Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

אנו מודים לגיום טרואדק על הדיון המועיל, זיהאו וואנג לייעוץ בחומרה, ולמרכז הייצור של סידני, גרג סואנינג וסיימון רינגר על התמיכה בסטארט-אפ המעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט דיסקברי מועצת המחקר האוסטרלית (DP200101970 - L.A.J.), תוכנית בניית קיבולת לב וכלי דם של NSW (מענק חוקר קריירה בתחילת אמצע - L.A.J.), פרס מאיץ המחקר של סידני (SOAR - L.A.J.), ראמאסיו מענק השקעות בריאות קרנות טי (2020HIG76 - L.A.J.), מענק רעיונות לבריאות ומחקר רפואי לאומי (APP2003904 - L.A.J.), וקרן הסטארט-אפ של הפקולטה להנדסה באוניברסיטת סידני ותוכנית ציוד גדולה (L.A.J.). בטנה ארנולד ג'ו הוא עמית מועצת המחקר האוסטרלית DECRA (DE190100609).

1. השג אירועי DFS הניתנים לניתוח
<ol><li>התחל את הניסוי בתוכנה (לדוגמה, LabVIEW VI) עבור הגדרת הבקרה והפרמטרים של BFP(איור S1A).</li>
	<li>שים לב לחרוזים/סלולריים חוזרים ונשנים של חרוזי החרוזים/תאים בתוכנה עבור צג BFP(איור S1B).</li>
	<li>בדוק והשג את תדירות ההדבקה ≤ 20% בתוך 50 הנגיעות הראשונות על יד...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

לסיכום, סיפקנו פרוטוקול ניתוח נתונים מפורט עבור עיבוד מראש של הנתונים הגולמיים של DFS וגזירת קבועי קפיץ מולקולריים במצבי ניתוח חרוזים וחרוזים BFP. מודלים ומשוואות ביומכניים הנדרשים לקביעת קבועי קפיץ מולקולריים ותאיים מוצגים. למרות שנלמדים אינטילגרינים שונים, ה-kמול הנמדד על ידי ?...

