøver, oversteg de observerte MFI-nivåene ikke 140 MFI-enheter med IgM-deteksjonsreagenset. Videre manglet kontrollperlen for IgM et betydelig dynamisk område for MFI ved bruk av DL 405 konjugert til anti-IgM sammenlignet med en PE-merket anti-IgM RP1-reporter som ble brukt ved de samme konsentrasjonene (Figur 7D).
Fordi et egnet RP2-reportermerket deteksjonsreagens for IgM ikke var tilgjengelig, ble den originale biotin anti-IgG med SASB testet for bruk i RP2-kanalen. Signalet for IgG i RP2-kanalen med SASB hadde ikke samme dynamiske område som med SAPE, men det hadde fortsatt et passende område for måling av IgG-titere for S, RBD og Nc (Figur 8). Disse dataene førte til testing av forskjellige RP1 IgM- og RP2 IgG-deteksjonsreagenskombinasjoner, som beskrevet nedenfor.
Konvertering til dual reporter nøytralisering analyse Den doble reporter serologiske analysen ble konvertert til en nøytraliseringsanalyse ved å legge til et inkubasjonstrinn med ACE2 og perler, før du legger til serumprøven. En 2 ganger fortynningsserie med ACE2 fra og med 16 μg/ml ble brukt, og deretter testet med sett med 11 prøver og strippet sera som beskrevet ovenfor. I tillegg ble 3 forskjellige kombinasjoner av RP1 IgM og RP2 IgG-deteksjonsantistoffblandinger testet på et sett med 11 prøver og stripete serumkontroller. De endelige kombinasjonene og reagenskonsentrasjonene som er fastslått å være optimale, er beskrevet i tabell 1.
For IgG-deteksjon ble biotinet antimennesket IgG/SASB som ble brukt i den opprinnelige enkeltreporteranalysen testet sammen med en annen anti-IgG som ble konjugert til BV-reporterfargen. Mens BV-konjugaten hadde høye RP2 MFI-signaler, varierte MFI-signalintensiteten for IgG-titer på tvers av ACE2-titreringene (Figur 9A, C, E). Kombinasjonen av biotin anti-human IgG/SASB hadde mer konsistent MFI-signalreduksjon på tvers av ACE2-titreringen sammenlignet med BV-konjugaten, noe som viste en doserespons, selv om MFI-nivåene var lavere. Signalsvingningene fra BV-konjugaten over ACE2-konsentrasjoner forstyrret også bestemmelsen av prosentandelinhibering av ACE2 på tvers av IgG-titere sammenlignet med kombinasjonen biotin anti-human IgG/SASB (Figur 9B,D,F). Prøver med lave MFI-signaler, for eksempel DFSO 3-prøven, har ikke høye nok titere til å evaluere ytelsen til disse reagensene eller måle IgG-nøytraliserende kapasitet.
For å bestemme IgM-titere i RP1-kanalen ble en PE-konjugert anti-IgM sammenlignet med en antimenneskelig IgM som ble konjugert til DyLight 549 reporterfargestoff (DL 549; eksitasjon ved 562 nm og utslipp ved 576 nm) ved konsentrasjonene som er oppført i tabell 1. Av disse to reagensene viste PE anti-IgM høyere MFIer enn de som ble generert av DL 549 antimenneskelig IgM for prøvene som ble testet (Figur 9A, C, E). IgM-kontrollperlen som målte tilsetningen av disse reagensene hadde forskjellige gjennomsnittlige MFIer på ≈ 17 000 for PE anti-IgM og 2723 for DL 549-konjugaten. Selv med disse forskjellene var virkningen av de forskjellige ACE2-konsentrasjonene på MFI målbar med DL 549-konjugaten. For å bestemme ACE2 prosent hemming av IgM binding, var det en liten, men ubetydelig forskjell mellom de to IgM deteksjon reagenser (Figur 9B,D, F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kombinasjon</td>
			<td rowspan="2">Reporter</td>
			<td colspan="2">Endelig konsentrasjon i brønn (μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 Antimenneskelig IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Strålende Fiolett 421 Antimenneskelig IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 Antimenneskelig IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Liste over fargekombinasjoner for RP1 og RP2-reportere som er testet. Flere forskjellige RP1- og RP2-reporterfarger ble evaluert for måling av IgG- og IgM-titere. De tre kombinasjonene vist ovenfor ble testet i forskjellige RP1-deteksjonsmoduser og for optimalisering