Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Denna rapport finansierades av Luminex Corporation (Austin, TX). Författarna tackar Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) för vetenskaplig redigeringshjälp.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni och Sherry Dunbar är anställda på Luminex Corporation som producerar några av de reagenser och instrument som användes i denna studie. Open Access-publicering av den här artikeln sponsrades av Luminex Corporation

Denna studie utvidgade funktionaliteten hos en multiplex fluorescerande mikrosfäranalys, 3Flex, som kvalitativt bedömer IgG-svaret på infektion av SARS-CoV-21. Medan många serologiska analyser för COVID-19 upptäcker ett enda antigen, utvärderar denna analys samtidigt S-, RBD- och Nc-antigener och innehåller en intern antikroppsisotypkontroll7. Dessutom används ACE2 som en indikator för att upptäcka neutraliserande antikroppstitrar till SARS-CoV-2.
Multi-antigen analyser kan vara särskilt användbara i framtiden för att diskriminera immunsvar mellan smittade och vaccinerade personer. Med SARS-CoV-2, om endast S- och RBD-antikroppar utvärderas, skulle det vara omöjligt att urskilja om detta berodde på en tidigare infektion eller på ett vaccinationsantikroppssvar. Inget av de vacciner som för närvarande används är inriktat på Nc-antigenet, så genom att utvärdera S/RBD- och Nc-antigener är det möjligt att skilja tidigare virusinfektion (nc- och S/RBD-positiv) från ett vaccinationssvar (endast S/RBD-positivt; Nc-negativ).
I den aktuella studien överfördes 3Flex serologiska och neutraliseringsanalyser (avsnitten 5 och 6) till ett nytt instrument för dubbel reporterflödesanalys (avsnitten 7 och 8). Typiska immunoassay protokoll för pärla-baserade multiplex analyser liknar standard ELISA protokoll, efter jämförbara steg för prov inkubation, detektion antikropp/reporter inkubation och analys av resultat8. Tidigare studier har också visat hur vanliga ELISA-analyser kan överföras till en pärlbaserad multiplexplattform9.
Analysprotokollen skulle sömlöst kunna överföras från det tidigare instrumentet för en enda reporter till det nya systemet med dubbla reporterr, vilket framgår av de resultat som erhållits för proverna och kontrollerna(figur 4 och figur 5). I den serologiska analysen visade alla positiva serumprover en karakteristisk dosresponsiv minskning av signalen som motsvarade både en högre provutspädning och en lägre antikroppskoncentration, medan signalerna för de negativa proverna låg kvar på bakgrundsnivåer. För neutraliseringsanalysen motsvarade också minskande signaler för S och RBD, men inte Nc, ökande koncentrationer av ACE2-konkurrenten, medan IgG-avskalat serum påverkades mycket mindre av tillsats av ACE2. Förinkubation av pärlor med ACE2 i 2 minuter före tillsats av serumprovet (enligt beskrivningen i avsnitten 6 och 8), jämfördes också med att kombinera pärlorna med ACE2 och serum samtidigt och gav liten skillnad i resultaten (data som inte visas). Eftersom de resultat som erhållits med pärlor plus ACE2 före inkubation steg var mer konsekvent, var det dock det slutliga förfarandet som antagits för neutraliseringsanalysprotokollet (avsnitten 6 och 8).
