Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

نشكر غيوم ترواديك على المناقشة المفيدة، وزيهاو وانغ على استشارة الأجهزة، ومركز سيدني للتصنيع، وجريج سوانينغ وسيمون رينغر لدعمهم شركتنا الناشئة في المختبر. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (DP200101970 - L.A.J.) ، وبرنامج بناء قدرات القلب والأوعية الدموية في نيو ساوث ويلز (منحة الباحث الوظيفي في منتصف مبكر - L.A.J.) ، جائزة مسرع أبحاث سيدني (SOAR - L.A.J.) ، مؤسسات راماسيوتي منحة الاستثمار الصحي (2020HIG76 - L.A.J.) ، ومنحة أفكار المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (APP2003904 - L.A.J.) ، وصندوق جامعة سيدني للشركات الناشئة في كلية الهندسة ومخطط المعدات الرئيسية (L.A.J.). بطانة أرنولد جو هو زميل مجلس البحوث الأسترالي DECRA (DE190100609).

1. الحصول على أحداث DFS قابلة للتحليل
<ol><li>بدء التجربة في البرنامج (على سبيل المثال، LabVIEW VI) للتحكم BFP وإعداد المعلمة(الشكل S1A).</li>
	<li>مراقبة خرزة الهدف التحقيق المتكررة / لمسات الخلية في البرنامج لBFP مونيتور (الشكل S1B).</li>
	<li>اختبار وتحقيق تردد التصاق ≤ 20٪ ضمن أول 50 لمسات عن طري...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

باختصار ، قدمنا بروتوكول تحليل بيانات مفصل للمعالجة المسبقة للبيانات الخام DFS واشتقاق ثوابت الربيع الجزيئية في أوضاع تحليل BFP Bead-Bead و Bead-Cell. يتم تقديم نماذج ومعادلات الميكانيكا الحيوية اللازمة لتحديد ثوابت الربيع الجزيئية والخلوية. وإن كانت تدرس integrins مختلفة ، وkمول تقاس وضع حبة...

