Name: a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

Bu rapor Luminex Corporation (Austin, TX) tarafından finanse edildi. Yazarlar matthew Silverman PhD'ye (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) bilimsel düzenleme yardımı için teşekkür ediyor.

<ol>
	<li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization.">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).</li><li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins.">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li><li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides.">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li><li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus.">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li><li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Vastl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+determination+of+antibodies.">Isotype determination of antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 116, 1-7 (2017).</li><li>. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020)</li><li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020)</li><li>Indirect ELISA protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021)</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).</li><li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus,+diphtheria,+and+Haemophilus+influenzae+Type+b.">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li></ol>

Stephen Angeloni ve Sherry Dunbar, bu çalışmada kullanılan bazı reaktifleri ve enstrümanları üreten Luminex Corporation'ın çalışanlarıdır. Bu makalenin Açık Erişim yayını Luminex Corporation sponsorluğunda yayınlanmıştır.

Bu çalışma, SARS-CoV-21tarafından enfeksiyona igg yanıtını nitel olarak değerlendiren çok katlı floresan mikroküreci test, 3Flex'in işlevselliğini genişletti. COVID-19 için birçok serolojik test tek bir antijen tespit ederken, bu test aynı anda S, RBD ve Nc antijenlerini değerlendirir ve bir iç antikor izotip kontrolüiçerir 7. Ek olarak, ACE2 SARS-CoV-2 nötralize edici antikor titrelerini tespit etmek için bir gösterge olarak kullanılır.
Multi-antijen tahlilleri, enfekte ve aşılanmış kişiler arasında bağışıklık yanıtlarını ayırt etmek için gelecekte özellikle yararlı olabilir. SARS-CoV-2 ile, sadece S ve RBD antikorları değerlendirilirse, bunun geçmişteki bir enfeksiyondan mı yoksa aşı antikor yanıtına mı bağlı olduğunu ayırt etmek imkansız olacaktır. Şu anda kullanılmakta olan aşıların hiçbiri Nc antijenini hedef almamaktadır, bu nedenle S / RBD ve Nc antijenlerini değerlendirerek, geçmiş viral enfeksiyonu (Nc- ve S / RBD-pozitif) bir aşılama yanıtından (yalnızca S / RBD pozitif) ayırt etmek mümkündür; Nc-negatif).
Mevcut çalışmada, 3Flex serolojik ve nötralizasyon tahlilleri (bölüm 5 ve 6) yeni bir çift muhabir akış analiz cihazına (bölüm 7 ve 8) aktarıldı. Boncuk bazlı multipleks tahlilleri için tipik immünoassay protokolleri, numune inkübasyonu, algılama antikor/ muhabir inkübasyonu ve sonuçların analizi için karşılaştırılabilir adımları izleyerek standart ELISA protokollerine benzer8. Önceki çalışmalar, standart ELISA testlerinin boncuk tabanlı çoklama platformuna nasıl aktarabileceğini degöstermiştir 9.
Test protokolleri, test örnekleri ve kontrolleri için elde edilen sonuçlarda gösterildiği gibi, selefi tek muhabir cihazından yeni çift muhabir sistemine sorunsuz bir şekilde aktarılabilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Serolojik testte, tüm pozitif serum örnekleri hem daha yüksek bir numune seyreltme hem de daha düşük bir algılama antikor konsantrasyonuna karşılık gelen sinyalde karakteristik bir doza duyarlı düşüş gösterirken, negatif numunelerin sinyalleri arka plan seviyelerinde kaldı. Benzer şekilde, nötralizasyon tahlilleri için, S ve RBD için azalan sinyaller, ancak Nc değil, ACE2 rakibinin artan konsantrasyonlarına karşılık gelirken, IgG soyulmuş serum ACE2'nin eklenmesinden çok daha az etkilendi. Serum örneğinin eklenmesinden önce 2 dakika boyunca ACE2 ile boncukların önceden inkübe edilmesi (bölüm 6 ve 8'de açıklandığı gibi), boncukların aynı anda ACE2 ve serum ile birleştirilmesiyle karşılaştırıldı ve sonuçlarda çok az fark yarattı (veriler gösterilmedi). Bununla birlikte, boncuklar artı ACE2 ön kuluçka adımı ile elde edilen sonuçlar daha tutarlı olduğundan, nötralizasyon test protokolü için kabul edilen son prosedürdü (bölüm 6 ve 8).
