Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

We bedanken Guillaume Troadec voor de nuttige discussie, Zihao Wang voor hardwareconsultatie en Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning en Simon Ringer voor ondersteuning van onze labstart-up. Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), en The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju is een Decra fellow van de Australian Research Council (DE190100609).

1. Analyseerbare DFS-gebeurtenissen verkrijgen
<ol><li>Start het experiment in de software (bijv. LabVIEW VI) voor de BFP-besturing en parameterinstelling(Figuur S1A).</li>
	<li>Observeer de repetitieve sonde kraal-target kraal / cel aanrakingen in de software voor BFP Monitor(Figuur S1B).</li>
	<li>Test en bereik de adhesiefrequentie ≤ 20% binnen de eerste 50 aanrakingen door de impingementkracht en contacttijd af te stemmen, waardoor het ervoor zorgt dat ≥ 89% van de DFS-adhesieg...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

Samenvattend hebben we een gedetailleerd data-analyseprotocol geleverd voor het voorbewerken van de DFS-ruwe gegevens en het afleiden van moleculaire veerconstanten in de BFP Bead-Bead en Bead-Cell analysemodi. Biomechanische modellen en vergelijkingen die nodig zijn voor het bepalen van moleculaire en cellulaire veerconstanten worden gepresenteerd. Hoewel verschillende integrinen worden bestudeerd, heeft de kmol gemeten door de Bead-Bead-modus en de Bead-Cell-modus significante bereiksverschillen ( F...

Als een live-cell DFS-techniek ontwikkelt BFP een menselijke rode bloedcel (RBC; Figuur 1) in een ultragevoelige en afstembare krachtopnemer met een compatibel veerconstantebereik bij 0,1-3 pN/nm1,2,3. Om ligand-receptorinteractie te onderzoeken, maakt BFP DFS-metingen mogelijk bij ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) en ~ 0,5 ms (10-3 s) in kracht, ruimtelijke en temporele resolutie4,5. De experimentele configuratie bestaat uit twee tegengestelde micropipettes, namelijk de Probe en het doelwit. De Probe micropipette aspirateert een RBC en een kraal wordt aan de top gelijmd via een biotine-streptavidin interactie. De kraal is bedekt met het ligand van belang (figuur 1A). De doelmicropipette aspirateert een cel of een kraal met de receptor van belang, overeenkomend met de modi Bead-Cell (Figuur 1B) en Bead-Bead (Figuur 1C) respectievelijk5.
BFP constructie, assemblage en de DFS experimentele protocollen werden eerder in detail beschreven1,6. In het kort bestaat een BFP-aanraakcyclus uit 5 fasen: Approach, Impinge, Contact, Retract en Dissociate(Figuur 1D). De horizontale RBC-toppositie wordt aangeduid als ΔxRBC. In het begin is de onbelaste (nulkracht) RBC-vervorming ΔxRBC 0 (tabel 1). Het doel wordt vervolgens aangedreven door een piëzotranslator om de sondekraal te impeneren en terug te trekken(figuur 1D). De RBC-sonde wordt eerst gecomprimeerd door het doel met negatieve RBC-vervorming ΔxRBC < 0. In een Bond-gebeurtenis gaat de Retract-fase over van een druk- naar een trekfase met positieve RBC-vervorming ΔxRBC > 0 (figuur 2C en D). Volgens de wet van Hooke kan de BFP-draagkracht worden gemeten als F = kRBC × ΔxRBC, waarbij kRBC ( tabel1) de RBC-veerconstante van de BFP is. Na het scheuren van de binding en het voltooien van de one-touch cyclus, keert de sondekraal terug naar de nulkrachtpositie met ΔxRBC = 0 (Figuur 1D).
Om de kRBCte bepalen, meten en registreren we de radii van de binnenste opening van de sondemicropipette (Rp), de RBC (R0) en het cirkelvormige contactgebied (Rc) tussen de RBC en de sondekraal ( Figuur1A). Vervolgens wordt kRBC berekend volgens het model van Evan (Eq. 1)7,8 met behulp van een LabVIEW-programma dat fungeert als een virtueel instrument (VI) om de BFP te bedienen (Figuur S1A)8,9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (Eq. 1)
Met een BFP vastgesteld en DFS ruwe gegevens verkregen, presenteren we hierbij hoe de veerconstante van ligand-receptorpaar of cellen te analyseren. De DFS ruwe gegevens over de interactie van het geglycosyleerde eiwit Thy-1 en K562 celdragende integrine α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuren 3A en 3B)10 en die van fibrinogeen en met kralen bekleed integrine αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figuur 3C) 11,12 zijn gebruikt om respectievelijk de Bead-Cell en Bead-Bead analysemodi te demonstreren.
BFP Experimentele Voorbereiding Voor meer informatie over de experimentele voorbereiding en instrumentatie van BFP verwijzen wij u naar de eerder gepubliceerde protocollen3. Kortom, humane RBC is gebiotinyleerd met behulp van de Biotine-PEG3500-NHS in de koolstof / bicarbonaatbuffer. Interessante eiwitten zijn covalent gekoppeld aan de borosilicaatglasparels met behulp van MAL-PEG3500-NHS in de fosfaatbuffer. Om zich aan de gebiotinyleerde RBC te hechten, wordt de sondekraal ook bedekt met streptavidin (SA) met behulp van de MAL-SA. Zie de tabel met materialen en tabel 2.
Om de BFP te assembleren(figuur 1, links),zal de derde micropipette met de term 'Helper' worden gebruikt om de sondekraal af te leveren en te lijmen op de top1,3vande RBC. De covalente interactie tussen de SA-gecoate sondekraal en gebiotinyleerde RBC is veel sterker dan de ligand-receptorbinding van belang. Het dissociate stadium kan dus worden geïnterpreteerd als de ligand-receptorbindingsruptuur in plaats van de loslating van probekraal van de RBC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