كما تقنية DFS الخلايا الحية، BFP المهندسين خلية الدم الحمراء البشرية (RBC؛ 1000000000000000000000000000000000000000000 الشكل 1) إلى محول قوة فائق الحساسية وغير قادر مع مجموعة ثابتة ربيعية متوافقة عند 0.1-3 pN/nm1،2،3. للتحقيق في التفاعل بين مستقبلات ليغاند، BFP تمكن قياسات DFS في ~ 1 pN (10-12 N)، ~ 3 نانومتر (10-9 م)، و ~ 0.5 مللي ثانية (10-3 ثانية) في القوة والمكانية، والقرار الزمني4،5. يتكون تكوينه التجريبي من اثنين من micropipettes المتعارضة ، وهي التحقيق والهدف. التحقيق micropipette aspirates RBC ولصق حبة في ذروتها عن طريق التفاعل البيوتين streptavidin. الخرزة مغلفة مع ليغاند من الفائدة (الشكل 1A). الهدف micropipette aspirates إما خلية أو حبة تحمل مستقبلات الاهتمام ، المقابلة لخلية الخرز(الشكل 1B)والخرزة حبة (الشكل 1C) وسائط ، على التوالي5.
وقد وصفت BFP البناء والتجميع والبروتوكولات التجريبية DFS بالتفصيل سابقا1،6. باختصار، دورة لمسة BFP يتكون من 5 مراحل: نهج، Impinge، الاتصال، تراجع وتفكك(الشكل 1D). ويشار إلى موقف قمة RBC الأفقي على أنه ΔxRBC. في البداية، تشوه RBC غير المجهد (قوة الصفر) هو 0 ( الجدول 1). ثم يتم دفع الهدف من قبل piezotranslator إلى impinge على وتراجع من حبة التحقيق(الشكل 1D). يتم ضغط أول مسبار RBC من قبل الهدف مع تشوه RBC السلبي ΔxRBC < 0. في حدث بوند، تنتقل مرحلة التراجع من مرحلة ضغط إلى مرحلة الشد مع تشوه RBC الإيجابي ΔxRBC > 0 (الشكل 2C و D). وفقا لقانون هوك، فإن قوة تحمل BFP قادرة على أن تقاس على أنها F = kRBC × ΔxRBC، حيث KRBC ( الجدول1) هو ثابت الربيع RBC من BFP. عند تمزق السندات والانتهاء من دورة لمسة واحدة، يعود حبة التحقيق إلى موقف قوة الصفر مع ΔxRBC = 0(الشكل 1D).
لتحديدRBC ك، ونحن قياس وتسجيل شعاعي من فتحة التحقيق micropipette الداخلية (ص ر)، وRBC (R0) ومنطقة الاتصال الدائري (Rج) بين RBC والخرزة التحقيق ( الشكل1A). ثم يتمحساب كRBC وفقا لنموذج ايفان (Eq. 1)7،8 باستخدام برنامج LabVIEW الذي يعمل كأداة افتراضية (VI) لتشغيل BFP ( الشكلS1A)8،9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (Eq. 1)
مع BFP المنشأة وDFS البيانات الخام التي تم الحصول عليها، وهنا نقدم كيفية تحليل ثابت الربيع من زوج مستقبلات ليجند أو الخلايا. البيانات الخام DFS على التفاعل بين البروتين الجليكوسيلات Thy-1 و K562 خلية تحمل integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; الشكلان 3A و 3B)10 و 10 من الفيبرينوجين والخرز المغلفة integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; الشكل 3C) 11,12 وقد استخدمت لإثبات الخرز الخلية والخرز حبة وسائط التحليل, على التوالي.
BFP التحضير التجريبي للحصول على تفاصيل إعداد BFP التجريبي والأجهزة، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة سابقا3. وباختصار، تم تطين RBC البشري باستخدام البيوتين-PEG3500-NHS في العازلة الكربون/ بيكربونات. وقد اقترنت البروتينات ذات الأهمية بشكل مشترك بالخرز الزجاجي البوروسيليكات باستخدام MAL-PEG3500-NHS في حاجز الفوسفات. لإرفاق RBC البيوتينية ، يتم أيضا طلاء حبة المسبار بالستريبتافيدين (SA) باستخدام MAL-SA. يرجى الاطلاع على جدول المواد والجدول 2.
لتجميع BFP (الشكل 1، إلى اليسار) ، سيتم استخدام micropipette الثالثة التي يطلق عليها "المساعد" لتسليم حبة التحقيق والغراء إلى قمة RBC1،3. التفاعل التساهمي بين حبة التحقيق المغلفة SA وRBC البيوتينية هو أقوى بكثير من رابطة مستقبلات ليغاند من الفائدة. وهكذا، يمكن تفسير المرحلة التفككية على أنها تمزق السندات مستقبلات ليغاند بدلا من مفرزة من حبة التحقيق من RBC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

وقد برز مؤخرا مسبار قوة الوميمبران الحيوي (BFP) كسطح الخلية الأصلية أو في الموقع التحليل الطيفي للقوة الديناميكية (DFS) nanotool التي يمكن قياس الحركية ملزمة جزيئية واحدة، وتقييم الخصائص الميكانيكية للتفاعلات مستقبلات ليجاند، تصور التغيرات تشكيلية ديناميكية البروتين ومستقبلات أكثر إثارة توضيح آليات mechanosensing الخلية بوساطة. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام BFP لقياس ثابت الربيع من الروابط الجزيئية. يصف هذا البروتوكول الإجراء خطوة بخطوة لإجراء تحليل DFS ثابت الربيع الجزيئي. على وجه التحديد، يتم مناقشة وضعي تشغيل BFP، وهما أوضاع خلية الخرز والخرز. يركز هذا البروتوكول على اشتقاق ثوابت الربيع للروابط الجزيئية والخلايا من البيانات الخام DFS.

في هذا العمل، لقد أظهرنا بروتوكول تحليل الربيع BFP المستمر. لوضع تحليل حبة الخلية، قمنا بتحليل kمول من الرابط الجزيئي بين البروتين الجليكوسيلات Thy-1 المغلفة على حبة التحقيق و integrin α5β1 أعرب عن على الخلية K562 الهدف (Thy-1-integrin α5β1; الشكل 3A) <sup class="xr...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

مسبار قوة الوميمبران الحيوي (BFP) هو تقنية التحليل الطيفي للقوة الديناميكية في الموقع (DFS). يمكن استخدام BFP لقياس ثابت الربيع من التفاعلات الجزيئية على الخلايا الحية. يقدم هذا البروتوكول تحليلا ثابتا لفصل الربيع للروابط الجزيئية التي اكتشفها BFP.