Eftersom det dubbla reportersystemet innehåller en andra fluorescerande reporterkanal omvandlades båda analyserna till isotypningsanalyser för att samtidigt mäta både IgG- och IgM-svar. Flödesanalysatorns dubbla reporterfunktionalitet gör det möjligt att samla in fluorescerande signaler från två reagenser för reporterdetektering för varje analyt i multiplexen för varje prov, vilket effektivt fördubblar de data som genereras per prov i en analys. För utveckling och optimering av de dubbla reporteranalysprotokollen utvärderades flera kommersiellt tillgängliga reporterfärger och detektionsantikroppar för den nya RP2-kanalen (figur 7 och figur 8) för att bestämma det bästa tillgängliga alternativet. Anti-IgM-antikroppen som konjugerades med DL 405-reporterfärgen presterade inte bra i RP2-kanalen (figur 7), så biotinanti-IgG med SASB utvärderades därefter för detektion i RP2-kanalen (figur 8). Tre kombinationer av reagenser för RP1- och RP2-detektion jämfördes i den dubbla reporterneutraliseringsanalysen(tabell 1 och figur 9) för att bestämma de bäst presterande kombinationerna för samtidig detektion av IgG- och IgM-neutraliserande antikroppar. Även om det fanns betydande skillnader i signalintensiteten mellan RP1-kanalen med PE-anti IgM och RP2-kanalen med DL 549 anti-IgM, fanns det ingen signifikant skillnad i mätningen av procentbindningshämningen av ACE2.
Flera begränsningar av den nuvarande metoden och denna studie bekräftas. För det första var de prover som testades och användes i metodutveckling och optimering begränsade till uppsättningar av 8-11 prover. Fler prover kommer att testas i utökade studier för att verifiera att metoden är helt optimerad. För det andra testades ett begränsat antal reporterfluoroforer och reporterpar. Ytterligare testning av alla tillgängliga reportrar i alla möjliga kombinationer kommer att avgöra vilka reagenser som kan användas framgångsrikt i den här metoden. Anti-IgG antikropp konjugerade till biotin var annorlunda än anti-IgG antikroppar konjugerade till BV 421 reporter. Så även om variation i signalintensiteten för BV 421 anti-IgG fanns, kan det bero på antikroppens specificitet och inte relaterad till reporterfärgämnet. Testning av andra tillgängliga BV 421-konjugerade antikroppar kan identifiera en annan antikropp som skulle fungera bra i RP2-kanalen. Framtida studier kommer också att utvärdera kombinationen av PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG för detektion i RP1 respektive RP2. Sist, även med instrumentets dubbla reporterkapacitet, är analyser begränsade till två isotyper (två parametrar) per reaktion. Om ytterligare isotyper ska mätas eller fullständig isotypning önskas, måste ytterligare reaktioner med samma två reporterkanaler köras i separata brunnar.
Pärlbaserad multiplexeringsteknik möjliggör snabb och flexibel analysdesign med enkel implementering i rutinmässiga laboratoriearbetsflöden3,4,10. Denna studie visade hur lätt det är att överföra de tidigare beskrivna 3Flex serologiska och neutraliseringsanalyser för SARS-CoV-2 till ett flödesanalyssystem för att mäta IgG med en enda reporter, eller med liten modifiering, samtidigt som både IgG- och IgM-svar mäts med hjälp av två reportrar. Alternativet med dubbla reporter har tydliga fördelar jämfört med enskilda reporterplattformar eftersom det kan ge dubbelt så mycket data per prov, med hälften av provvolymen och i hälften av antalet reaktionsbrunnar. Med lämpliga reporterfärger och detektionsantikroppar kan isotypningsanalyser enkelt utvecklas och utföras på det dubbla reporterflödesanalysinstrumentet.

COVID-19-pandemin har betonat vikten av att snabbt kunna utveckla och implementera snabba, högpresterande, högpresterande serologiska tester som kan användas för diagnos och övervakning av nya patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologiska tester kan vara extremt användbara i en pandemi, eftersom det samtidigt kan analysera antikroppar mot flera antigener, vilket ger bred patogentäckning och kontroller för variabilitet i organismen och värdens svar på infektion. Utvecklingen av en multiplex fluorescerande pärlbaserad analys, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), som kan upptäcka antikroppar mot spike (S) proteinet, spik angiotensin-omvandla enzym-2 (ACE2) receptorbindande domän (RBD) och nukleocapsid (Nc) av SARS-CoV-2 rapporterades nyligen1. 3Flex visade sig ha jämförbar prestanda med en referens SARS-CoV-2 IgG-analys för serum som erhållits vid ≥21 dagar från symtomuppkomst men hade högre känslighet med prover som samlats in vid ≤5 dagar från symptominställning. Dessutom visades hämning av antikroppsbindning för S- och RBD-antigener med lösliga ACE2 i neutraliseringsanalysformat. Multiplex pärlbaserad teknik har antagits allmänt som en beprövad teknik för multiplex serologisk testning och har tydliga fördelar för storskalig screening, inklusive korta tid-till-resultat, små urvalskrav och minskad arbetskraft2,3,4.