Een biomembrane force probe (BFP) is onlangs naar voren gekomen als een native-cell-surface of in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool die single-molecular binding kinetics kan meten, mechanische eigenschappen van ligand-receptor interacties kan beoordelen, eiwitdynamische conformatieveranderingen kan visualiseren en receptor gemedieerde celmechanosensingmechanismen spannender kan ophelderen. Meer recent is BFP gebruikt om de veerconstante van moleculaire bindingen te meten. Dit protocol beschrijft de stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van moleculaire veerconstante DFS-analyse. Specifiek worden twee BFP-werkingsmodi besproken, namelijk de Bead-Cell- en Bead-Bead-modi. Dit protocol richt zich op het afleiden van veerconstanten van de moleculaire binding en cel uit DFS-ruwe gegevens.

In dit werk hebben we het protocol van de BFP veerconstante analyse gedemonstreerd. Voor de Bead-Cell-analysemodus analyseerden we de kmol van de moleculaire binding tussen het geglycosyleerde eiwit Thy-1 gecoat op de Probe-kraal en het integrine-α5β1 uitgedrukt op de Target K562-cel (Thy-1-integrine α5β1; Figuur 3A) 10. Dek-cel is ook afgeleid van de Bead-Cell-modus (K562-cel; <s...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

Een biomembrane force probe (BFP) is een in situ dynamic force spectroscopy (DFS) techniek. BFP kan worden gebruikt om de veerconstante van moleculaire interacties op levende cellen te meten. Dit protocol presenteert veerconstante analyse voor moleculaire bindingen gedetecteerd door BFP.

