Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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我们感谢纪劳姆·特罗亚德茨的有益讨论，王子豪的硬件咨询，悉尼制造中心，格雷格·苏宁和西蒙·林格支持我们的实验室启动。这项工作得到了澳大利亚研究理事会发现项目（DP200101970 - 洛杉矶J.），新南威尔士州心血管能力建设计划（中早期职业研究员格兰特 - 洛杉矶J.），悉尼研究加速器奖（SOAR - 洛杉矶），拉马乔蒂的支持 基金会健康投资赠款（2020HIG76 - 洛杉矶J.）、国家健康和医学研究理事会创意赠款（APP2003904 - L.A.J.）和悉尼大学工程学院启动基金和主要设备计划（L.A.J.）。李宁·阿诺德·朱是澳大利亚研究理事会DECRA研究员（DE190100609）。

1. 获取可分析的 DFS 事件
<ol><li>在 BFP 控制和参数设置（图 S1A）的软件（例如 LabVIEW VI）中开始实验。</li>
	<li>观察 BFP 监视器软件中的重复探针珠目标珠/细胞触摸（图 S1B）。</li>
	<li>通过调整冲击力和接触时间，在前 50 次接触中测试并实现粘附频率≤ 20%，从而确保 DFS 粘附事件的 ≥ 89% 通过单键12、13、14<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

总之，我们提供了详细的数据分析协议，用于在 BFP 珠子和珠子细胞分析模式下对 DFS 原始数据进行预处理并衍生分子弹簧常数。介绍了确定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的集成物不同，但珠珠模式和珠细胞模式测量的kmol具有显著的范围差异（图3A与图3C）。值得注意的是，与珠珠模式，受体是共同连接到玻?...

作为活细胞DFS技术，BFP工程人类红血球（RBC：图1）进入一个超敏感和可调谐的力量传感器与兼容的弹簧恒定范围在0.1-3 pN/nm1，2，3。为了探测配体受体相互作用，BFP 使 DFS 测量在 +1 pN （10-12 N）， +3 nm （10-9米） 和 +0.5 ms （10-3 s） 生效， 空间和时间分辨率4，5.其实验配置由两个对立的微管，即探测器和目标组成。探针微管吸气RBC和珠子粘在其顶点通过生物素-链球菌素的相互作用。珠子上涂有感兴趣的配体（图1A）。目标微管吸气细胞或带有利益受体的珠子，分别对应珠细胞（图1B）和珠珠（图1C）模式。
BFP的建造，组装和DFS实验协议被详细描述之前1，6。简言之，BFP 触摸周期由 5 个阶段组成：方法、因平格、接触、缩回和分离（图 1D）。水平 RBC 顶点位置表示为+xRBC。在开始时，未应力（零力）RBC 变形=xRBC为 0（表 1）。然后，目标由压电翻译驱动，以冲压和缩回从探针珠（图1D）。RBC 探头首先由目标压缩，具有负 RBC 变形+xRBC < 0。在债券事件中，缩回阶段从压缩阶段过渡到拉伸阶段，正 RBC 变形=xRBC > 0 （图 2C和D）。根据胡克定律，BFP 承载力可以测量为F = k RBC ×xRBC，其中kRBC （表1）是 BFP 的 RBC 弹簧常数。当键破裂并完成一个触摸周期后，探针珠返回到零力位置与+xRBC = 0 （图1D）。
为了确定kRBC，我们测量并记录探针微管内孔（Rp）、RBC（R0）和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域（Rc）的半径（图1A）。然后kRBC根据埃文的模型（Eq.1）7，8使用实验室VIEW程序，作为一个虚拟仪器（VI）来操作BFP（图S1A）8，9。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> （Eq. 1）
通过建立 BFP 和获得 DFS 原始数据，我们介绍如何分析配体受体对或细胞的弹簧常数。DFS关于糖化蛋白Thy-1和K562细胞轴承集成蛋白相互作用的原始数据α 5 β 1（Thy-1-α 5 β 1： 数字3A和3B）10和纤维蛋白和珠涂层的集成物α IIb β 3（FGN-α IIb β 3： 图3C）11，12已分别用于演示珠细胞和珠珠分析模式。
BFP 实验准备 有关 BFP 实验制备和仪器的详细信息，请参阅先前发布的协议3。简言之，人类RBC在碳/碳酸氢盐缓冲中使用了生物素-PEG3500-NHS进行生物素化。感兴趣的蛋白质与磷酸盐缓冲器中使用MAL-PEG3500-NHS的玻硅酸盐玻璃珠共价耦合。为了附着在生物素化RBC上，探针珠还使用MAL-SA涂上链球菌素（SA）。请参阅材料表和表2。
为了组装BFP（图1，左），第三个称为"帮手"的微管将用于交付探针珠，并粘附到RBC的顶点1，3。SA 涂层探针珠和生物镀金 RBC 之间的共价相互作用比配体受体的利益纽带强得多。因此，分离阶段可以解释为配体受体键破裂，而不是探针珠从RBC分离。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

生物元原力探针（BFP）最近成为一种原生细胞表面或 原位 动态力光谱（DFS）纳米图，可以测量单分子结合动力学，评估配体受体相互作用的机械特性，可视化蛋白质动态构象变化，更令人振奋地阐明受体介导细胞机械增效机制。最近，BFP被用来测量分子键的弹簧常数。此协议描述了执行分子弹簧恒定 DFS 分析的分步过程。具体来说，讨论了两种 BFP 操作模式，即珠子单元和珠珠模式。此协议侧重于从 DFS 原始数据中提取分子键和细胞的弹簧常数。

在这项工作中，我们演示了 BFP 弹簧常数分析的协议。对于珠细胞分析模式，我们分析了涂在探针珠上的糖基化蛋白Thy-1与目标K562细胞（Thy-1-integrin 5 β 1）上表达的特格林α分子键的kmol（Thy-1-integrin α 5 β 1： 图3A）10. k细胞也来自珠细胞模式（K562细胞：图3B）。对于珠珠模...

