Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Vi takker Guillaume Troadec for nyttige diskussion, Zihao Wang for hardware høring, og Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning og Simon Ringer for støtte til vores lab opstart. Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator-prisen (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) og University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju er en australsk Research Council DECRA stipendiat (DE190100609).

1. Få analyserelige DFS-hændelser
<ol><li>Start eksperimentet i softwaren (f.eks. LabVIEW VI) til BFP-kontrol- og parameterindstillingen (Figur S1A).</li>
	<li>Overhold de gentagne sondeper-målperle/celleberøring i softwaren til BFP Monitor (Figur S1B).</li>
	<li>Test og opnå vedhæftning frekvens ≤ 20% inden for de første 50 rører ved at indstille impingement kraft og kontakt tid, hvorved det sikrer, at ≥ 89% af DFS vedhæftning begivenhed er medieret af enkelt obligationer...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

Sammenfattende har vi leveret en detaljeret dataanalyseprotokol til forbehandling af DFS-rådata og udlede molekylære fjederkonstanter i BFP Bead-Bead- og Perlecelleanalysetilstandene. Biomekaniske modeller og ligninger, der kræves til bestemmelse af molekylære og cellulære fjederkonstanter præsenteres. Selvom forskellige integriner studeres, har kmol målt ved Perle-Perle-tilstanden og Perlecelletilstanden betydelige rækkeviddeforskelle (Figur 3A vs. <strong class=...

Som en live-celle DFS teknik, BFP ingeniører en menneskelig rød blodlegemer (RBC; Figur 1) til en ultrafølsom og tunable krafttransducer med et kompatibelt fjederkonstantområde ved 0,1-3 pN/nm1,2,3. For at sondere ligand-receptor interaktion, BFP muliggør DFS målinger på ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm (10-9 m), og ~ 0,5 ms (10-3 s) i kraft, rumlig og tidsmæssig opløsning4,5. Dens eksperimentelle konfiguration består af to modsatrettede mikropipetter, nemlig sonden og målet. Probe mikropipetten aspireerer en RBC og en perle er limet på sit højdepunkt via en biotin-streptavidin interaktion. Perlen er belagt med ligand af interesse (figur 1A). Target-mikropipetten aspireerer enten en celle eller en perle, der bærer receptoren af interesse, svarende til perlecelle -figur 1B) og perleperle (Figur 1C) tilstande, henholdsvis5.
BFP konstruktion, samling og DFS eksperimentelle protokoller blev beskrevet i detaljer tidligere1,6. Kort fortalt består en BFP-berøringscyklus af 5 faser: Tilgang, Hindring, Kontakt, Tilbagetrækning og Dissociate (Figur 1D). Den vandrette RBC-spidsposition er angivet som ΔxRBC. I begyndelsen er den ustrøede (nul-kraft) RBC deformation ΔxRBC 0 (Tabel 1). Målet køres derefter af en piezotranslator for at gribe ind og trække sig tilbage fra sondeperen (Figur 1D). RBC-sonden komprimeres først af Target med negativ RBC-deformation ΔxRBC < 0. I en Bond-hændelse skifter tilbagetrækningsstadiet fra et kompressivt til en trækfase med positiv RBC-deformation ΔxRBC > 0 (Figur 2C og D). Ifølge Hookes lov kan BFP's bærekraft måles som F = kRBC × ΔxRBC, hvor kRBC ( tabel1) er BFP's RBC-fjederkonstant. Ved lim brud og afslutningen af en touch cyklus, sonden perle vender tilbage til nul-kraft position med ΔxRBC = 0 (Figur 1D).
For at bestemme kRBCmåler og registrerer vi radierne i sondemikropipettens indre åbning (Rp), RBC (R0) og det cirkulære kontaktområde (Rc) mellem RBC og sondeperen ( Figur1A). Derefter beregnes kRBC i henhold til Evans model (Eq. 1)7,8 ved hjælp af et LabVIEW-program, der fungerer som et virtuelt instrument (VI) til at betjene BFP ( FigurS1A)8,9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (Eq. 1)
Med en BFP etableret og DFS rå data opnået, hermed præsenterer vi, hvordan man analyserer foråret konstant af ligand-receptor par eller celler. DFS-rådata om samspillet mellem det glycosylerede protein Thy-1 og K562-cellen med integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figur 3A og 3B)10 og fibrinogen og perlebelagt integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 er blevet brugt til at demonstrere henholdsvis perlecelle- og perleperleanalysetilstandene.
BFP eksperimentel forberedelse Yderligere oplysninger om BFP's eksperimentelle forberedelse og instrumentering henvises til de tidligere offentliggjorte protokoller3. Kort sagt er human RBC blevet biotinyleret ved hjælp af Biotin-PEG3500-NHS i kulstof /bicarbonatbufferen. Proteiner af interesse er blevet kovalent koblet til borosilicate glasperler ved hjælp af MAL-PEG3500-NHS i fosfat buffer. For at fastgøres til den biotinylerede RBC er sondeperen også belagt med streptavidin (SA) ved hjælp af MAL-SA. Se tabellen over materialer og tabel 2.
For at samle BFP(figur 1, til venstre)vil den tredje mikropipette , der kaldes 'Hjælper', blive brugt til at levere sondeperen og lime den fast til RBC's spids1,3. Den kovalente interaktion mellem sa-coated sondeper og biotinyleret RBC er meget stærkere end ligandreceptorbindingen af interesse. Således kan Dissociate-stadiet fortolkes som ligand-receptorbindingsbrud snarere end løsrivelse af Probe perle fra RBC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