Nyligen har ett nytt flödesanalysinstrument blivit tillgängligt som ger samma högplex, hög genomströmningskapacitet i systemet som demonstrerades i tidigare arbete1, men med den extra fördelen av två reporterkanaler. Förmågan att mäta två fluorescerande reportersignaler i en enda reaktion gör det möjligt att bedöma två resultat per analyt för varje prov och är idealisk för isotypningstillämpningar, som vanligtvis måste utföras i separata reaktionsbrunnar5. Den dubbla reporterkapaciteten ger dubbelt så mycket data för varje prov i hälften så många reaktionsbrunnar med hälften av provvolymkraven och har därmed en klar fördel jämfört med system med enstaka reporter. Denna studie beskriver standard serologiska analys protokollet och beskriver anpassningen till en neutralisering analys. Dessutom beskriver denna rapport omvandlingen av den enda reportern analys till en dubbel reporter serologiska analys, och därefter en dubbel reporter neutralisering analys, att samtidigt mäta neutraliserande antikroppar av både IgG och IgM isotyper mot SARS-CoV-2 S, RBD och Nc antigener. En visuell översikt över analysprotokollet finns i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19-pandemin har understrukit behovet av snabba metoder för hög genomströmning för känslig och specifik serologisk detektion av infektion med nya patogener, såsom SARS-CoV-2. Multiplex serologiska tester kan vara särskilt användbara eftersom det samtidigt kan analysera antikroppar mot flera antigener som optimerar patogentäckningen och kontroller för variabilitet i organismen och det enskilda värdsvaret. Här beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerande mikrosfärbaserad analys som kan upptäcka både IgM- och IgG-antikroppar mot tre stora SARS-CoV-2-antigener-spike (S) proteinet, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptorbindande domän (RBD) och nukleocapsid (Nc). Analysen visade sig ha jämförbar prestanda med en SARS-CoV-2 referensanalys för IgG i serum som erhållits vid ≥21 dagar från symptominställning men hade högre känslighet med prover som samlats in vid ≤5 dagar från symptom inset. Vidare, med hjälp av lösliga ACE2 i ett neutraliseringsanalysformat, visades hämning av antikroppsbindning för S och RBD.

Optimering av Single Reporter Serological Assay. Kopplingsstrategin för alla SARS-CoV-2-antigener beskrivs i Cameron, et al., 20201 och i steg 2.1 ovan. Strategin för kopplingsbekräftelse beskrivs i steg 2.3 ovan. För en effektiv koppling bör medianvärdena för fluorescensintensitet (MFI) vara betydligt högre än värdena för ingen serum/ingen antikroppsnegativ kontrollreaktion och bör påvisa ett dossvar från minskande MFI-signal med minskande mängder detektionsreagens. MFI på cirka 1 000 MFI-enheter eller högre över bakgrund MFI indikerar i allmänhet effektiv proteinkoppling och är beroende av koncentrationen och specificiteten hos det detektionsreagens som används. Med denna metod testades bekräftelse av S-, RBD- och Nc-antigenkoppling för två partier pärlor (figur 2). MFI-signalerna för alla antigener var betydligt högre än bakgrunds-MFI och visade ett dossvar med titrering av detektionsreagenserna. Uppgifterna visade också god reproducerbarhet av MFI-nivåer mellan de två olika partier av kopplade pärlor.