çift muhabir sistemi ikinci bir floresan muhabir kanalı içerdiğinden, her iki test de hem IgG hem de IgM yanıtlarını aynı anda ölçmek için isotyping testlerine dönüştürüldü. Akış çözümleyicisinin çift muhabir işlevselliği, her örnek için çoklamadaki her bir analiz için iki muhabir algılama reaktifinden floresan sinyallerin toplanmasına izin verir ve bir testte örnek başına oluşturulan verileri etkili bir şekilde iki katına çıkarır. Çift muhabir tahlil protokollerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu için, mevcut en iyi seçenekleri belirlemek için yeni RP2 kanalı(Şekil 7 ve Şekil 8)için piyasada bulunan birkaç muhabir boyası ve algılama antikoru değerlendirildi. DL 405 muhabir boyası ile konjuge edilen anti-IgM antikoru RP2 kanalında iyi performans göstermemiştir (Şekil 7), bu nedenle SASB'li biotin anti-IgG daha sonra RP2 kanalında tespit için değerlendirildi (Şekil 8). IgG ve IgM nötralize edici antikorların eşzamanlı olarak tespiti için en iyi performans gösteren kombinasyonları belirlemek için çift muhabir nötralizasyon testinde(Tablo 1 ve Şekil 9)RP1 ve RP2 algılama reaktiflerinin üç kombinasyonu karşılaştırıldı. PE-anti IgM kullanan RP1 kanalı ile DL 549 anti-IgM kullanan RP2 kanalı arasındaki sinyal yoğunluğunda önemli farklılıklar olsa da, ACE2 tarafından yüzde bağlayıcı inhibisyonun ölçümünde önemli bir fark yoktu.
Mevcut yöntem ve bu çalışmada çeşitli sınırlamalar kabul edilmektedir. İlk olarak, yöntem geliştirme ve optimizasyonunda test edilen ve kullanılan numuneler 8-11 örnek setleri ile sınırlıydı. Yöntemin tamamen optimize edildiğini doğrulamak için genişletilmiş çalışmalarda daha fazla örnek test edilecektir. İkinci olarak, sınırlı sayıda muhabir floroforu ve muhabir çifti test edildi. Mevcut tüm muhabirlerin olası tüm kombinasyonlarda daha fazla test edilmesi, bu yöntemde hangi reaktiflerin başarıyla kullanılabileceğini belirleyecektir. Biotin'e konjuge edilen anti-IgG antikoru, BV 421 muhabirine konjuge edilen anti-IgG antikorundan farklıydı. Yani, BV 421 anti-IgG için sinyal yoğunluğundaki değişkenlik mevcut olsa da, antikorun özgüllüğünden kaynaklanabilir ve muhabir boyasıyla ilgili olmayabilir. Mevcut diğer BV 421 konjuge antikorların test edilmesi, RP2 kanalında iyi performans gösteren başka bir antikor tanımlayabilir. Gelecekteki çalışmalar ayrıca PE anti-IgM'nin sırasıyla RP1 ve RP2'de tespit için BV 421 anti-insan IgG ile kombinasyonunu değerlendirecektir. Son olarak, cihazın çift muhabir yeteneğine rağmen, tahliller reaksiyon başına iki izotip (iki parametre) ile sınırlıdır. Ek izotipler ölçülecekse veya tam izotiyping isteniyorsa, aynı iki muhabir kanalını kullanan ek reaksiyonların ayrı kuyularda çalıştırılması gerekir.
Boncuk bazlı çoklama teknolojisi, rutin laboratuvar iş akışlarına kolay uygulama ile hızlı ve esnek tahlil tasarımı sağlar3,4,10. Bu çalışma, SARS-CoV-2 için daha önce tanımlanmış 3Flex serolojik ve nötralizasyon testlerinin, IgG'yi tek bir muhabirle veya hafif bir değişiklikle ölçmek için bir akış analiz sistemine aktarılmasındaki kolaylığı gösterdi, aynı anda iki muhabir kullanarak hem IgG hem de IgM yanıtlarını ölçtü. Çift muhabir seçeneği, tek muhabir platformlarına göre net avantajlara sahiptir, çünkü örnek hacminin yarısını ve reaksiyon kuyularının yarısını kullanarak örnek başına iki kat daha fazla veri sağlayabilir. Uygun muhabir boyaları ve algılama antikorları ile çift muhabir akış analiz cihazı üzerinde isotyping tahlilleri kolayca geliştirilebilir ve yapılabilir.