En biomembrane force probe (BFP) har for nylig vist sig som en indfødt celle-overflade eller in situ dynamisk kraft spektroskopi (DFS) nanotool, der kan måle enkelt-molekylær bindende kinetikere, vurdere mekaniske egenskaber ligand-receptor interaktioner, visualisere protein dynamisk kropsbygning ændringer og mere spændende belyse receptor medieret celle mekanosensing mekanismer. For nylig er BFP blevet brugt til at måle forårskonstanten af molekylære bindinger. Denne protokol beskriver den trinvise procedure til at udføre molekylær fjederkonstant DFS-analyse. Specifikt diskuteres to BFP-driftstilstande, nemlig perlecelle- og perleperletilstandene. Denne protokol fokuserer på at udlede fjederkonstanter af molekylærbindingen og cellen fra DFS-rådata.

I dette arbejde har vi demonstreret protokollen for BFP foråret konstant analyse. For Perle-Celle analyse mode, analyserede vi kmol af molekylær lim mellem glycosylated protein Thy-1 belagt på Probe perle og integrin α5β1 udtrykt på Target K562 celle (Thy-1-integrin α5β1; Figur 3A) 10. K-cellen er også afledt af perlecelletilstanden (K562-cellen; Figur 3B<...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

En biomembrankraftsonde (BFP) er en in situ dynamic force spektroskopi (DFS) teknik. BFP kan bruges til at måle fjederkonstanten af molekylære interaktioner på levende celler. Denne protokol præsenterer foråret konstant analyse for molekylære obligationer opdaget af BFP.