الجزيئية الربيع التحليل المستمر من قبل التحليل الطيفي قوة قوة Biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

يصف هذا الفيديو الإجراءات خطوة بخطوة على استخدام مسبار قوة البيوميمبران، أو BFP لقياس ثابت الربيع الجزيئي. في التحقيق القوة، ظهرت مؤخرا BFP في سطح الخلية الأصلية أو في تحليل الطيف القوة الديناميكية SITU. والهدف الرئيسي من هذه التقنية هو قياس جزيء واحد ربط علم الوراثة.هذا الإجراء تحليل البيانات هو رسالة بسيطة ولكنها قوية وتوفير المعلومات الميكانيكية، وتحديدا القوة الديناميكية والتهاب غشاء الخلية التعبير عن الجزيئات. خلال دورة تجربة BFP ، يمكن اعتبار رهان ميكروبيوم المسبار مع خلية الدم الحمراء والوصايا والخلية المستهدفة والترابط الجزيئي لمستقبلات الليغند بين المسبار والهدف كنظام دماغي متصل بسلسلة. استنادا إلى قانون هوك، فإن المعاملة بالمثل لمجموع ثابت الربيع لنظام ربيع متصل سلسلة يساوي مجموع ثابت الربيع العكسي لكل مكون واحد، كما تظهر المعادلة.يتم حساب ثابت الربيع لخلايا الدم الحمراء على أساس حركة الأحداث ، والتي تعتمد على شعاعي من ميكروبايت التحقيق في فتحة. خلية الدم الحمراء، منطقة الاتصال الدائرية بين خلية الدم الحمراء والوصايا ومكابس الماصة الدقيقة. يتم الحصول على بيانات الطريق BFP بواسطة أداة افتراضية محلية الصنع للعرض الأيسر ، والتي تتحكم في حركة المواسير الصغيرة المستهدفة بواسطة مترجم PAs.وتتكون دورة اللمس الكاملة من PFP من خمس مراحل. Approach.Impinge.Contact. تراجع وانفصاح. في البداية، لا التأكيد على موقف روبوستو APICS يشار إلى X يساوي 0 في deshine الأسود.ثم يتم دفع الهدف من قبل قطعة أو مترجم للطعن في وضغط robusto للتسبب في حركة الوصايا السلبية. لاحظ أنه X أصغر من الصفر في خط شرطة أحمر. في مرحلة التراجع، تتحرك قمة busto الحمراء من X أصغر من موقف الصفر مرة أخرى إلى X يساوي موقف صفر يشار إليها باسم المرحلة ضاغطة.إذا تشكلت رابطة بين مجمع جزيء مستقبلات الليغند ، فإن خلية الدم الحمراء ستختلف أكثر عن الاتجاه الإيجابي الآخر. يشار إلى هذه الفترة X أكبر من الصفر كمرحلة الشد من مرحلة التراجع. مرحلة التراجع هو الجزء الأكثر أهمية لتحديد ثابت الربيع من جزيء الترابط.جمع القوة مقابل بيانات الطريق الزمني باستخدام منصة الحصول على البيانات BSP. تسجل كل تجربة عادة 50 إلى 200 دورة لمس، افتح برنامج تحليل بيانات PFP. انقر على رمز المجلد الأصفر وحدد ملف بيانات الصف المقابل بالنقر المزدوج عليها.نحن في البرنامج ثم انقر على أزرار السهم صعودا وهبوطا للتبديل بين الأحداث. استخدام معايير الاستبعاد المتطرفة لحجب الأحداث غير الصالحة.حدد نوع البيانات المصدرة الذي تم فرضه على تنسيق الوقت واختر نطاق الوقت المناسب. انقر على زر بيانات رسم التصدير. يتم حفظ البيانات المصدرة كملف نصي بشكل افتراضي.يحتوي هذا الملف النصي على عمودين من البيانات. إنه العمود الأول الذي يمثل الوقت الآباء والعمود الثاني الذي يمثل القوة المقابلة في كل نقطة زمنية. رسم القوة مقابل منحنى الوقت باستخدام برامج جداول البيانات للحصول على منحنى القسري مقابل التشريد.