av nøytraliseringsanalysen. For RP2-kombinasjoner som bruker SASB, er konsentrasjoner for biotinylert deteksjonsantistoff og SASB vist. *Endelig konsentrasjon representerer den endelige konsentrasjonen i reaksjonsbrønnen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Figur 1: Flytskjema som uthever hovedtrinnene i analyseprotokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Figur 2: Bekreftelse av antigenkobling. Antigener ble koblet til ved 100, 10 og 1 pmol/106 perler. For S- og RBD-antigener ble kanin anti-S sera brukt og påvist med PE anti-kanin IgG. For Nc ble det brukt en Protein G-renset kaninpolyklonal anti-Nc. Titreringskurvene for perler kombinert med 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) og 100 pmol Nc (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Figur 3: Optimalisering av serumfortynning med forskjellige antigenkoblingsnivåer. Serumprøver som representerer høye, mellomstore, lave og negative prøver ble testet med de forskjellige pmolantigen/106 perlekoblingene. En 4 ganger serumtitrering ble testet med en multipleksblanding av antigenkoblede perler ved hjelp av analyseprotokollen beskrevet i avsnitt 5. MFI-verdiene for titreringskurvene for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Figur 4: Bestemmelse av optimal serumfortynning og deteksjonsreagenskonsentrasjon. Åtte serumprøver, inkludert negative pasienter (2 prøver) og lav- til høypositive (6 prøver), ble testet ved ytterligere serumfortynning med tre forskjellige deteksjonsreagenskonsentrasjoner. MFI-resultatene vises for S (A), RBD (B) og Nc (C). Basert på disse og andre data (ikke vist), ble det valgt en prøvefortynning på 1:2000 og en biotindeteksjonsantistoffkonsentrasjon på 0,62 μg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Figur 5: Optimalisering av enkeltreporternøytraliseringsanalyse. Modifikasjon av enkeltreporterens serologiske analyse til en nøytraliserende antistoffdeteksjonsanalyse ble utført ved å legge til et inkubasjonstrinn med ACE2 som konkurrent, som beskrevet i avsnitt 6. Et sett med 11 prøver, alt fra lav- til høypositiv titer sera, og en IgG-stripet serumprøve ble testet med en todelt fortynningsserie av ACE2 som starter på 4 μg / ml, ved hjelp av standard analyseforhold. På tvers av dette området med ACE2-konsentrasjoner kan en reduksjon i MFI ses med økt ACE2 for S (A) og RBD (B), men ikke for Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Figur 6: Prosentinhibering av signal med ACE2. Restsignalene for prosent for settet med 11 prøver (fra figur 4) vises. For hver prøve, uavhengig av IgG-titeren, ble det oppnådd en maksimal reduksjon på ≥30% MFI-signal for S (A) og RBD (B) ved den høyeste ACE2-konsentrasjonen. For nc antigen (C) var det ingen signifikant hemming av signal med noen mengde ACE2 testet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Figur 7: Test av DyLight 405 anti-IgM som RP2 IgM deteksjonsreagens. Et sett med 11 prøver og IgG-strippet sera ble brukt til å teste DL 405-konjugert anti-IgM som et RP2-deteksjonsreagens. RP2 IgM MFI-signalene for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Det høyeste MFI-signalet for ethvert antigen med en prøve var ca. 140 MFI-enheter for RBD med prøve H (B). Selv signalet på IgM-kontrollperlesettet var mindre enn 1000 MFI i RP2-kanalen over hele antistofftitlerområdet og viste ikke det økte dynamiske området som ble observert med PE anti-IgM-deteksjonsantistoffet i RP1-kanalen (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Figur 8: Optimalisering av SASB som RP2-reporter med Biotin anti-IgG. Et sett med 11 prøver og IgG-strippet sera ble brukt til å teste en fortynningsserie av SASB med standard 0,62 μg/ml biotin anti-IgG. De resulterende IgG MFIene i RP2-kanalen for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Figur 9: Sammenligning av tre forskjellige kombinasjoner av RP1 IgM- og RP1 IgG-deteksjonsblandinger. Tre