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Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

生物元力探针 （BFP） 是一种 原位 动态力光谱 （DFS） 技术。BFP可用于测量活细胞分子相互作用的弹簧常数。此协议对 BFP 检测到的分子键进行弹簧常量分析。

分子弹簧常量分析由生物元原力探针光谱

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

本视频介绍了使用生物膜力探针或BFP测量分子弹簧常数的分步程序。在力探针中，BFP最近出现在天然细胞表面或SITU动态力光谱分析中。该技术的主要目的是测量单分子结合遗传学。该数据分析程序是一个简单但强大的信息，并提供机械信息，特别是表达分子的细胞膜的动态力和炎症。在BFP实验周期中，探针微生物组与红细胞和遗嘱认证、靶细胞和配体受体之间的分子键合探针与靶标之间可以被认为是一系列连接的大脑系统。根据胡克定律，串联弹簧系统的总弹簧常数的倒数等于每个单个分量的逆弹簧常数之和，如方程所示。红细胞的弹簧常数是根据事件运动计算的，这取决于孔口中探针微量移液器的径向。红细胞，红细胞与遗嘱认证之间的圆形接触区域以及微量移液器吸气压力。BFP道路数据由自制的左视图虚拟仪器获得，该仪器通过PA转换器控制目标微量移液器的运动。完整的PFP触摸周期由五个阶段组成。接近.撞击.接触。收回并解离。在开始时，确实应力 罗布斯托 APICS 位置在黑色 deshine 中表示为 X 等于 0。然后，目标由碎片或翻译器驱动，撞击并压缩鲁棒，导致负面的遗嘱认证运动。您注意到它在红色虚线中小于零的 X。在缩回阶段，红色 busto 顶点从小于零的 X 位置移回等于零的位置，称为压缩相位。如果在配体受体分子复合物之间形成键，红细胞将进一步与其他正方向不同。这个大于零的X周期称为拉伸阶段的缩回阶段。缩回阶段是确定键合分子弹簧常数的最关键部分。使用 BSP 数据采集平台收集力与时间的关系道路数据。每个实验通常记录50到200个触摸周期，打开PFP数据分析软件。单击黄色文件夹图标，然后双击它们以选择相应的行数据文件。我们正在参加该计划。然后单击向上和向下箭头按钮以在事件之间切换。使用异常值排除条件筛选出无效事件。选择强制为时间格式的导出数据类型，然后选择适当的时间状态范围。单击导出绘图数据按钮。默认情况下，导出的数据将另存为文本文件。此文本文件包含两列数据。第一列代表时间爸爸，第二列代表每个时间点的相应力。使用电子表格软件绘制力与时间的关系曲线，以获得受力与位移曲线。将每个数据点的时间值乘以柳钢PSO机芯。通过从每个数据点中减去最小位移值，将第一个数据点清零。这种水平变换不会影响随后的弹簧常数计算。在力与位移曲线中，如果可以识别出新的力斜率，则两个不同的参与者组是不同的。每个代表压缩阶段和10样式阶段。使回归线适合每个数据组。具有较陡坡度的线表示压缩机相位处的总弹簧常数，表示为 K1。而最小顶部的线代表这个10风格阶段的线，表示为 K2.As 我提到的，总弹簧常数是每个组件的系列弹簧常数的儿子的倒数。在节拍到细胞模式的压缩阶段，分子键不会拉伸，因此不考虑分子键弹簧常数。目标单元的弹簧常数被描述为显示的方程，其中 K1 表示压缩机阶段的总弹簧常数。在10风格阶段的节拍卖出模式中，总弹簧常数是太阳的逆弹簧常数的红细胞分子键。而目标细胞，使用显示的方程来计算分子键合弹簧常数，其中K2表示总弹簧常数。您阅读了 10 个停止阶段。在节拍到节拍模式中，由于B的变形可以忽略不计，描述目标细胞弹簧常数的反转项接近零，因此压缩机相位的总弹簧常数相当于显示如下等式的红细胞弹簧常数。在拉伸阶段，分子键的弹簧常数可以通过减去红细胞的作用来计算，如下所示如下式所示。收集侧风积分姿态B、Beta 3配合物、K562单元和二氟化物积分姿态B Beta三络合物的弹簧常数，计算牛顿或纳米尺度上衍生的弹簧常数的均值和标准差。现在，您应该更好地了解对VFD数据的测量和弹簧常数的要求。应注意"节拍到单元格"模式和"节拍到节拍"模式之间的差异。不同的分子呈现服务对弹簧常数的测量将有不同的防御。总之，这个分步过程描述了如何使用BFP进行分子弹簧常数分析。我们预计未来将努力实现BFP数据采集和DFS分析的自动化和集成，并将其集成到一个计算机休息程序中。使整个BFP操作数据分析更加人性化和高。

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