Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Этот отчет был профинансирован корпорацией Luminex (Остин, техас). Авторы благодарят Мэтью Сильвермана PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) за помощь в научном редактировании.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Стивен Анджелони и Шерри Данбар являются сотрудниками корпорации Luminex, которая производит некоторые из реагентов и инструментов, которые использовались в этом исследовании. Публикация этой статьи в открытом доступе была спонсирована корпорацией Luminex

Это исследование расширило функциональность мультиплексного флуоресцентного микросферного анализа 3Flex, который качественно оценивает реакцию IgG на инфекцию SARS-CoV-21. В то время как многие серологические анализы на COVID-19 обнаруживают один антиген, этот анализ одновременно оценивает антигены S, RBD и Nc и включает внутренний контроль изотипа антител7. Кроме того, ACE2 используется в качестве индикатора для выявления нейтрализующих титров антител к SARS-CoV-2.
Анализы на несколько антигенов могут быть особенно полезны в будущем для распознавания иммунных реакций между инфицированными и вакцинированными людьми. При SARS-CoV-2, если оценивать только антитела S и RBD, было бы невозможно определить, было ли это связано с прошлой инфекцией или с ответом антител к вакцинации. Ни одна из используемых в настоящее время вакцин не нацелена на антиген Nc, поэтому, оценивая антигены S/RBD и Nc, можно отличить прошлую вирусную инфекцию (Nc- и S/RBD-положительную) от ответа на вакцинацию (только S/RBD-положительный; Nc-отрицательный).
В текущем исследовании серологические и нейтрализуемые анализы 3Flex (разделы 5 и 6) были перенесены на новый прибор анализа двойного репортерного потока (разделы 7 и 8). Типичные протоколы иммуноанализа для мультиплексных анализов на основе шариков аналогичны стандартным протоколам ИФА, следуя сопоставимым этапам инкубации образцов, инкубации антител / репортера и анализа результатов8. Предыдущие исследования также продемонстрировали, как стандартные анализы ИФА могут быть перенесены на платформу мультиплексирования на основе бисера9.
Протоколы анализа могут быть легко перенесены с предшествующие однопортажуные приборы на новую систему двойного репортера, о чем свидетельствуют результаты, полученные для тестовых образцов и элементов управления(рисунок 4 и рисунок 5). В серологическом анализе все положительные образцы сыворотки показали характерное дозочувствительное снижение сигнала, соответствующее как более высокому разбавлению образца, так и более низкой концентрации антител для обнаружения, тогда как сигналы для отрицательных образцов оставались на фоновых уровнях. Аналогичным образом, для анализа нейтрализации снижение сигналов для S и RBD, но не для Nc, соответствовало увеличению концентраций конкурента ACE2, тогда как очищенная сыворотка IgG была гораздо менее затронута добавлением ACE2. Предварительная инкубационная обработка шариков с ACE2 в течение 2 мин до добавления образца сыворотки (как описано в разделах 6 и 8) также сравнивалась с объединением шариков с ACE2 и сывороткой одновременно и производила небольшую разницу в результатах (данные не показаны). Однако, поскольку результаты, полученные с помощью шариков плюс прединкрубационная ступень ACE2, были более последовательными, это была окончательная процедура, принятая для протокола нейтрализации анализа (разделы 6 и 8).
Поскольку двойная репортерная система включает в себя второй флуоресцентный репортерный канал, оба анализа были преобразованы в изотипирование для одновременного измерения ответов IgG и IgM. Функция двойного репортера анализатора потока позволяет получать флуоресцентные сигналы от двух реагентов обнаружения репортеров для каждого анализируемого вещества в мультиплексе для каждого образца, эффективно удваивая данные, генерируемые на образец в анализе. Для разработки и оптимизации протоколов двойного репортерного анализа было оценено несколько коммерчески доступных репортерных красителей и антител обнаружения для нового канала RP2(рисунок 7 и рисунок 8)для определения наилучшего доступного варианта (вариантов). Анти-IgM антитело, конъюгированное с репортерным красителем DL 405, не работало хорошо в канале RP2(рисунок 7),поэтому биотин анти-IgG с SASB впоследствии оценивали для обнаружения в канале RP2(рисунок 8). Три комбинации реагентов для детектирования RP1 и RP2 сравнивали в двойном анализе нейтрализации репортеров(таблица 1 и рисунок 9)для определения наиболее эффективных комбинаций для одновременного обнаружения нейтрализующих антител IgG и IgM. Хотя существовали значительные различия в интенсивности сигнала между каналом RP1 с использованием PE-anti IgM и каналом RP2 с использованием DL 549 anti-IgM, не было существенной разницы в измерении процентного ингибирования связывания ACE2.
Признается ряд ограничений нынешнего метода и этого исследования. Во-первых, образцы, протестированные и использованные при разработке и оптимизации метода, были ограничены наборами из 8-11 образцов. Больше образцов будет протестировано в расширенных исследованиях, чтобы убедиться, что метод полностью оптимизирован. Во-вторых, было протестировано ограниченное количество репортерских флуорофоров и репортерских пар. Дальнейшее тестирование всех доступных репортеров во всех возможных комбинациях позволит определить, какие реагенты могут быть успешно использованы в этом методе. Анти-IgG антитело, конъюгированное с биотином, отличалось от анти-IgG-антитела, конъюгированного с репортером BV 421. Таким образом, хотя изменчивость интенсивности сигнала для BV 421 anti-IgG существовала, она могла быть обусловлена специфичностью антитела и не связана с репортерным красителем. Тестирование других доступных BV 421-конъюгированных антител может идентифицировать другое антитело, которое будет хорошо работать в канале RP2. Будущие исследования также будут оценивать комбинацию ПЭ анти-IgM с BV 421 античеловеческим IgG для обнаружения в RP1 и RP2 соответственно. Наконец, даже при двойной репортерной способности прибора анализы ограничены двумя изотипами (двумя параметрами) на реакцию. Если необходимо измерить дополнительные изотипы или желательно полное изотипирование, то дополнительные реакции с использованием тех же двух репортерных каналов должны быть запущены в отдельных скважинах.
Технология мультиплексирования на основе бисера позволяет быстро и гибко проектировать анализ с простым внедрением в рутинные лабораторные рабочие процессы3,4,10. Это исследование продемонстрировало легкость переноса ранее описанных серологических и нейтрализующих анализов 3Flex для SARS-CoV-2 на систему анализа потока для измерения IgG с помощью одного репортера или с небольшой модификацией, одновременно измеряя ответы IgG и IgM с использованием двух репортеров. Опция двойного репортера имеет явные преимущества перед платформами с одним репортером, поскольку она может предоставлять в два раза больше данных на образец, используя половину объема образца и половину количества реакционных скважин. С соответствующими репортерными красителями и антителами обнаружения анализы изотипирования могут быть легко разработаны и выполнены на приборе анализа двойного репортерного потока.