כניקת DFS של תאים חיים, BFP מהנדסת תא דם אדום אנושי (RBC; איור 1) לתוך מתמר כוח רגיש במיוחד וטונה עם טווח קבוע קפיץ תואם ב 0.1-3 pN / nm1,2,3. כדי לחקור אינטראקציה עם קולטן ליגנד, BFP מאפשר מדידות DFS ב~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 ננומטר (10-9 מ '), ו ~ 0.5 ms (10-3 s) בכוח, מרחבי, ורזולוציה זמנית4,5. התצורה הניסיונית שלו מורכבת משני מיקרופיטים מנוגדים, כלומר הגשוש והמטרה. מיקרופיפט הגשושית שואף ל-RBC וחרוז מודבק בשיאו באמצעות אינטראקציה ביוטין-סטרפטבידין. החרוז מצופה בליגנד מעניין(איור 1A). המיקרופיט היעד שואף לתא או לחרוז הנושא את קולטן העניין, המתאים למצבי חרוז-תא (איור 1B) וחרוזים (איור 1C), בהתאמה5.
בניית BFP, הרכבה ופרוטוקולי הניסוי של DFS תוארו בפירוט בעבר1,6. בקצרה, מחזור מגע BFP מורכב מ-5 שלבים: גישה, פגיעה, מגע, חזרה ושיתוק (איור 1D). מיקום השיא האופקי של RBC מסומן כ- ΔxRBC. בהתחלה, עיוות RBC שאינו מנוטר (אפס כוח) ΔxRBC הוא 0 (טבלה 1). היעד מונע על ידי פייזו-טרנסלטור שיפגע בו ויסוג מחרוז הגשושית(איור 1D). הגשושית RBC נדחסת לראשונה על ידי היעד עם עיוות RBC שלילי ΔxRBC < 0. באירוע בונד, שלב ה-Retract עובר משלב דחיסה לשלב מתיחה עם עיוות RBC חיובי ΔxRBC > 0 (איור 2C ו- D). על פי החוק של הוק, כוח הנושא BFP הוא מסוגל להימדד כ- F = kRBC × ΔxRBC, שם kRBC (טבלה 1) הוא קבוע האביב RBC של BFP. לאחר קרע באג"ח והשלמת מחזור מגע אחד, חרוז הגשושית חוזר לעמדת אפס כוח עם ΔxRBC = 0 (איור 1D).
כדי לקבוע את ה- KRBC,אנו מודדים ומתעדים את הרדי של פתח המיקרופיט הפנימי של הגשושית (Rp), RBC (R0) ואזור המגע המעגלי (Rc) בין RBC לחרוז הגשושית ( איור1A). ואז kRBC מחושב על פי המודל של אוון (Eq. 1)7,8 באמצעות תוכנית LabVIEW הפועלת ככלי וירטואלי (VI) להפעלת ה- BFP ( איורS1A)8,9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (א"ק 1)
עם BFP הוקם ונתונים גולמיים DFS הושגו, בזאת אנו מציגים כיצד לנתח את קבוע האביב של זוג קולטן ליגנד או תאים. הנתונים הגולמיים של DFS על האינטראקציה של החלבון הגליקוסילי Thy-1 ו- K562 הנושאים אינתגרין α5β1 (Thy-1-α5β1; איורים 3A ו-3B)10, ושל הפיברינוגן והחרוזים מצופים האינטיגרין αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; איור 3C) 11,12 שימשו כדי להדגים את מצבי ניתוח חרוז-תא וחרוזים, בהתאמה.
הכנה ניסיונית BFP לקבלת פרטים על הכנה ניסויית ומכשור BFP, עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר3. בקצרה, RBC האנושי כבר biotinylated באמצעות ביוטין-PEG3500-NHS במאגר פחמן / ביקרבונט. חלבונים מעניינים הוצמדו באופן קוולנטי אל חרוזי הזכוכית הבורוסיליקט באמצעות MAL-PEG3500-NHS במאגר הפוספט. כדי לצרף RBC biotinylated, חרוז הגשושית מצופה גם סטרפטאבידין (SA) באמצעות MAL-SA. נא עיין בטבלת החומרים ושולחן 2.
כדי להרכיב את ה- BFP (איור 1, משמאל), המיקרופיט השלישי המכונה 'עוזר' ישמש להעברת חרוז הגשושית ולהדבקתו לשיא של RBC1,3. האינטראקציה הקוולנטית בין חרוז הגשושית מצופה SA לבין RBC הביוטיניל הוא הרבה יותר חזק מאשר קשר קולטן ליגנד של עניין. לפיכך, ניתן לפרש את שלב הניתוק כקרע בקשר קולטן ליגנד ולא כניתוק של חרוז הגשושית מה- RBC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

בדיקה כוח biomembrane (BFP) הופיע לאחרונה כמו פני תא יליד או ספקטרוסקופיה כוח דינמית במקום (DFS) ננו-אמול שיכול למדוד קינטיקה מחייבת מולקולרית אחת, להעריך תכונות מכניות של אינטראקציות קולטן ליגנד, לדמיין שינויים קונפורמציה דינמית חלבון ומרגש יותר לפרטנרציה של תאים מיושרים קולטן. לאחרונה, BFP שימש למדידת קבוע האביב של קשרים מולקולריים. פרוטוקול זה מתאר את ההליך שלב אחר שלב לביצוע ניתוח DFS קבוע קפיץ מולקולרי. באופן ספציפי, שני מצבי פעולה BFP נדונים, כלומר מצבי חרוז-תא וחרוזים. פרוטוקול זה מתמקד בהפקת קבועי האביב של הקשר המולקולרי והתא מנתונים גולמיים של DFS.