Molekylær fjeder konstant analyse af Biomembrane Force Probe spektroskopi

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Denne video beskriver trinvise procedurer for brug af Biomembrane Force Probe eller BFP til at måle molekylær fjederkonstant. I kraftsonde er BFP for nylig dukket op i den oprindelige celleoverflade eller i SITU Dynamic Force Speroskopianalyse. Hovedformålet med denne teknik er at måle enkeltmolekyle bindende genetik.Denne dataanalyseprocedure er et enkelt, men kraftfuldt budskab og giver mekanisk information, specielt den dynamiske kraft og betændelse i cellemembranen, der udtrykker molekyler. Under BFP eksperiment cyklus, sonden mikrobiom satse med den røde blodlegemer og skifteretten, målet celle og ligand receptor molekylær binding mellem sonden og målet kan betragtes som en serie tilsluttet hjernesystem. Baseret på Hooke's lov, den gensidige af den samlede fjeder konstant af en serie tilsluttet foråret system er lig med summen af den inverse fjeder konstant af hver enkelt komponent, som ligningen viser.Fjederkonstanten i røde blodlegemer beregnes ud fra hændelsesbevægelse, som er afhængig af sondens mikropipettes radiale i åbningsåbningen. Den røde blodlegemer, det cirkulære kontaktområde mellem den røde blodlegemer og skifteretten og mikropipetten, der aspirerer tryk. BFP-vejdataene opnås ved hjælp af et hjemmelavet virtuelt venstresynsinstrument, som styrer bevægelsen af målmikropipetten af en PAs Translator.En fuld PFP touch cyklus består af fem faser. Approach.Impinge.Contact. Træk dig tilbage og dissociere. I begyndelsen, gør understrege Robusto APICS position er betegnet som X er lig med 0 i sort deshine.Målet er derefter drevet af et stykke eller oversætter til at gribe ind og komprimere robusto at forårsage negativ skifteretten bevægelse. Du bemærker det som X mindre end nul i rød streglinje. I tilbagetrækningsfasen flyttes den røde bustilud fra X'et, der er mindre end nulpositionen, tilbage til X-svarende til nulpositionen, der kaldes kompressiv fase.Hvis der dannes en binding mellem ligand receptormolekylekomplekset, vil den røde blodlegemer yderligere være forskellig fra anden positiv retning. Denne X større end nul periode kaldes trækfasen af tilbagetrækning fase. Tilbagetrækningsfasen er den mest kritiske del til at bestemme fjederkonstanten af molekylet af binding.Indsaml kraft versus time road data ved hjælp af BSP dataindsamling platform. Hvert forsøg registrerer normalt 50 til 200 berøringscyklusser, Åbn PFP-dataanalysesoftwaren. Klik på ikonet for den gule mappe, og vælg den tilsvarende rækkedatafil ved at dobbeltklikke på dem.Vi er på programmet. Klik derefter på pilsknapperne op og ned for at skifte mellem hændelser. Brug af outlier udelukkelseskriterier til at frasortere ugyldige hændelser.Vælg den eksportdatatype, der tvinges til at formatere tid, og vælg det relevante tilstandsområde. Klik på knappen eksporter plotdata. De eksporterede data gemmes som standard som tekstfil.Denne tekstfil indeholder to kolonner med data. Det er den første kolonne, der repræsenterer tiden daddies og den anden kolonne, der repræsenterer den tilsvarende kraft på hvert tidspunkt. Plot kraft versus tidskurve ved hjælp af regneark software for at opnå den tvungne versus forskydning kurve.Multiplicer tidsværdien for hvert datapunkt med Willow Steel PSO-bevægelsen. Nul det første datapunkt ved at trække den mindste forskydningsværdi fra hvert datapunkt. Denne horisontale transformation påvirker ikke den efterfølgende forårskonstantberegning.I kraft versus forskydning kurve, to forskellige skuespiller gruppe var forskellige, hvis den nye kraft hældning kan identificeres. Hver repræsenterer den komprimerende fase og 10 stil fase. Tilpas en regressionslinje til hver datagruppe.Linjen med stejlere hældning repræsenterer den samlede fjederkonstant i en kompressorfase, der er angivet som K1. Og den linje, der var mindste top repræsenterer linjen på denne 10 stil fase betegnet som K2.As jeg har nævnt, den samlede fjeder konstant er den gensidige af søn af serien foråret konstant af hver komponent. I den trykive fase af beatet til celletilstand strækkes molekylær limning ikke, derfor tages den molekylære bindingsfjederkonstant ikke i betragtning. Fjederkonstanten i målcellen beskrives som den ligning, der vises, hvor K1 repræsenterer den samlede fjederkonstant i kompressorfasen.I 10 stil fase af beatet til at sælge mode, den samlede forårskonstant er solen af uverse foråret konstant af den røde blodlegemer molekylære obligation. Og målcellen, bruge ligningen vises til at beregne moleculer limning foråret konstant, som K2 repræsenterer den samlede fjeder konstant. Du læser 10 stopfasen.I beatet for at slå tilstand, da B deformation er ubetydelig, svarer udtrykket, der beskriver den inverse af målcellefjederkonstanten nul, derfor svarer den samlede fjederkonstant i kompressorfasen til den røde blodlegemers forårskonstant, der viser som følgende ligning. I trækfasen kan fjederkonstanten af molekylær binding beregnes ved at trække effekten af den røde blodlegemer, der viser sig som den følgende ligning. Saml fjederkonstanter af sidevind integrere holdning B, Beta 3 kompleks, K562 celle og Febrifugin integrere holdning B Beta tre kompleks, beregne middelværdi og standard afvigelse af de afledte foråret konstanter på vælge en Newton eller nanometer skala.Nu skal du have en bedre forståelse af, hvad der er kravene til måling og fjederkonstant ud af VFD-dataene. Forskellene mellem beat til celle mode og beat at slå mode bør bemærkes. Forskellige molekyle præsentere service vil have forskellige forsvar til måling af foråret konstant.Afslutningsvis beskriver denne trinvise procedure, hvordan man udfører molekylær forårskonstantanalyse ved hjælp af BFP. Vi forudser, at der vil blive gjort en fremtidig indsats for at automatisere og integrere BFP-dataindsamlingen og DFS-analysen i ét computerstøtteprogram. Gør hele BFP-driftsdataanalysen mere brugervenlig og høj hele vejen igennem.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En Mikrofluid Teknik til sonde Cell deformerbarhed

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Dannelse af Biomembrane Microarrays med en svaber-baserede Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflade Potentiel Måling af Bakterier Brug Kelvin Probe force mikroskopi

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Måling af Maximum Isometrisk Kraft Dannet med permeabiliseres Skeletal muskelfibre

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescens Biomembrane Kraft Probe: Samtidig Kvantificering af receptor-ligand Kinetics og Binding-induceret intracellulær signalering på en enkelt celle

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...