Пандемия COVID-19 подчеркнула важность возможности быстрой разработки и внедрения быстрых, высокопроизводительных, высокоэффективных серологических тестов, которые могут быть использованы для диагностики и эпиднадзора за новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Мультиплексное серологическое тестирование может быть чрезвычайно полезным в условиях пандемии, поскольку оно может одновременно анализировать антитела к нескольким антигенам, что обеспечивает широкий охват патогенов и контроль за изменчивостью в организме и реакцией хозяина на инфекцию. Недавносообщалосьо разработке мультиплексного флуоресцентного бисероплетного анализа SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), который может обнаруживать антитела к спайково-белку (S), шипово-ангиотензинпревращающий фермент-2 (ACE2) рецептор-связывающий домен (RBD) и нуклеокапсид (Nc) SARS-CoV-2. Было показано, что 3Flex имеет сопоставимую производительность с эталонным анализом SARS-CoV-2 IgG для сыворотки, полученной через ≥21 день с момента появления симптомов, но имел более высокую чувствительность с образцами, собранными через ≤5 дней от начала симптомов. Кроме того, было продемонстрировано ингибирование связывания антител для антигенов S и RBD с использованием растворимого ACE2 в формате нейтрализационного анализа. Технология на основе мультиплексных шариков была широко принята в качестве проверенной технологии для мультиплексного серологического тестирования и имеет явные преимущества для крупномасштабного скрининга, включая короткое время до результатов, требования к небольшим образцам и сокращение трудозатрат2,3,4.
Недавно стал доступен новый прибор анализа потока, который обеспечивает ту же высокоплексную, высокопроизводительную способность системы, которая была продемонстрирована в предыдущей работе1,но с дополнительным преимуществом двух репортерных каналов. Возможность измерения двух флуоресцентных репортерных сигналов в одной реакции позволяет оценить два результата на анализируемый файл для каждого образца и идеально подходит для применения изотипирования, которое обычно должно выполняться в отдельных реакционных скважинах5. Возможность двойного репортера обеспечивает вдвое больше данных для каждого образца в вдвое меньшем количестве реакционных скважин с половиной требований к объему пробы и, таким образом, имеет явное преимущество перед системами с одним репортером. В этом исследовании подробно описывается стандартный протокол серологического анализа и описывается адаптация к анализу нейтрализации. Кроме того, в этом отчете описывается преобразование анализа одного репортера в серологический анализ с двойным репортером, а затем двойной анализ нейтрализации репортера для одновременного измерения нейтрализующих антител изотипов IgG и IgM против антигенов SARS-CoV-2 S, RBD и Nc. Визуальный обзор протокола анализа приведен на рисунке 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