בעבודה זו, הדגמנו את הפרוטוקול של ניתוח מתמיד האביב BFP. עבור מצב ניתוח חרוז-תא, ניתחנו את kמול של הקשר המולקולרי בין חלבון גליקוסילאט Thy-1 מצופה חרוז בדיקה ואת האינתגרין α5β1 לידי ביטוי על תא היעד K562 (Thy-1-integrin α5β1; איור 3א) 10.תא </su...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

גשושית כוח ביו-מברן (BFP) היא טכניקה של ספקטרוסקופיית כוח דינמית (DFS). BFP יכול לשמש כדי למדוד את קבוע האביב של אינטראקציות מולקולריות על תאים חיים. פרוטוקול זה מציג ניתוח מתמיד באביב עבור קשרים מולקולריים שזוהו על ידי BFP.

ניתוח מתמיד של האביב המולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית בדיקה כוח Biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

וידאו זה מתאר נהלים שלב אחר שלב על שימוש בדיקה כוח Biomembrane, או BFP כדי למדוד קבוע קפיץ מולקולרי. בגשושית כוח, BFP הופיע לאחרונה על פני השטח של התא המקורי או בניתוח ספקטרוסקופיית כוח דינמי SITU. המטרה העיקרית של טכניקה זו היא למדוד גנטיקה מחייבת מולקולה אחת.הליך ניתוח נתונים זה הוא מסר פשוט אך רב עוצמה ומספק מידע מכני, במיוחד הכוח הדינמי ודלקת של קרום התא המבטאים מולקולות. במהלך מחזור הניסויים של BFP, המיקרוביום של הגשושית הימר עם תא הדם האדום וצוואה, תא היעד וקשר מולקולרי קולטן ליגנד בין הגשוש לבין היעד יכול להיחשב כמערכת מוח מחוברת סדרה. בהתבסס על החוק של הוק, ההדדיות של קבוע האביב הכולל של מערכת קפיצים מחוברת סדרה שווה לסכום של קבוע האביב ההופכי של כל רכיב בודד, כפי שהמשוואה מראה.קבוע האביב של תא הדם האדום מחושב על סמך תנועת האירועים, התלויה לרדיאלי של מיקרופייט הגשושית בחליפה. תא הדם האדום, אזור המגע המעגלי בין תא הדם האדום לצוואה והמיקרו-פיפטה השואפת ללחץ. נתוני הכביש BFP מתקבלים על ידי מכשיר וירטואלי תוצרת בית של תצוגה שמאלית, השולט בתנועה של מיקרו-פיפט היעד על ידי מתרגם PAs.מחזור מגע מלא של PFP מורכב מחמישה שלבים. גישה. פגיעה. קשר, לסגת ולנתק. בהתחלה, מדגיש את עמדת רובוסטו APICS מסומן כמו X שווה 0 ב deshine שחור.המטרה מונעת לאחר מכן על ידי יצירה או מתרגם כדי לפגוע ולדחוס את רובוסטו כדי לגרום לתנועת צוואות שלילית. שים לב לזה כ- X קטן מאפס בקו המקף האדום. בשלב הניתון לאחור, פסגת busto האדומה נעה ממיקום X הקטן מאפס בחזרה למיקום X השווה למיקום אפס המכונה שלב הדחיסה.אם נוצר קשר בין קומפלקס מולקולת קולטן ליגנד, תא הדם האדום יהיה שונה עוד יותר לכיוון חיובי אחר. X זה, הגדול מאפס, מכונה שלב המתיחה של שלב הניתון החוזר. שלב הה לסגת הוא החלק הקריטי ביותר כדי לקבוע את קבוע האביב של המולקולה של מליטה.איסוף נתוני כוח לעומת כביש זמן באמצעות פלטפורמת רכישת הנתונים של BSP. כל ניסוי בדרך כלל להקליט 50 עד 200 מחזורי מגע, פתח את תוכנת ניתוח הנתונים PFP. לחץ על סמל התיקיה הצהובה ובחר את קובץ נתוני השורה המתאים על-ידי לחיצה כפולה עליהם.