Optimering av den enda reporteranalysen gjordes som beskrivs i Cameron, et al., 20201. Varje antigen testades vid olika kopplingskoncentrationer med olika utspädningar av flera serumprover som representerar höga, medelstora, låga och negativa prover. Dessutom, eftersom analysen mäter IgG-titrar, användes ett IgG-avskalat serum som ett extra negativt prov. Resultaten av en representativ provutspädningsserie med olika antigenkopplingsnivåer visas i figur 3. Denna första utspädningsserie testades med en fast koncentration av detektionsreagenser för att få ett potentiellt intervall av representativa antigenspecifika och bakgrunds MFI-nivåer. Från dessa data fastställdes ytterligare utspädningsintervall för prover och antigenkopplingsnivåer och testades ytterligare med ytterligare prover (data som inte visas).
Därefter optimerades koncentrationen av detektionsreagenset för användning med de olika serumutspädningarna och antigenkopplingsnivåerna. Representativa uppgifter med 6 positiva och 2 negativa prover visas i figur 4. Efter ytterligare tester med flera hundra negativa serumprover före COVID-19 valdes de slutliga optimala antigenkopplingsnivåerna och rektionskoncentrationerna ut för det slutliga analysprotokollet, enligt beskrivningen i avsnitt 5.
Konvertering till en enda reporter neutraliseringsanalys Omvandling av den enda reporter serologiska analysen till en neutraliseringsanalys uppnåddes genom att lägga till ett inkubationssteg med ACE2 (som konkurrerande reagens) med pärlor innan serumprovet tillsätts. Genom att titrera mängden ACE2 tillsatt observerades hämning av IgG-bindning till S- och RBD-antigenerna, vilket visas i figur 5. Medan de 11 patienten serum hade olika titers av IgG, visade var och en en betydande minskning av MFI signal med ökande ACE2 koncentration. Ace2 påverkar som förväntat endast MFI-signalerna från S och RBD, men inte Nc-antigenet.
Den procentre restsignalen för MFI i förhållande till 0 μg/ml ACE2 för alla prover visas i figur 6. För de flesta prover observerades en signalförlust >30% för S och RBD med ökande ACE2-koncentration. Som förväntat fanns det ingen effekt av ACE2 på Nc-signalen.
Konvertering till en dubbel reporter IgG och IgM serologisk analys För den dubbla reportern IgG och IgM-analysen användes standardstandarden för en reporters analysvillkor för att testa olika antikropps- och reporterkombinationer för de två reporterkanalerna. RP1-kanalen liknar tidigare flödesanalysinstrument med detektering av "orange" fluorescens för reporterfärgämnen som PE. Den andra kanalen, RP2, använder en violett excitationslaser som kan användas för att upptäcka den "blå" fluorescensen av färgämnen som är upphetsade vid 402 nm med utsläppsspektratoppar i intervallet 421-441 nm.
Flera olika anti-humana IgG- och IgM-antikroppskombinationer testades vid olika koncentrationer med de standard 2 000-faldiga provutspädnings- och inkubationsförhållandena som beskrivs i avsnitt 6. Ett första test av anti-IgM konjugerat till DyLight 405 reporter färgämne (DL 405; excitation vid 400 nm och utsläpp vid 420 nm) för RP2 kanalen utfördes med hjälp av en uppsättning av 11 PCR-positiva prover med DFSO som sträcker sig från 5 till >60 dagar, och en IgG-strippad serum prov. Detta detektionsreagens gav ingen hög signal i RP2-kanalen enligt figur 7A, B, C. För prover med hög IgM RP2 MFI sågs de högsta signalerna för RBD och Nc (Figur 7B,C). Medan IgM titers bör höjas vid denna tidpunkt i vissa prover, de observerade MFI nivåer inte överstiger 140 MFI enheter med IgM detektion reagens. Dessutom saknade kontrollpärlan för IgM ett betydande dynamiskt intervall för MFI vid användning av DL 405 konjugerat till anti-IgM jämfört med en PE-märkt anti-IgM RP1-reporter som används vid samma koncentrationer (figur 7D).