قم بضرب القيمة الزمنية لكل نقطة بيانات بحركة Willow Steel PSO. صفر نقطة البيانات الأولى عن طريق طرح أصغر قيمة إزاحة من كل نقطة بيانات. لا يؤثر هذا التحول الأفقي على حساب ثابت الربيع اللاحقة.في منحنى القوة مقابل الإزاحة، كانت مجموعتان فاعلتان متميزتان مختلفتين إذا كان من الممكن تحديد منحدر القوة الجديد. كل منها يمثل المرحلة الضاغطة ومرحلة النمط 10. احتواء خط انحدار لكل مجموعة بيانات.يمثل الخط ذو المنحدر الأكثر انحدارا إجمالي ثابت الربيع في مرحلة الضاغط المشار إليها باسم K1. والخط الذي كان أصغر أعلى يمثل الخط في هذه المرحلة نمط 10 المشار إليها على أنها K2.As ذكرتها، وثابت الربيع الإجمالي هو متبادل من ابن سلسلة ثابت الربيع من كل عنصر. خلال المرحلة الضاغطة من فوز لوضع الخلية، لا تمتد الترابط الجزيئي، وبالتالي لا يؤخذ ثابت الربيع الترابط الجزيئي في الاعتبار. يوصف ثابت الربيع للخلية المستهدفة بأنه المعادلة المعروضة حيث يمثل K1 ثابت الربيع الإجمالي خلال مرحلة الضاغط.في مرحلة نمط 10 من فوز لبيع الوضع، ومجموع ثابت الربيع هو الشمس من ثابت الربيع uverse من السندات الجزيئية خلايا الدم الحمراء. والخلية المستهدفة، استخدم المعادلة المعروضة لحساب ثابت الربيع الترابط الجزيء، الذي يمثل K2 ثابت الربيع الكلي. تقرأ مرحلة التوقف 10.في فوز للفوز على الوضع، منذ تشوه B لا يكاد يذكر، وهو المصطلح الذي يصف عكس الخلية المستهدفة الربيع نهج ثابت صفر، وبالتالي فإن مجموع ثابت الربيع في مرحلة ضاغط يعادل ثابت ربيع خلايا الدم الحمراء تظهر على أنها المعادلة التالية. في مرحلة الشد ، يمكن حساب ثابت الربيع للترابط الجزيئي عن طريق طرح تأثير خلية الدم الحمراء التي تظهر على أنها المعادلة التالية. جمع ثوابت الربيع من الجانب الرياح دمج الموقف باء ، بيتا 3 المعقدة ، وخلية K562 وFe febrifugine دمج الموقف باء بيتا ثلاثة معقدة ، وحساب متوسط والانحراف المعياري للثوابت الربيع المستمدة في اختيار نيوتن أو مقياس نانومتر.الآن يجب أن يكون لديك فهم أفضل لما هي متطلبات قياس والربيع ثابت من البيانات VFD. وينبغي ملاحظة الاختلافات بين فوز لوضع الخلية وفاز على وضع للفوز. خدمة تقديم جزيء مختلفة سيكون لها دفاعات مختلفة لقياس ثابت الربيع.في الختام، يصف هذا الإجراء خطوة بخطوة كيفية إجراء تحليل مستمر الربيع الجزيئي باستخدام BFP. ونحن نتوقع أن تبذل جهود في المستقبل لأتمتة ودمج الحصول على البيانات BFP وتحليل DFS في برنامج واحد بقية الكمبيوتر. جعل تحليل بيانات عملية BFP بأكمله أكثر سهولة في الاستخدام وعاليا طوال الوقت.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

تمتد سلاسل قصيرة من الحمض النووي مع ثابت القوة المحورية الملقط البصري

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

قياس أقصى قوة متساوي القياس منشأ بواسطة ألياف العضلات Permeabilized الهيكل العظمي

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...