אנחנו בתוכנית. לאחר מכן לחץ על לחצני החצים למעלה ולמטה כדי לעבור בין אירועים. שימוש בקריטריוני אי-הכללה חריגים כדי לסנן אירועים לא חוקיים.בחר את סוג הנתונים המייצא שנכפה על תבנית זמן ובחר את טווח הזמן המתאים למצב. לחץ על לחצן נתוני התוויית ייצוא. הנתונים המיוצאים נשמרים כקובץ טקסט כברירת מחדל.קובץ טקסט זה מכיל שתי עמודות נתונים. זוהי העמודה הראשונה המייצגת את אבות הזמן ואת העמודה השנייה המייצגת את הכוח המתאים בכל נקודת זמן. התווה את עקומת הכוח לעומת הזמן באמצעות תוכנת גליונות אלקטרוניים כדי להשיג את עקומת ההעתקה הכפויה לעומת עקומת ההעתקה.הכפל את ערך הזמן של כל נקודת נתונים על-ידי תנועת PSO של חברת ווילו סטיל. אפס את נקודת הנתונים הראשונה על-ידי חיסור ערך ההעתקה הקטן ביותר מכל נקודת נתונים. המרה אופקית זו אינה משפיעה על חישוב קבוע האביב הבא.בעקומת הכוח לעומת העקירה, שתי קבוצות שחקנים נפרדות היו שונות אם ניתן לזהות את שיפוע הכוח החדש. כל אחד מייצג את שלב הדחיסה ואת שלב 10 הסגנונות. התאם שורת רגרסיה לכל קבוצת נתונים.הקו עם שיפוע תלול יותר מייצג את קבוע האביב הכולל בשלב מדחס מסומן K1. והקו שהיה הקטן ביותר מייצג את הקו בשלב 10 הסגנונות הזה שצוין כ K2.As שציינתי, קבוע האביב הכולל הוא ההדדי של הבן של קבוע האביב של הסדרה של כל רכיב. במהלך שלב הדחיסה של הקצב למצב התא, הקשר המולקולרי אינו נמתח, ולכן קבוע קפיץ מליטה מולקולרית אינו נלקח בחשבון. קבוע הקפיצה של תא היעד מתואר כמשוואה המוצגת כאשר K1 מייצג את קבוע הקפיצה הכולל במהלך שלב המדחס.בשלב 10 הסגנון של הקצב למכור מצב, קבוע האביב הכולל הוא השמש של קבוע האביב uverse של הקשר המולקולרי של תא הדם האדום. ותא היעד, השתמש במשוואה המוצגת כדי לחשב את קבוע קפיץ מליטה מולקולה, אשר K2 מייצג את קבוע האביב הכולל. קראת את שלב 10 העצירה.במצב פעימה כדי לנצח, שכן עיוות B הוא זניח, המונח המתאר את ההופכי של התא היעד קפיץ קבוע גישה אפס, ולכן קבוע האביב הכולל בשלב המדחס שווה ערך קבוע האביב תא הדם האדום מראה כמו המשוואה הבאה. בשלב המתיחה, ניתן לחשב את קבוע הקפיץ של הקשר המולקולרי על ידי חיסור ההשפעה של תא הדם האדום המוצג כמשוואה הבאה. לאסוף קבועי האביב של יחס שילוב רוח צד B, בטא 3 קומפלקס, תא K562 ואת גישת שילוב Febrifugine B בטא שלוש מורכב, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן של קבועי האביב נגזר בבחירת סולם ניוטון או ננומטר.עכשיו אתה צריך להבין טוב יותר מהן הדרישות למדידה וקפיץ קבוע מתוך נתוני VFD. יש להבחין בהבדלים בין הקצב למצב התא לבין מצב הקצב לביט. לשירות הצגת מולקולות שונות יהיו הגנות שונות למדידת קבוע האביב.לסיכום, הליך זה צעד אחר צעד מתאר כיצד לבצע ניתוח קבוע האביב המולקולרי באמצעות BFP. אנו צופים שמאמצים עתידיים ייעשו כדי להפוך את רכישת הנתונים של BFP לאוטומטית ולשלב את רכישת הנתונים BFP וניתוח DFS בתוכנית מנוחה אחת למחשב. מה שהופך את כל ניתוח נתוני הפעולה של BFP לידידותי יותר למשתמש וגבוה לאורך כל הדרך.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...