Eftersom ett lämpligt RP2-reagens för IgM inte var tillgängligt testades den ursprungliga biotinanti-IgG med SASB för användning i RP2-kanalen. Signalen för IgG i RP2-kanalen med SASB hade inte samma dynamiska räckvidd som med SAPE, men den hade fortfarande ett lämpligt intervall för att mäta IgG-titrar för S, RBD och Nc (figur 8). Dessa data ledde till testning av olika kombinationer av RP1 IgM- och RP2 IgG-detekteringsreagens, enligt beskrivningen nedan.
Konvertering till dubbel reporterneutraliseringsanalys Den dubbla reporter serologiska analysen omvandlades till en neutraliseringsanalys genom att lägga till ett inkubationssteg med ACE2 och pärlor, innan serumprovet tillsätts. En 2-faldig utspädningsserie av ACE2 som börjar vid 16 μg/ml användes och testades sedan med uppsättningar av 11 prover och avskalad serum enligt beskrivningen ovan. Dessutom testades 3 olika kombinationer av RP1 IgM- och RP2 IgG-detektionsantikroppsblandningar på en uppsättning av 11 prover och avskalade serumkontroller. De slutliga kombinationerna och reagenskoncentrationerna som bedöms vara optimala beskrivs i tabell 1.
För IgG-detektion testades biotin anti-human IgG/SASB som används i den ursprungliga enskilda reporteranalysen tillsammans med en annan anti-IgG konjugerad till BV reporter färgämne. Medan BV-konjugaten hade höga RP2 MFI-signaler varierade MFI-signalintensiteten för IgG-titern över ACE2-titreringarna(figur 9A,C,E). Kombinationen av biotinantimänsklig IgG/SASB hade en mer konsekvent MFI-signalminskning över ACE2-titreringen jämfört med BV-konjugaten, vilket visade ett dossvar, även om MFI- nivåerna var lägre. Signalfluktuationerna från BV-konjugaten över ACE2-koncentrationerna störde också ACE2:s procentuella hämning i hela IgG-titrar jämfört med kombinationen av biotinanti-human IgG/SASB(figur 9B,D,F). Prover med låga MFI-signaler, såsom DFSO 3-provet, har inte tillräckligt höga titrar för att utvärdera prestandan hos dessa reagenser eller mäta IgG-neutraliseringskapacitet.
För bestämning av IgM-titrar i RP1-kanalen jämfördes en PE-konjugerad anti-IgM med en antimänskliga IgM konjugerad till DyLight 549-reporterfärgämnet (DL 549; excitation vid 562 nm och utsläpp vid 576 nm) vid de koncentrationer som anges i tabell 1. Av dessa två reagenser uppvisade PE-anti-IgM högre MFI än de som genererades av DL 549 antimänskisk IgM för de testade proverna(figur 9A,C,E). IgM-kontrollpärlan som mätte tillsatsen av dessa reagenser hade olika genomsnittliga MFI på ≈17 000 för PE-anti-IgM och 2 723 för DL 549 konjugat. Även med dessa skillnader var effekten av de olika ACE2-koncentrationerna på MFI mätbar med DL 549 konjugat. För att bestämma ACE2 procent hämning av IgM-bindning fanns det en liten men obetydlig skillnad mellan de två IgM-detektionsreagenserna(figur 9B,D, F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kombination</td>
			<td rowspan="2">Reporter</td>
			<td colspan="2">Slutlig koncentration i brunn (μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1 (RP1)</td>
			<td>RP2 (RP2)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig (biotin-Ig)</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB (sasb)</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Briljant violett 421 antimänniskt IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 Anti-Human IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig (biotin-Ig)</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB (sasb)</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Lista över testade RP1- och RP2-kombinationer av reporterfärger. Flera olika RP1 och RP2 reporter färgämnen utvärderades för att mäta IgG och IgM titers. De tre kombinationerna som visas ovan testades i olika RP1-detekteringslägen och för optimering av neutraliseringsanalysen. För RP2-kombinationer med SASB visas koncentrationer för den biotinylerade detektionsantikroppen och SASB. *Slutlig koncentration representerar den slutliga koncentrationen i reaktionsbrunnen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Bild 1:Flödesschema som belyser protokollstegen för huvudanalys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Figur 2:Bekräftelse av antigenkoppling. Antigener kopplades vid 100, 10 och 1 pmol/106 pärlor. För S- och RBD-antigener