COVID-19 salgını, SARS-CoV-2 gibi yeni patojenlerin tanı ve gözetimi için kullanılabilecek hızlı, yüksek verimli, yüksek performanslı serolojik testleri hızla geliştirebilmenin ve uygulayabilmenin önemini vurgulamıştır. Multipleks serolojik test, organizmada değişkenlik ve enfeksiyona konak yanıtı için geniş patojen kapsamı ve kontrolleri sağlayan birden fazla antijene karşı antikorları aynı anda analiz edebildiği için bir pandemide son derece yararlı olabilir. Spike (S) proteinine karşı antikorları tespit edebilen sars-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), spike anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 (ACE2) reseptör bağlayıcı etki alanı (RBD) ve SARS-CoV-2'nin nükleokapsit (Nc) olan çok katlı floresan boncuk bazlı bir testinin geliştirilmesi yakın zamanda bildirilmiştir1. 3Flex'in semptom başlangıcından itibaren ≥21 gün sonra elde edilen serum için referans SARS-CoV-2 IgG testine benzer performansa sahip olduğu, ancak semptom başlangıcından itibaren ≤5 günde toplanan örneklerle daha yüksek hassasiyete sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca çözünür ACE2 kullanılarak S ve RBD antijenleri için nötralizasyon testi formatında antikor bağlanmasının inhibisyonu gösterilmiştir. Multipleks boncuk tabanlı teknoloji, çok katlı serolojik testler için kanıtlanmış bir teknoloji olarak yaygın olarak benimsenmiştir ve kısa sonuç alma süresi, küçük numune gereksinimleri ve azaltılmışişçilik2,3,4dahil olmak üzere büyük ölçekli tarama için belirgin avantajlara sahiptir.
Son zamanlarda, önceki çalışma1'de gösterilen sistemin aynı yüksek pleks, yüksek aktarım hızı yeteneğini sağlayan yeni bir akış analizi aracı kullanılabilir hale geldi, ancak iki muhabir kanalının ek avantajıyla. İki floresan muhabir sinyalini tek bir reaksiyonda ölçme yeteneği, her örnek için analiz başına iki sonucun değerlendirilmesine izin verir ve genellikle ayrı reaksiyon kuyularında yapılması gereken isotyping uygulamaları için idealdir5. Çift muhabir yeteneği, her numune için örnek hacmi gereksinimlerinin yarısı kadar reaksiyon kuyusunda iki kat veri sağlar ve böylece tek muhabir sistemlerine göre açık bir avantaja sahiptir. Bu çalışma standart serolojik tahlil protokolünü detaylandırmaktadır ve nötralizasyon testine adaptasyonu açıklar. Ek olarak, bu rapor, sars-CoV-2 S, RBD ve Nc antijenlerine karşı hem IgG hem de IgM izotiplerinin nötralize edici antikorlarını aynı anda ölçmek için tek muhabir testinin çift muhabir serolojik testine ve daha sonra çift muhabir nötralizasyon testine dönüştürülmesini açıklar. Şekil 1'detahlil protokolüne görsel bir genel bakış sağlanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE2 (human) (rec.)</td>
			<td>AdipoGen Life Sciences</td>
			<td>AG-40B-0192-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-065-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&#956;&#160;fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-475-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 549 AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-506-129</td>
			<td>Discontinued but available from multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Incubating Microplate Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-217-757</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P-2771MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex beads</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>MC100XX-ID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE AffiniPure F(ab&#39;)2 Goat Anti-Human IgM Fc5&#956; specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>109-116-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56683</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Nucleocapsid Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56049</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56047</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS Spike Protein Antibody</td>
			<td>Novos Biologicals</td>
			<td>NB100-56048</td>
			<td>Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb</td>
			<td>SinoBiological</td>
			<td>40150-R007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S21388</td>
			<td>premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/ Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Couplng Kit</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, multiplex dual reporter igg and igm sars-cov-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system

COVID-19 salgını, SARS-CoV-2 gibi yeni patojenlerle enfeksiyonun hassas ve spesifik serolojik tespiti için hızlı yüksek verimli yöntemlere duyulan ihtiyacın altını çizmektedir. Multipleks serolojik test özellikle yararlı olabilir, çünkü patojen kapsamını optimize eden birden fazla antijene karşı antikorları aynı anda analiz edebilir ve organizmada ve bireysel konak yanıtta değişkenlik kontrollerini yapabilir. Burada, üç büyük SARS-CoV-2 antijeni-başak (S) proteini, spike anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 (ACE2) reseptör bağlayıcı etki alanı (RBD) ve nükleokapsid (Nc) için hem IgM hem de IgG antikorlarını tespit edebilen SARS-CoV-2 IgG 3-pleks floresan mikrokürebilgi bazlı bir test açıklıyoruz. Test, semptom başlangıcından itibaren ≥21 gün sonra elde edilen serumda IgG için SARS-CoV-2 referans testine benzer performansa sahip olduğu, ancak semptom başlangıcından itibaren ≤5 günde toplanan örneklerle daha yüksek hassasiyete sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca nötralizasyon testi formatında çözünür ACE2 kullanılarak S ve RBD için antikor bağlanmasının inhibisyonu gösterilmiştir.