forskjellige påvisningsantistoffblandinger ble testet på 11 prøver og IgG strippet sera. Kombinasjonene og de endelige konsentrasjonene som brukes er beskrevet i tabell 1. Alle prøver ble testet med en 2 ganger ACE2 fortynning, fra 16 μg/ml. Data for prøver ved DFSO på 3, 12 og 30 dager vises. MFI-signalene for RP1 IgM (oransje) og RP2 IgG (blå) vises i A (DFSO 3), C (DFSO 12) og E (DFSO 30). ACE2 prosent gjenværende MFIer vises i B (DFSO 3), D (DFSO 12) og F (DFSO 30). Signaler som representerer en reduksjon på >30 % sammenlignet med ingen ACE2-kontroller, er uthevet lysegrønne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Et strømningsanalysesystem for perlebaserte multipleksede analyser som gir en to-reporter-avlesning ble brukt til utvikling av multipleks serologiske og antistoffnøytraliseringsanalyser som samtidig kan måle nøytraliserende IgG- og IgM-antistoffer for SARS-CoV-2.

En rask, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyse for et Multiplexed Bead-basert flytanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Så vidt vi vet er dette det første eksemplet på en perlebasert multipleksingsprotokoll som bruker to reportersignaler til samtidig å måle to resultater per analytt. Denne teknikken lar brukeren måle antigenspesifikk IgM og IgG samtidig, med mindre prøve og kortere tid til resultatene. Selv om denne doble reportermetoden er spesifikk for antistoffisytyping, kan den tilpasses for å måle andre analyttpar, for eksempel postoversettelsesendringer eller frie versus bundne legemiddelformer.Ved å demonstrere prosedyren vår i dag har vi Dr.Steve Angeloni, en senior feltsøknadsforsker for Luminex Corporation. For å starte den doble reporteren IgG og IgM serologisk analyse, forberede de nødvendige multiplex perleblandinger fra det enkelte par perle og kontrollere perlebestander i en konsentrasjon på en gang 10 til de seks perlene per milliliter. Deretter fortynner du serumprøvene 100 ganger ved å tilsette 10 mikroliter serum til 990 mikroliter PBS-TBN-buffer, og fortynn deretter prøvene ytterligere ti ganger ved å legge til 20 mikroliter av 1:100 fortynning til 180 mikroliter PBS-TBN.Når perleblandingene og serumprøvene er klare, tilsett 50 mikroliter av multipleksperleblandingene til de tildelte brønnene til en 96-brønns ikke-bindende mikrotiterplate, og tilsett deretter 50 mikroliter av de fortynnede serumprøvene til de aktuelle brønnene. Når alle prøvene er tilsatt, dekk platen med en mikroplatefolietetning og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Deretter skiller du perlene fra reaksjonsblandingen ved å plassere platen på en magnetisk plateseparator i to minutter.Hold platen på magneten, fjern folietetningen. Snu deretter platen forsiktig over en avfallsbeholder og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene. Mens du fortsatt holder platen på magneten, flekk platen på absorberende papir.For å vaske reaksjonsbrønnene, fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønn. Dekk platen med en frisk folietetning og inkuber på den oppvarmede shakeren i to minutter før du legger den tilbake på platemagneten i ytterligere to minutter. Mens du holder platen på magneten, snu platen for å kaste supernatanten, og flekk platen på absorberende papir.Etter den andre PBS-TBN-vasken, fjern platen fra magneten og tilsett 100 mikroliter fersk deteksjonsreagensblanding til hver brønn. Etter å ha dekket platen med en mikroplatefolieforsegling, legg den på en oppvarmet plate shaker i 15 minutter, og deretter på en magnetisk plateseparator i to minutter. Mens platen er på magneten, kast deteksjonsreagensblandingen ved å invertere platen over en avfallsbeholder og blåse den opp på absorberende papir.Vask reaksjonsbrønnene med PBS-TBN dobbelt så mye som tidligere vist, og fjern deretter platen fra magneten. Tilsett 100 mikroliter PBS-TBN til hver brønn, dekk deretter platen med folietetning og