användes kanin anti-S serum och upptäcktes med PE anti-kanin IgG. För Nc användes en Protein G-renad kanin polyklonal anti-Nc. Titreringskurvorna för pärlor i kombination med 22:00 S (A), 100 pmol RBD (B) och 100 pmol Nc (C) visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Figur 3:Optimering av serumutspädning med olika antigenkopplingsnivåer. Serumprover som representerar höga, medelstora, låga och negativa prover testades med de olika pmolantigen/106 pärlkopplingarna. En 4-faldig serum titrering testades med en multiplex blandning av antigen-kopplade pärlor med hjälp av analys protokollet beskrivs i avsnitt 5. MFI-värdena för titreringskurvorna för S (A), RBD (B) och Nc (C) visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Figur 4:Bestämning av optimal serumutspädning och reagenskoncentration. Åtta serumprover, inklusive negativa patienter (2 prover) och låg- till högpositiva (6 prover), testades vid ytterligare serumutspädningar med tre olika reagenskoncentrationer. MFI-resultaten visas för S (A), RBD (B) och Nc (C). Baserat på dessa och andra data (ej visas) valdes en provutspädning på 1:2 000 och en antikroppskoncentration för biotindetektering på 0,62 μg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Figur 5:Optimering av en enda reporter neutraliseringsanalys. Modifiering av den enda reportern serologiska analys till en neutraliserande antikropp detektion analys utfördes genom att lägga till ett inkubationssteg med ACE2 som en konkurrent, som beskrivs i avsnitt 6. En uppsättning av 11 prover, allt från låg- till högpositiv titer serum serumprov, testades med en tvåfaldig utspädningsserie av ACE2 från 4 μg/ml, med hjälp av standardtestförhållanden. Inom detta intervall av ACE2-koncentrationer kan en minskning av MFI ses med ökad ACE2 för S (A) och RBD (B), men inte för Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Figur 6:Procentuell signalhämning med ACE2. De procentiga restsignalerna för uppsättningen av 11 prover (från figur 4) visas. För varje prov uppnåddes, oavsett dess IgG-titer, en maximal minskning på ≥30% MFI-signal för S (A) och RBD (B) vid den högsta ACE2-koncentrationen. För Nc-antigenet (C) fanns det ingen signifikant signalhämning med någon mängd ACE2-testad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Bild 7:Test av DyLight 405 anti-IgM som RP2 IgM detektionsreagens. En uppsättning av 11 prover och IgG-avskalad serum användes för att testa DL 405-konjugerad anti-IgM som en RP2 detektering reagens. RP2 IgM MFI-signalerna för S (A), RBD (B) och Nc (C) visas. Den högsta MFI-signalen för något antigen med något prov var cirka 140 MFI-enheter för RINGPÄRM MED prov H (B). Även signalen på IgM-kontrollpärlan var mindre än 1 000 MFI i RP2-kanalen över hela antikroppstittrarområdet och visade inte det ökade dynamiska intervallet som observerades med PE-anti-IgM-detektionsantikroppen i RP1-kanalen (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Bild 8:Optimering av SASB som RP2-reporter med Biotin anti-IgG. En uppsättning av 11 prover och IgG-avskalad serum användes för att testa en utspädningsserie av SASB med standard 0,62 μg/mL biotin anti-IgG. De resulterande IgG MFI i RP2-kanalen för S (A), RBD (B) och Nc (C) visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Figur 9: Jämförelse av tre olika kombinationer av RP1 IgM- och RP1 IgG-detektionsblandningar. Tre olika detektion antikropp blandningar testades på 11 prover och IgG strippade serum. De kombinationer och slutliga koncentrationer som används beskrivs i tabell 1. Alla prover testades med en 2-faldig ACE2 utspädning, från 16 μg/ml. Data för prover vid DFSO på 3, 12 och 30 dagar visas. MFI-signalerna för RP1 IgM (orange) och RP2 IgG (blå) visas i A (DFSO 3), C (DFSO 12) och E (DFSO 30). ACE2 procent kvarvarande MFI visas i B (DFSO 3), D (DFSO 12) och F (DFSO 30). Signaler som representerar >30% minskning jämfört med No ACE2-kontroller markeras ljusgrönt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Ett flödesanalyssystem för pärlbaserade multiplexerade analyser som ger en avläsning av två reporter användes för utveckling av multiplex serologiska och antikroppsneutraliseringsanalyser som samtidigt kan mäta neutraliserande IgG- och IgM-antikroppar för SARS-CoV-2.