Tek Muhabir Serolojik Tahlilinin Optimizasyonu. Tüm SARS-CoV-2 antijenleri için bağlantı stratejisi Cameron, ve diğerleri, 20201 ve yukarıdaki 2.1 adımda açıklanmıştır. Bağlantı onayı stratejisi yukarıdaki 2.3. Etkili bir kavrama için, ortanca floresan yoğunluğu (MFI) değerleri serumsuz /antikorsuz negatif kontrol reaksiyonlarından önemli ölçüde daha yüksek olmalı ve azalan MFI sinyalinin azalan algılama reaktifi ile doz tepkisini göstermelidir. Yaklaşık 1.000 MFI birimi veya daha büyük arka plan MFI'lerinin MFI'leri genellikle verimli protein kavramasını gösterir ve kullanılan algılama reaktifinin konsantrasyonuna ve özgüllüğüne bağlıdır. Bu yöntem kullanılarak, S, RBD ve Nc antijen kavramasının teyidi iki sürü boncuk için test edilmiştir (Şekil 2). Tüm antijenler için MFI sinyalleri arka plan MFI'den önemli ölçüde daha yüksekti ve algılama reaktiflerinin titrasyon ile bir doz yanıtı gösterdi. Veriler ayrıca iki farklı çift boncuk arasında MFI seviyelerinin iyi tekrarlanabilirliğini gösterdi.
Tek muhabir tahlilinin optimizasyonu Cameron'da açıklandığı gibi yapıldı, vd., 20201. Her antijen, yüksek, orta, düşük ve negatif örnekleri temsil eden çeşitli serum örneklerinin farklı seyreltmeleri ile farklı kavrama konsantrasyonlarında test edildi. Ek olarak, test IgG titrelerini ölçtüğü için, igg sıyrılmış bir serum ek negatif örnek olarak kullanılmıştır. Farklı antijen kavrama seviyelerine sahip temsili bir numune seyreltme serisinin sonuçları Şekil 3'tegösterilmiştir. Bu ilk seyreltme serisi, potansiyel bir temsili antijene özgü ve arka plan MFI seviyesi aralığı elde etmek için sabit bir algılama reaktif konsantrasyonu ile test edildi. Bu verilerden ek numune seyreltme aralıkları ve antijen kavrama düzeyleri belirlenmiş ve ek numunelerle daha fazla test edilmiştir (veriler gösterilmemektedir).
Daha sonra, algılama reaktifinin konsantrasyonu farklı serum seyreltmeleri ve antijen kavrama seviyeleri ile kullanılmak üzere optimize edildi. Şekil 4'te6 pozitif ve 2 negatif örnek kullanılarak temsili veriler gösterilmiştir. Covid-19 öncesi birkaç yüz serum örneği ile yapılan ek testlerin ardından, bölüm 5'te açıklandığı gibi son tahlil protokolü için nihai optimal antijen kavrama seviyeleri ve algılama naibi konsantrasyonları seçildi.
Tek bir muhabir nötralizasyon testine dönüştürme Tek muhabir serolojik testinin nötralizasyon testine dönüştürülmesi, serum örneğini eklemeden önce boncuklarla ACE2 (rakip bir reaktif olarak) kullanılarak bir kuluçka adımı eklenerek elde edildi. Eklenen ACE2 miktarının titratlanmasıyla, Şekil 5'tegösterildiği gibi, S ve RBD antijenlerine IgG bağlanmasının inhibisyonu gözlenmiştir. 11 hasta serada farklı IgG titreleri varken, her biri artan ACE2 konsantrasyonu ile MFI sinyalinde önemli bir azalma gösterdi. Beklendiği gibi, ACE2 sadece S ve RBD'nin MFI sinyallerini etkiler, ancak Nc antijenini etkilemez.
Tüm numuneler için 0 μg/mL ACE2'ye göre kalan MFI sinyali yüzdesi Şekil 6'dagösterilmiştir. Çoğu örnek için, artan ACE2 konsantrasyonu ile S ve RBD için % 30'> bir sinyal kaybı gözlendi. Beklendiği gibi, ACE2'nin Nc sinyali üzerinde bir etkisi olmadı.
Çift muhabir IgG ve IgM serolojik testine dönüştürme Çift muhabir IgG ve IgM testi için, standart tek muhabir tahlil koşulları, iki muhabir kanalı için farklı antikor ve muhabir kombinasyonlarını test etmek için kullanıldı. RP1 kanalı, PE gibi muhabir boyaları için "turuncu" floresan tespiti ile önceki akış analiz araçlarına benzer. İkinci kanal olan RP2, 421-441 nm aralığında emisyon spektrum zirveleri ile 402 nm'de heyecanlanan boyaların "mavi" floresanını tespit etmek için kullanılabilecek bir menekşe ekscitasyon lazeri kullanmaktadır.