rist i to minutter ved 37 grader Celsius. Fjern folietetningen og fortsett å lese 50 mikroliter av prøven fra hver brønn i strømningsanalysatoren.Hvis du vil lese platen, velger du rullegardinmenyen øverst til venstre, navigerer til Platekonfigurasjon, laster inn den tidligere konfigurerte platen og velger Kjør plate. Løs ut plateholderen ved å velge Utløser-ikonet, last deretter platen på plateholderen og velg Tilbaketrekk-ikonet for å trekke tilbake plateholderen. Når platebæreren har langvarig inn i analysatoren, velger du Kjør-ikonet for å begynne å lese platen.For den doble reporternøytraliseringsanalysen legger du til 50 mikroliter av multipleksperleblandingene til tildelte brønner av en 96-brønns ikke-bindende mikrotiterplate, tilsett deretter 25 mikroliter to mikrogram per milliliter ACE2 til hver brønn, og dekket platen med en folietetning. Etter en to minutters inkubasjon på en oppvarmet plate shaker, tilsett 25 mikroliter av 1:500 serumfortynning til de tildelte brønnene. Når alle prøvene er lagt til, utfører du inkubasjons-, vaske-, deteksjons- og analysetrinnene som tidligere er demonstrert for den serologiske analysen.En test av anti-IgM konjugert til DyLight 405 reporter fargestoff ved hjelp av serum prøver innen fem til 60 dager fra symptom utbruddet og en IgG stripe serum prøve produserte ikke et høyt signal for spike antigen. For prøver med høy IgM medium fluorescensintensitet ble de høyeste signalene sett for reseptorbindingsdomenet og nukleocapsid antigener. Mens IgM-titeren skulle ha blitt forhøyet i noen prøver, oversteg de observerte middels fluorescensintensitetsnivåene ikke 140 MFI-enheter.Videre manglet kontrollperlen for IgM et betydelig dynamisk område for median fluorescensintensitet ved bruk av DyLight 405 konjugert til anti-IgM sammenlignet med en fycoerythrin merket anti-IgM i samme konsentrasjon. For IgG-deteksjon hadde den strålende fiolette konjugaten høyere median fluorescensintensitetssignaler enn streptavidinkonjugaten til fluorfor Super Bright 436. Signalintensiteten for den strålende fiolette konjugaten varierte imidlertid over ACE2-titrasjonene.Dette signalsvingninget fra den strålende fiolette konjugaten over ACE2-konsentrasjoner forstyrret også bestemmelsen av prosentandelinhibering av ACE2 på tvers av IgG-titere. For IgM-deteksjon viste fycoerythrin anti-IgM høyere signaler enn de som genereres av DyLight 549 antimenneskelig IgM. Under bestemmelse av ACE2 prosent hemming av IgM binding, var det en liten, men ubetydelig forskjell mellom de to IgM-deteksjonsreagensene.Så et av de viktigste trinnene i prosedyren er å forberede multiplex perleblandingen fra dine individuelle perlelagrer og sørge for at du gjør det riktig. Så denne prosedyren kan også brukes til å måle effekten av vaksiner og overvåke immunresponsene på andre patogener også.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generering av To-farge Antigen Mikromatriser for samtidig påvisning av IgG og IgM autoantistoffer

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Perle basert Multiplex analysen for analyse av tåre cytokin profiler

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Påvisning av SARS-CoV-2 reseptorbindende domeneantistoff ved hjelp av en HiBiT-basert bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkripsjon PCR spytt diagnostisk strategi ved hjelp av åpen kildekode pipettering roboter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Samtidig påvisning av forskjellige antistoffklasser i en multiplekset serologisk test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypede virus som et molekylært verktøy for å overvåke humorale immunresponser mot SARS-CoV-2 via nøytraliseringsanalyse

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Påvisning av Rabies IgG og IgM antistoffer ved hjelp av Rabies indirekte fluorescerende antistoff test

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...