En snabb, Multiplex Dual Reporter IgG och IgM SARS-CoV-2 neutraliseringsanalys för ett multiplexerat pärlbaserat flödesanalyssystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Vår kännedom om detta är det första exemplet på ett pärlbaserat multiplexeringsprotokoll som använder två reportersignaler för att samtidigt mäta två resultat per analyt. Denna teknik gör det möjligt för användaren att mäta antigenspecifik IgM och IgG samtidigt, med mindre prov och kortare tid till resultat. Även om denna dubbla reportermetod är specifik för antikroppsisottypning, kan den anpassas för att mäta andra analytpar, till exempel postöversättningsändringar eller fria kontra bundna läkemedelsformer.Vi demonstrerar vår procedur idag och har Dr.Steve Angeloni, en senior fältapplikationsforskare för Luminex Corporation. För att börja den dubbla reportern IgG och IgM serologisk analys, förbered de nödvändiga multiplexpärlorna från de enskilda parpärlorna och kontrollera pärlbestånden i en koncentration av en gånger 10 till de sex pärlor per milliliter. Späd sedan serumproverna 100 gånger genom att tillsätta 10 mikroliter serum till 990 mikroliter PBS-TBN-buffert och späd sedan proverna ytterligare tiofaldigt genom att tillsätta 20 mikroliter av utspädningen på 1:100 till 180 mikroliter PBS-TBN.När pärlblandningarna och serumproverna är klara, tillsätt 50 mikroliter av multiplexpärlans blandningar till de tilldelade brunnarna på en 96-brunns icke-bindande mikrotiterplatta och tillsätt sedan 50 mikroliter av de utspädda serumproverna till lämpliga brunnar. När alla prover har lagts till, täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Separera sedan pärlorna från reaktionsblandningen genom att placera plattan på en magnetisk plåtavskiljare i två minuter.Håll plattan på magneten, ta bort folietätningen. Vänd sedan försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt ut supernaten ur brunnarna. Medan du fortfarande håller plattan på magneten, blot plattan på absorberande papper.För att tvätta reaktionsbrunnarna, ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 mikroliter PBS-TBN till varje brunn. Täck plattan med en ny folietätning och inkubera på den uppvärmda skakapparaten i två minuter innan du placerar tillbaka den på plåtmagneten i ytterligare två minuter. Samtidigt som du håller plattan på magneten, vänd plattan för att kassera supernaten och fläcka plattan på absorberande papper.Efter den andra PBS-TBN-tvätten, ta bort plattan från magneten och tillsätt 100 mikroliter färsk detekteringsreagensblandning till varje brunn. Efter att ha täckt plattan med en mikroplatta folie tätning, placera den på en uppvärmd plattskakapparat i 15 minuter och sedan på en magnetisk plåtavskiljare i två minuter. Medan plattan är på magneten, kassera Detection Reagent-blandningen genom att vända plattan över en avfallsbehållare och blotta den på absorberande papper.Tvätta reaktionsbrunnarna med PBS-TBN dubbelt så mycket som tidigare visats och ta sedan bort plattan från magneten. Tillsätt 100 mikroliter PBS-TBN till varje brunn och täck sedan plattan med folietätning och skaka i två minuter vid 37 grader Celsius. Ta bort folietätningen och fortsätt att avläsa 50 mikroliter av provet från varje brunn i flödesanalysatorn.Om du vill läsa plattan väljer du rullgardinsmenyn i det övre vänstra hörnet, navigerar till Plåtkonfiguration, läser in den tidigare konfigurerade plattan och