Bölüm 6'da ayrıntılı olarak açıklanan standart 2.000 kat numune seyreltme ve kuluçka koşulları ile çeşitli konsantrasyonlarda birkaç farklı anti-insan IgG ve IgM antikor kombinasyonu test edilmiştir. RP2 kanalı için DyLight 405 muhabir boyasına (DL 405; 400 nm'de eksilasyon ve 420 nm emisyon) eşlenen anti-IgM'nin ilk testi, DFSO ile 5 ila > 60 gün arasında değişen 11 PCR pozitif örnek seti ve IgG-sıyrılmış serum örneği kullanılarak gerçekleştirildi. Bu algılama reaktifi, Şekil 7A,B,C'degösterildiği gibi RP2 kanalında yüksek bir sinyal üretmedi. Yüksek IgM RP2 MFI'ye sahip numuneler için, rbd ve nc için en yüksek sinyaller görülmüştür (Şekil 7B, C). Bazı örneklerde igm titrelerinin şu anda yükseltilmesi gerekirken, gözlemlenen MFI seviyeleri IgM algılama reaktifi ile 140 MFI ünitesini geçmedi. Ayrıca, IgM için kontrol boncuk, aynı konsantrasyonlarda kullanılan PE etiketli bir anti-IgM RP1 muhabirine kıyasla anti-IgM'ye konjuge edilmiş DL 405 kullanırken MFI için önemli bir dinamik aralıkta değildi (Şekil 7D).
IgM için uygun bir RP2 muhabir etiketli algılama reaktifi mevcut olmadığından, SASB'li orijinal biotin anti-IgG, RP2 kanalında kullanılmak üzere test edildi. SASB'li RP2 kanalındaki IgG sinyali SAPE ile aynı dinamik aralığa sahip değildi, ancak yine de S, RBD ve Nc için IgG titerlerini ölçmek için uygun bir menzile sahipti (Şekil 8). Bu veriler, aşağıda açıklandığı gibi farklı RP1 IgM ve RP2 IgG algılama reaktif kombinasyonlarının test edilmesine yol açtı.
Çift muhabir nötralizasyon testine dönüştürme Çift muhabir serolojik tahlili, serum örneğini eklemeden önce ACE2 ve boncuklarla bir kuluçka adımı eklenerek nötralizasyon testine dönüştürüldü. 16 μg/ml'den başlayan 2 kat ACE2 seyreltme serisi kullanıldı ve daha sonra yukarıda açıklandığı gibi 11 numune ve soyulmuş sera setleri ile test edildi. Ayrıca 3 farklı RP1 IgM ve RP2 IgG algılama antikor karışımı kombinasyonu 11 örnek ve soyulmuş serum kontrolleri seti üzerinde test edildi. En uygun olduğu belirlenen son kombinasyonlar ve reaktif konsantrasyonları Tablo 1'de ayrıntılı olarak yer uzamaktadır.
IgG tespiti için, orijinal tek muhabir testinde kullanılan biyotin anti-insan IgG /SASB, BV muhabir boyasına konjuge edilmiş başka bir anti-IgG ile birlikte test edildi. BV konjugesi yüksek RP2 MFI sinyallerine sahipken, IgG titer için MFI sinyal yoğunluğu ACE2 titrasyonları(Şekil 9A,C, E)arasında değişmektedir. Biotin anti-insan IgG/SASB kombinasyonu, ACE2 titrasyon boyunca BV konjugesine kıyasla daha tutarlı MFI sinyal düşüşüne sahipti ve MFI seviyeleri daha düşük olmasına rağmen bir doz yanıtı gösterdi. BV konjugesinin ACE2 konsantrasyonlarında yaptığı sinyal dalgalanması, biotin anti-insan IgG/SASB kombinasyonuna kıyasla IgG titrleri aralığında ACE2 tarafından yüzde inhibisyonunun belirlenmesine de müdahale etti (Şekil 9B, D, F). DFSO 3 örneği gibi düşük MFI sinyallerine sahip numuneler, bu reaktiflerin performansını değerlendirmek veya IgG nötralizasyon kapasitesini ölçmek için yeterince yüksek titrelere sahip değildir.