Пандемия COVID-19 подчеркнула необходимость быстрых высокопроизводительных методов для чувствительного и специфического серологического выявления инфекции новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Мультиплексное серологическое тестирование может быть особенно полезным, поскольку оно может одновременно анализировать антитела к нескольким антигенам, что оптимизирует охват патогенов и контролирует изменчивость в организме и индивидуальную реакцию хозяина. Здесь мы описываем sars-CoV-2 IgG 3-плекс флуоресцентной микросферы, который может обнаруживать как антитела IgM, так и IgG к трем основным антигенам SARS-CoV-2 - спайковой (S) белку, спайк-ангиотензинпревращающему ферменту-2 (ACE2), рецептор-связывающему домену (RBD) и нуклеокапсиду (Nc). Было показано, что анализ имеет сопоставимую производительность с эталонным анализом SARS-CoV-2 для IgG в сыворотке, полученной через ≥21 день с момента появления симптомов, но имел более высокую чувствительность с образцами, собранными через ≤5 дней от начала симптомов. Кроме того, используя растворимый ACE2 в формате нейтрализационного анализа, было продемонстрировано ингибирование связывания антител для S и RBD.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Система анализа потока для мультиплексированных анализов на основе шариков, которая обеспечивает показания с двумя репортерами, была использована для разработки мультиплексных серологических анализов и анализов нейтрализации антител, которые могут одновременно измерять нейтрализующие антитела IgG и IgM для SARS-CoV-2.

Экспресс-мультиплексный двойной репортер IgG и IgM SARS-CoV-2 нейтрализуя для мультиплексированной системы анализа потоков на основе шариков