väljer Kör platta. Mata ut plåthållaren genom att välja utmatningsikonen, ladda sedan plattan på plåthållaren och välj ikonen Dra tillbaka för att dra tillbaka plåthållaren. När plåthållaren har dragit ut på analysatorn väljer du ikonen Kör för att börja läsa plattan.För den dubbla reporterneutraliseringsanalysen, tillsätt 50 mikroliter av multiplexpärlanblandningar till tilldelade brunnar av en 96-brunns ickebindande mikrotiterplatta, tillsätt sedan 25 mikroliter av två mikrogram per milliliter ACE2 till varje brunn och täckte plattan med en folietätning. Efter en två minuters inkubation på en uppvärmd plattskakapparat, tillsätt 25 mikroliter av 1:500 serumutspädningar till de tilldelade brunnarna. När alla prover har lagts till utför du inkubations-, tvätt-, detektions- och analysstegen som tidigare visats för den serologiska analysen.Ett test av anti-IgM konjugerade till DyLight 405 reporter färgämne med serum prover inom fem till 60 dagar från symptom inset och en IgG remsa serum prov gav inte en hög signal för spik antigen. För prover med hög IgM-medelfluorescensintensitet sågs de högsta signalerna för receptorbindningsdomänen och nukleocapsidantigener. Medan IgM titer borde ha förhöjts i vissa prover, den observerade medel fluorescens intensitet nivåer inte överstiger 140 MFI enheter.Dessutom saknade kontrollpärlan för IgM ett betydande dynamiskt intervall för medianfluorescensintensitet vid användning av DyLight 405 konjugerat till anti-IgM jämfört med en fykoerythrinmärkt anti-IgM vid samma koncentration. För IgG-detektion hade den briljanta violetta konjugaten högre medianfluorescensintensitetssignaler än streptavidinkonjugaten av fluorfor Super Bright 436. Signalintensiteten för den briljanta violetta konjugaten varierade dock över ACE2-titreringarna.Denna signalfluktuation av den briljanta violetta konjugaten över ACE2-koncentrationer störde också ace2s procentuella hämning i hela IgG-titrar. För IgM-detektion visade phycoerythrin anti-IgM högre signaler än de som genereras av DyLight 549 anti-human IgM. Medan avgörande ACE2 procent hämning av IgM bindning, det fanns en liten men obetydlig skillnad mellan de två IgM detektion reagenser.Så ett av de viktigaste stegen i proceduren är att förbereda din multiplexpärlorblandning från dina enskilda pärlaktier och se till att du gör det korrekt. Så detta förfarande kan också användas för att mäta effekten av vacciner och övervaka immunsvaren mot andra patogener också.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generation av två färger Antigen Microarrays för samtidig detektion av IgG och IgM autoantikroppar

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Bead baserat Multiplex Assay för analys av tår cytokin profiler

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 Kvantitativ omvänd transkriptas PCR Saliva Diagnostisk strategi med hjälp av öppen källkod pipettering robotar

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Samtidig påvising av olika antikroppsklasser i ett multiplexerat serologiskt test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypade virus som ett molekylärt verktyg för att övervaka humana immunsvar mot SARS-CoV-2 via neutralisationsanalys

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Påvisande av rabies-, IgG- och IgM-antikroppar med hjälp av det indirekta fluorescerande rabiesantikroppstestet

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...