RP1 kanalındaki IgM titratörlerini belirlemek için, PE-konjuge bir anti-IgM, Tablo 1'delistelenen konsantrasyonlarda DyLight 549 muhabir boyasına (DL 549; 562 nm'de heyecan ve 576 nm'de emisyon) eşleştirilmiş bir anti-insan IgM ile karşılaştırıldı. Bu iki reaktiften PE anti-IgM, test edilen numuneler için DL 549 anti-insan IgM tarafından üretilenlerden daha yüksek MFI'ler görüntüledi (Şekil 9A, C,E). Bu reaktiflerin eklenmesini ölçen IgM kontrol boncukunun ortalama MMI'leri PE anti-IgM için 17.000 ≈ ve DL 549 konjugesi için 2.723'tür. Bu farklılıklarla bile, çeşitli ACE2 konsantrasyonlarının MFI üzerindeki etkisi DL 549 konjuge ile ölçülebilirdi. IgM bağlamasının ACE2 yüzde inhibisyonunu belirlemek için, iki IgM algılama reaktifi (Şekil 9B, D, F) arasında hafif ama önemsiz bir fark vardı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kombinasyon</td>
			<td rowspan="2">Muhabir</td>
			<td colspan="2">Kuyuda Son Konsantrasyon (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 anti-insan ateşleme</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parlak Menekşe 421 anti-insan igg</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 anti-insan ateşleme</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Test edilen RP1 ve RP2 muhabir boya kombinasyonlarının listesi. IgG ve IgM titrlerini ölçmek için birkaç farklı RP1 ve RP2 muhabir boyası değerlendirildi. Yukarıda gösterilen üç kombinasyon farklı RP1 algılama modlarında ve nötralizasyon testinin optimizasyonu için test edilmiştir. SASB kullanan RP2 kombinasyonları için biyotinilasyonlu algılama antikoru ve SASB konsantrasyonları gösterilmiştir. *Son Konsantrasyon reaksiyondaki son konsantrasyonu iyi temsil eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Şekil 1: Ana test protokolü adımlarını vurgulayan akış çizelgesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Şekil 2: Antijen kavramasının teyidi. Antijenler 100, 10 ve 1 pmol/106 boncukta birleştirilmiştir. S ve RBD antijenleri için tavşan anti-S sera kullanıldı ve PE anti-tavşan IgG ile tespit edildi. Nc için Protein G-saflaştırılmış tavşan poliklonal anti-Nc kullanıldı. Boncuklar için titrasyon eğrileri 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) ve 100 pmol Nc (C) ile birleştiğinde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Şekil 3: Serum seyreltmenin farklı antijen kavrama seviyeleri ile optimizasyonu. Yüksek, orta, düşük ve negatif örnekleri temsil eden serum örnekleri farklı pmol antijeni/106 boncuk kaplinleri ile test edildi. Bölüm 5'te açıklanan test protokolü kullanılarak antijen bağlantılı boncukların multipleks karışımı ile 4 katlı serum titrasyonu test edildi. S (A), RBD (B) ve Nc (C) için titrasyon eğrilerinin MFI değerleri gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Şekil 4: Optimal serum seyreltme ve algılama reaktif konsantrasyonunun belirlenmesi. Negatif hastalar (2 örnek) ve düşük ila yüksek pozitif (6 örnek) dahil olmak üzere sekiz serum örneği, üç farklı algılama reaktif konsantrasyonu ile ek serum seyreltmelerinde test edildi. MFI sonuçları S (A), RBD (B) ve Nc (C) için gösterilir. Bu ve diğer verilere dayanarak (gösterilmeyen), 1:2.000'lik bir örnek seyreltme ve 0.62 μg/mL'lik bir biotin tespit antikor konsantrasyonu seçilmişti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Şekil 5: Tek muhabir nötralizasyon testinin optimizasyonu. Tek muhabir serolojik testinin nötralize edici antikor tespit testinde modifikasyonu, Bölüm 6'da açıklandığı gibi rakip olarak ACE2 ile bir kuluçka adımı eklenerek gerçekleştirildi. Düşük pozitif titer sera ve IgG çizgili serum örneğinden oluşan 11 örnek seti, standart test koşulları kullanılarak 4 μg/mL'den başlayan iki kat seyreltme serisi ACE2 ile test edildi. Bu ACE2 konsantrasyon aralığında, MFI'de S ( A ) ve RBD (B) için artanACE2ile bir azalma görülebilir, ancak Nc (C) için değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Şekil 6: ACE2 ile sinyalin yüzde inhibisyonu. 