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Насколько нам известно, это первый пример протокола мультиплексирования на основе шариков, который использует два репортерных сигнала для одновременного измерения двух результатов на анализируемый. Этот метод позволяет пользователю измерять антиген-специфические IgM и IgG одновременно, с меньшим количеством образца и более коротким временем до результатов. Хотя этот метод двойного репортера является специфическим для изотипирования антител, он может быть адаптирован для измерения других пар анализируемых веществ, таких как постпереклятивные модификации или свободные и связанные лекарственные формы.Сегодня мы демонстрируем нашу процедуру доктором Стивом Анджелони, старшим научным сотрудником по полевым приложениям корпорации Luminex. Чтобы начать серологический анализ IgG и IgM с двойным репортером, подготовьте необходимые мультиплексные бисероплетения из отдельной пары бусин и контролируйте запасы бусин в концентрации от одного раза 10 до шести бусин на миллилитр. Затем разбавляют образцы сыворотки в 100 раз, добавляя 10 микролитров сыворотки к 990 микролитрам буфера PBS-TBN, затем разбавляют образцы еще в десять раз, добавляя 20 микролитров разведения 1:100 к 180 микролитрам PBS-TBN.Когда шариковые смеси и образцы сыворотки будут готовы, добавьте 50 микролитров мультиплексных шариковых смесей в назначенные лунки 96-луночной несвязывающей микротитровой пластины, затем добавьте 50 микролитров разбавленных образцов сыворотки в соответствующие лунки. После того, как все образцы будут добавлены, накройте пластину уплотнением из микропластини и инкубировать на нагретом пластинчатом шейкере при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем отделите шарики от реакционной смеси, поместив пластину на сепаратор магнитных пластин в течение двух минут.Держа пластину на магните, снимите фольгированную пломбу. Затем осторожно перевернуть пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащить супернатант из колодцев. Все еще удерживая пластину на магните, промойте пластину на абсорбирующей бумаге.Чтобы промыть реакционные колодцы, снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте в каждую скважину по 150 микролитров PBS-TBN. Накройте тарелку уплотнением из свежей фольги и высиживайте на нагретом шейкере в течение двух минут, прежде чем поместить ее обратно на магнит пластины еще на две минуты. Удерживая пластину на магните, переверните пластину, чтобы отбросить супернатант, и промойте пластину на абсорбирующей бумаге.После второй промывки PBS-TBN снимите пластину с магнита и добавьте в каждую лунку 100 микролитров свежей смеси реагентов Detection. После покрытия пластины уплотнением из микропластичной фольги поместите ее на нагретый пластинчатый шейкер на 15 минут, а затем на магнитную пластинчатый сепаратор на две минуты. Пока пластина находится на магните, отбросьте смесь реагента обнаружения, переверните пластину над контейнером для отходов и промокав ее на абсорбирующей бумаге.Промыть реакционные колодцы PBS-TBN в два раза, как было показано ранее, затем снять пластину с магнита. Добавьте 100 микролитров PBS-TBN в каждую лунку, затем накройте пластину фольгированной пломбой и встряхните в течение двух минут при 37 градусах Цельсия. Снимите уплотнение из фольги и приступайте к считываемости 50 микролитров образца из каждой скважины в анализаторе потока.Чтобы прочитать табличку, выберите раскрывающееся меню в левом верхнем углу, перейдите в раздел Конфигурация пластины, загрузите ранее настроенную пластину и выберите Запустить пластину. Извлеките держатель пластины, выбрав значок «Извлечь», затем загрузите пластину на держатель пластины и выберите значок «Втянуть», чтобы втянуть держатель пластины. После того, как держатель пластины затянется в анализатор, выберите значок Выполнить, чтобы начать чтение пластины.Для анализа двойной репортерной нейтрализации добавьте 50 микролитров мультиплексных шариковых смесей в назначенные скважины 96-луночной необязывающей микротитровой пластины, затем добавьте 25 микролитров по два микрограмма на миллилитр ACE2 к каждой лунке и покройте пластину фольгированным уплотнением. После двухминутной инкубации на нагретом пластинчатом шейкере добавить в назначенные лунки 25 микролитров разведения сыворотки 1:500. После того, как все образцы были добавлены, выполните этапы инкубации, промывки, обнаружения и анализа, как было ранее продемонстрировано для серологического анализа.Тест анти-IgM, конъюгированный с репортерным красителем DyLight 405 с использованием образцов сыворотки в течение пяти-60 дней с момента появления симптомов и образца сыворотки IgG strip, не дал высокого сигнала для спайкового антигена. Для образцов с высокой интенсивностью флуоресценции среды IgM самые высокие сигналы наблюдались для рецепторсвязывающего домена и антигенов нуклеокапсида. Хотя титр IgM должен был быть повышен в некоторых образцах, наблюдаемые уровни интенсивности флуоресценции среды не превышали 140 единиц МФО.Кроме того, контрольной шарику для IgM не хватало значительного динамического диапазона для средней интенсивности флуоресценции при использовании DyLight 405, сопряженного с анти-IgM, по сравнению с фикоэритрином, меченым анти-IgM в той же концентрации. Для обнаружения IgG блестящий фиолетовый конъюгат имел более высокие сигналы средней интенсивности флуоресценции, чем стрептавидиновый конъюгат флуофора Super Bright 436. Однако интенсивность сигнала для блестящего фиолетового сопряжения варьировалась в зависимости от титрования ACE2.Это колебание сигнала блестящим фиолетовым конъюгатом в концентрациях ACE2 также мешало определению процента ингибирования ACE2 в диапазоне титров IgG. Для обнаружения IgM фикоэритрин анти-IgM отображал более высокие сигналы, чем те, которые генерирулись DyLight 549 античеловеческим IgM. При определении ACE2-процентного ингибирования связывания IgM наблюдалась небольшая, но незначительная разница между двумя реагентами обнаружения IgM.Таким образом, одним из наиболее важных шагов в процедуре является приготовление смеси мультиплексных бусин из ваших индивидуальных бусин и убедитесь, что вы делаете это правильно. Таким образом, эта процедура также может быть использована для измерения эффективности вакцин и мониторинга иммунных реакций на другие патогены.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Шарик на основе мультиплекс пробирного анализа слезоточивый цитокинового профиля

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Эффективная sars-CoV-2 количественная обратная транскриптаза ПЦР стратегия диагностики слюны с использованием роботов для пипетирования с открытым исходным кодом

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Одновременное обнаружение различных классов антител в мультиплексном серологическом тесте

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Выявление антител IgG и IgM к бешенству с помощью непрямого флуоресцентного теста на антитела к бешенству

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...