Moleculaire veerconstante analyse door biomembrane force probe spectroscopie

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Deze video beschrijft stapsgewijze procedures voor het gebruik van Biomembrane Force Probe of BFP om de moleculaire veerconstante te meten. In krachtsonde is BFP onlangs opgedoken in het inheemse celoppervlak of in SITU Dynamic Force Spectroscopie-analyse. Het belangrijkste doel van deze techniek is het meten van single molecule binding genetica.Deze data-analyseprocedure is een eenvoudige maar krachtige boodschap en levert mechanische informatie op, met name de dynamische kracht en ontsteking van het celmembraan dat moleculen tot expressie brengen. Tijdens de BFP-experimentcyclus kan het microbioom van de sonde met de rode bloedcel en probate, de doelcel en de moleculaire binding van de ligandreceptor tussen de sonde en het doelwit worden beschouwd als een serie verbonden hersensysteem. Op basis van de wet van Hooke is de reciproke van de totale veerconstante van een reeksgeschakeld veersysteem gelijk aan de som van de inverse veerconstante van elke afzonderlijke component, zoals de vergelijking laat zien.De veerconstante van rode bloedcellen wordt berekend op basis van gebeurtenissenbeweging, die afhankelijk is van de radiaal van de sondemicropipette in de opening. De rode bloedcel, het cirkelvormige contactgebied tussen de rode bloedcel en de probate en de micropipet aspiraterende druk. De BFP-weggegevens worden verkregen door een zelfgemaakt virtueel instrument voor linkse weergave, dat de beweging van de doelmicropipet regelt door een PA-vertaler.Een volledige PFP-aanraakcyclus bestaat uit vijf fasen. Approach.Impinge.Contact. Intrekken en dissociëren. In het begin wordt de Robusto APICS-positie aangeduid als X is gelijk aan 0 in zwarte deshine.Het doelwit wordt vervolgens aangedreven door een stuk of vertaler om de robusto te impeneren en te comprimeren om negatieve probate beweging te veroorzaken. Je notult het als X kleiner dan nul in rode streepjeslijn. In de retract-fase gaat de rode busto-apex van de X kleiner dan nul-positie terug naar de X gelijk aan nulpositie, aangeduid als de compressiefase.Als er een binding wordt gevormd tussen het ligandreceptormolecuulcomplex, zou de rode bloedcel verder verschillen van andere positieve richtingen. Deze X-periode groter dan nul wordt de trekfase van de terugtrekkingsfase genoemd. De terugtrekkingsfase is het meest kritieke deel om de veerconstante van het molecuul van binding te bepalen.Verzamel kracht versus tijd weggegevens met behulp van het BSP-data-acquisitieplatform. Elke experiment registreert meestal 50 tot 200 aanraakcycli, Open de PFP-gegevensanalysesoftware. Klik op het gele mappictogram en selecteer het bijbehorende rijgegevensbestand door erop te dubbelklikken.We staan op het programma. Klik vervolgens op de pijlknoppen omhoog en omlaag om tussen gebeurtenissen te schakelen. De uitsluitingscriteria voor uitschieters gebruiken om ongeldige gebeurtenissen uit te schermen.Selecteer het exporterende gegevenstype dat wordt gedwongen om tijd op te maken en kies het juiste tijdsbereik. Klik op de knop Plotgegevens exporteren. De geëxporteerde gegevens worden standaard opgeslagen als tekstbestand.Dit tekstbestand bevat twee kolommen met gegevens. Het is de eerste kolom die de tijd daddies vertegenwoordigt en de tweede kolom die de overeenkomstige kracht op elk tijdstip vertegenwoordigt. Plot de kracht versus tijd curve met behulp van spreadsheets software om de geforceerde versus verplaatsing curve te verkrijgen.Vermenigvuldig de tijdswaarde van elk gegevenspunt met de PSO-beweging van Willow Steel. Nul het eerste gegevenspunt door de kleinste verplaatsingswaarde van elk gegevenspunt af te trekken. Deze horizontale transformatie heeft geen invloed op de daaropvolgende berekening van de veerconstante.In de kracht versus verplaatsingscurve verschilden twee verschillende actorgroepen als de nieuwe krachthelling kan worden geïdentificeerd. Elk vertegenwoordigt de compressiefase en de 10-stijlfase. Pas een regressielijn toe aan elke gegevensgroep.De lijn met steilere helling vertegenwoordigt de totale veerconstante bij een compressorfase aangeduid als K1. En de lijn die het kleinst was, vertegenwoordigt de lijn in deze 10-stijlfase, aangeduid als K2.As die ik heb genoemd, de totale veerconstante is de reciproke van de zoon van de serieveerconstante van elk onderdeel. Tijdens de drukfase van de beat-to-cell-modus wordt de moleculaire binding niet uitgerekt, daarom wordt de moleculaire bindingsveerconstante niet in aanmerking genomen. De veerconstante van de doelcel wordt beschreven als de weergegeven vergelijking waarbij K1 de totale veerconstante tijdens de compressorfase vertegenwoordigt.In de 10-stijlfase van de beat to sell-modus is de totale veerconstante de zon van de uverse veerconstante van de moleculaire binding van rode bloedcellen. En de doelcel, gebruik de weergegeven vergelijking om de molecuulbindingsveerconstante te berekenen, die K2 de totale veerconstante vertegenwoordigt. Je leest de 10 stop fase.In de beat to beat-modus, aangezien B-vervorming verwaarloosbaar is, benadert de term die de inverse van de doelcelveerconstante beschrijft nul, daarom is de totale veerconstante in de compressorfase gelijk aan de veerconstante van rode bloedcellen die als de volgende vergelijking wordt weergegeven. In de trekfase kan de veerconstante van de moleculaire binding worden berekend door het effect van de rode bloedcel af te trekken als de volgende vergelijking. Verzamel veerconstanten van de zijwind integrerende houding B, Beta 3-complex, de K562-cel en de Febrifugine-integrerende houding B Beta drie complex, bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de afgeleide veerconstanten op pick een Newton- of nanometerschaal.Nu zou u een beter begrip moeten hebben van wat de vereisten zijn voor het meten en de veerconstante uit de VFD-gegevens. De verschillen tussen de beat to cell-modus en de beat-to-beat-modus moeten worden opgemerkt. Verschillende molecuul presenterende dienst zal verschillende afweer hebben voor de maat van de veerconstante.Kortom, deze stapsgewijze procedure beschrijft hoe moleculaire veerconstanteanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van BFP. We voorzien dat er in de toekomst inspanningen zullen worden geleverd om de BFP-gegevensverzameling en DFS-analyse te automatiseren en te integreren in één computerrustprogramma. Het maken van de gehele BFP operatie data analyse gebruiksvriendelijker en high throughout.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...