11 örnek kümesi için kalan sinyallerin yüzdesi (Şekil 4'tenitibaren) gösterilmiştir. Her numune için, IgG titresine bakılmaksızın, en yüksek ACE2 konsantrasyonunda S (A) ve RBD (B) için maksimum % ≥30 MFI sinyali düşüşü elde edildi. Nc antijeni (C) için herhangi bir ACE2 miktarı test edilmiş önemli bir sinyal inhibisyonu yoktu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Şekil 7: DyLight 405 anti-IgM'nin RP2 IgM algılama reaktifi olarak test edilmesi. DL 405 konjuge anti-IgM'yi RP2 algılama reaktifi olarak test etmek için 11 örnek ve IgG sıyrılmış sera seti kullanıldı. S (A), RBD (B) ve Nc (C) için RP2 IgM MFI sinyalleri gösterilir. Herhangi bir numuneye sahip herhangi bir antijen için en yüksek MFI sinyali, H (B)örnekli RBD için yaklaşık 140 MFI birimiydi. IgM kontrol boncuk setinin sinyali bile tüm antikor titre aralığında RP2 kanalında 1.000 MFI'den azdı ve RP1 kanalındaki(D)PE anti-IgM algılama antikoru ile gözlenen artan dinamik aralığı göstermedi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Şekil 8: Biotin anti-IgG ile RP2 muhabiri olarak SASB optimizasyonu. Standart 0.62 μg/mL biotin anti-IgG ile sasb seyreltme serisini test etmek için 11 örnek ve IgG sıyrılmış sera seti kullanıldı. S (A), RBD (B) ve Nc (C) için RP2 kanalında elde edilen IgG MFI'leri gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Şekil 9: RP1 IgM ve RP1 IgG algılama karışımlarının üç farklı kombinasyonunun karşılaştırılması. 11 örnek üzerinde üç farklı algılama antikor karışımı test edildi ve IgG serayı sıyırdı. Kullanılan kombinasyonlar ve son konsantrasyonlar Tablo 1'deaçıklanmıştır. Tüm numuneler 16 μg/mL'den başlayan 2 katlı ACE2 seyreltmelerle test edildi. DFSO'daki 3, 12 ve 30 günlük örnekler için veriler gösterilir. RP1 IgM (turuncu) ve RP2 IgG (mavi) için MFI sinyalleri A (DFSO 3), C (DFSO 12) ve E (DFSO 30) olarak gösterilir. ACE2 artık MPI'lar B (DFSO 3), D (DFSO 12) ve F (DFSO 30) olarak gösterilir. ACE2 kontrolü yok ile karşılaştırıldığında %>30'luk bir düşüşü temsil eden sinyaller açık yeşil olarak vurgulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System at JoVE.com

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

SARS-CoV-2 için nötralize IgG ve IgM antikorlarını aynı anda ölçebilen multipleks serolojik ve antikor nötralizasyon tahlillerinin geliştirilmesi için iki muhabirli okuma sağlayan boncuk bazlı çok katlı tahliller için bir akış analiz sistemi kullanılmıştır.

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Bilgimize göre, bu, analiz başına iki sonucu aynı anda ölçmek için iki muhabir sinyali kullanan boncuk tabanlı çoklama protokolünün ilk örneğidir. Bu teknik, kullanıcının antijene özgü IgM ve IgG'yi aynı anda ölçmesini sağlar, daha az örnek ve sonuç için daha kısa bir süre. Bu çift muhabir yöntemi antikor izotiripleme için özel olsa da, çeviri sonrası değişiklikler veya serbest ve bağlı ilaç formları gibi diğer analit çiftlerini ölçmek için uyarlanabilir.Bugün prosedürümüzü gösteriyoruz, Luminex Şirketi'nin kıdemli saha uygulama bilimcisi Dr. Steve Angeloni. Çift muhabir IgG ve IgM serolojik testine başlamak için, bireysel çift boncuktan gerekli çoklayıcı boncuk karışımlarını hazırlayın ve boncuk stoklarını mililitre başına altı boncuk başına bir kez 10 kez konsantrasyonda kontrol edin. Daha sonra, 990 mikrolitre PBS-TBN tampona 10 mikrolitre serum ekleyerek serum örneklerini 100 kat seyreltin, ardından 1:100 seyreltmenin 20 mikrolitresini 180 mikrolitre PBS-TBN'ye ekleyerek örnekleri on kat daha seyreltin.Boncuk karışımları ve serum örnekleri hazır olduğunda, 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakasının atanmış kuyularına çok katlı boncuk karışımlarından 50 mikrolitre ekleyin, ardından seyreltilmiş serum örneklerinin 50 mikrolitresini uygun kuyulara ekleyin. Tüm numuneler eklendikten sonra, plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra, plakayı iki dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcıya yerleştirerek boncukları reaksiyon karışımından ayırın.Plakayı mıknatıs üzerinde tutarak folyo contayı çıkarın. Daha sonra plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, plakayı emici kağıda damlatın.Reaksiyon kuyularını yıkamak için plakayı plaka mıknatısından çıkarın ve her kuyuya 150 mikrolitre PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve iki dakika daha plaka mıknatısı üzerine yerleştirmeden önce ısıtılmış çalkalayıcı üzerinde iki dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, süpernatantı atmak için plakayı ters çevirin ve plakayı emici kağıda damlatın.İkinci PBS-TBN yıkamadan sonra, plakayı mıknatıstan çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre taze Algılama Reaktif karışımı ekleyin. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile kapledikten sonra, 15 dakika ısıtılmış bir plaka çalkalayıcıya ve ardından iki dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerindeyken, plakayı bir atık kabının üzerine ters çevirerek ve emici kağıda şişirerek Algılama Reaktif karışımını atın.Reaksiyon kuyularını PBS-TBN ile daha önce gösterildiğinden iki kez yıkayın, ardından plakayı mıknatıstan çıkarın. Her kuyuya 100 mikrolitre PBS-TBN ekleyin, ardından plakayı folyo conta ile örtün ve 37 santigrat derecede iki dakika sallayın. Folyo contayı çıkarın ve akış analizöründeki her kuyudan numunenin 50 mikrolitresini okumaya devam edin.Plakayı okumak için sol üst köşedeki açılır menüyü seçin, Plaka Yapılandırması'na gidin, önceden yapılandırılmış plakayı yükleyin ve Plakayı Çalıştır'ı seçin. Çıkar simgesini seçerek plaka taşıyıcısını çıkarın, ardından plakayı plaka taşıyıcısına yükleyin ve plaka taşıyıcısını geri çekmek için Geri Çek simgesini seçin. Plaka taşıyıcısı analizöre uzadıktan sonra, plakayı okumaya başlamak için Çalıştır simgesini seçin.Çift muhabir nötralizasyon tahlilleri için, 96 kuyulu bir mikrotiter plakasının atanmış kuyularına çok katlı boncuk karışımlarının 50 mikrolitresini ekleyin, ardından her kuyuya mililitre ACE2 başına iki mikrogramdan 25 mikrolitre ekleyin ve plakayı bir folyo conta ile kaplayın. Isıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde iki dakikalık bir inkübasyonun ardından, atanan kuyulara 25 mikrolitre 1:500 serum seyreltme ekleyin. Tüm örnekler eklendikten sonra, serolojik test için daha önce gösterildiği gibi inkübasyon, yıkama, algılama ve analiz adımlarını gerçekleştirin.Semptom başlangıcından itibaren beş ila 60 gün içinde serum örnekleri kullanılarak DyLight 405 muhabir boyasına konjuge edilen bir anti-IgM testi ve bir IgG şerit serum örneği spike antijeni için yüksek bir sinyal üretmedi. IgM orta floresan yoğunluğu yüksek olan numunelerde reseptör bağlama alanı ve nükleokapsid antijenler için en yüksek sinyaller görülmüştür. Bazı örneklerde IgM titresinin yükselmesi gerekirken, gözlenen orta floresan yoğunluk seviyeleri 140 MFI ünitesini geçmedi.Ayrıca, IgM için kontrol boncuk, aynı konsantrasyonda anti-IgM etiketli bir fikoerythrin ile karşılaştırıldığında, anti-IgM'ye konjuge edilmiş DyLight 405 kullanırken ortanca floresan yoğunluğu için önemli bir dinamik aralıktan yoksundu. IgG tespiti için, parlak menekşe konjugesi, florore Super Bright 436'nın streptavidin konjugesinden daha yüksek ortanca floresan yoğunluk sinyallerine sahipti. Bununla birlikte, parlak menekşe konjugesinin sinyal yoğunluğu ACE2 titrasyonlarında farklılık gösterdi.ACE2 konsantrasyonlarında parlak menekşe konjugesi tarafından yapılan bu sinyal dalgalanması, IgG titreleri aralığında ACE2'nin yüzde inhibisyonunu belirlemeye de müdahale etti. IgM algılaması için, fitoerythrin anti-IgM, DyLight 549 anti-insan IgM tarafından üretilenlerden daha yüksek sinyaller gösterdi. IgM bağlamasının yüzde 12 inhibisyonu belirlenirken, iki IgM algılama reaktifi arasında hafif ama önemsiz bir fark vardı.Bu nedenle prosedürdeki en önemli adımlardan biri, multipleks boncuk karışımınızı bireysel boncuk stoklarınızdan hazırlamak ve bunu doğru yaptığınızdan emin olmaktır. Bu nedenle bu prosedür, aşıların etkinliğini ölçmek ve diğer patojenlere karşı bağışıklık tepkilerini izlemek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Boncuk Multiplex tahlil için gözyaşı sitokin profilleri analizi dayalı

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (Video) | JoVE

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

Kuduz IgG ve IgM Antikorlarının Kuduz İndirekt Floresan Antikor Testi Kullanılarak Saptanması

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...