Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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Ringraziamo Guillaume Troadec per l'utile discussione, Zihao Wang per la consulenza hardware e Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning e Simon Ringer per il supporto della nostra startup di laboratorio. Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), nsw Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) e The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju è un borsista DECRA dell'Australian Research Council (DE190100609).

1. Ottenere eventi DFS analizzabili
<ol><li>Avviare l'esperimento nel software (ad esempio, LabVIEW VI) per il controllo BFP e l'impostazione dei parametri (Figura S1A).</li>
	<li>Osservare i ripetitivi tocchi di perle/celle del bersaglio della sonda nel software per BFP Monitor (Figura S1B).</li>
	<li>Testare e raggiungere la frequenza di adesione ≤ 20% entro i primi 50 tocchi regolando la forza di impingement e il tempo di contatto, con cui assicura che ≥'89% dell'evento di adesi...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

In sintesi, abbiamo fornito un protocollo di analisi dei dati dettagliato per la pre-elaborazione dei dati grezzi DFS e la derivazione di costanti molecolari a molla nelle modalità di analisi BFP Bead-Bead e Bead-Cell. Vengono presentati i modelli biomeccanici e le equazioni necessarie per determinare le costanti molecolari e cellulari della molla. Sebbene siano studiate integrine diverse, la kmol misurata dal modo Bead-Bead e il modo Bead-Cell possiedono differenze di gamma significative ( Figura<st...

Come tecnica DFS a cellule vive, BFP progetta un globuli rossi umani (RBC; Figura 1) in un trasduttore di forza ultrasensibile e sintonizzabile con un intervallo costante di molla compatibile a 0,1-3 pN/nm1,2,3. Per sondare l'interazione ligando-recettore, BFP consente misurazioni DFS a ~ 1 pN(10 -12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) e ~ 0,5 ms(10 -3 s) in forza, risoluzione spaziale e temporale4,5. La sua configurazione sperimentale è costituita da due micropipette opposte, ovvero la sonda e il bersaglio. La micropipetta Probe aspira un RBC e una perle viene incollata al suo apice tramite un'interazione biotina-streptavitina. Il perno è rivestito con il ligando di interesse (Figura 1A). La micropipetta target aspira una cellula o una perna che porta il recettore di interesse, corrispondente rispettivamente alle modalità Bead-Cell (Figura 1B) e Bead-Bead (Figura 1C), rispettivamente5.
La costruzione, l'assemblaggio e i protocolli sperimentali DFS BFP sono stati descritti in dettaglio in precedenza1,6. In breve, un ciclo tattile BFP è costituito da 5 fasi: Approccio, Impinge, Contatto, Retract e Dissociate (Figura 1D). La posizione dell'apice RBC orizzontale è indicata come ΔxRBC. All'inizio, la deformazione RBC non accentata (forza zero) ΔxRBC è 0 (Tabella 1). Il bersaglio viene quindi guidato da un piezotraduatore per impattarsi e ritrarsi dal perla della sonda (Figura 1D). La sonda RBC viene prima compressa dal Target con deformazione RBC negativa ΔxRBC < 0. In un evento di legame, lo stadio di retrazione passa da una fase di compressione a una fase di trazione con deformazione RBC positiva ΔxRBC > 0 (Figura 2C e D). Secondo la legge di Hooke, la forza portante BFP può essere misurata come F = kRBC × ΔxRBC, dove kRBC ( Tabella1) è la costante della molla RBC del BFP. Dopo la rottura del legame e il completamento di un ciclo di tocco, il perle della sonda ritorna in posizione di forza zero con ΔxRBC = 0 (Figura 1D).
Per determinare il kRBC,misuriamo e registriamo i raggi dell'orifizio interno della micropipetta della sonda (Rp), l'RBC (R0) e l'area di contatto circolare (Rc) tra l'RBC e il perlo della sonda ( Figura1A). Quindi kRBC viene calcolato secondo il modello di Evan (Eq. 1)7,8 utilizzando un programma LabVIEW che funge da strumento virtuale (VI) per far funzionare il BFP(Figura S1A)8,9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (Eq. 1)
Con un BFP stabilito e i dati grezzi DFS ottenuti, presentiamo come analizzare la costante di molla della coppia o delle cellule ligando-recettore. I dati grezzi DFS sull'interazione della proteina glicosilata Thy-1 e della cellula K562 portante integrina α5β1 (Thy-1-α5β1; Figure 3A e 3B)10 e quella dell'integrina rivestita di fibrinogeno e perle αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 sono stati utilizzati per dimostrare le modalità di analisi Bead-Cell e Bead-Bead, rispettivamente.
Preparazione sperimentale BFP Per i dettagli sulla preparazione sperimentale e la strumentazione BFP, fare riferimento ai protocolli3precedentemente pubblicati. In breve, l'RBC umano è stato biotinilato utilizzando la Biotina-PEG3500-NHS nel tampone di carbonio / bicarbonato. Le proteine di interesse sono state accoppiate covalentemente alle perle di vetro borosilicato utilizzando MAL-PEG3500-NHS nel tampone fosfato. Per attaccarsi al RBC biotinilato, il perla della sonda è anche rivestito con streptavitina (SA) utilizzando il MAL-SA. Si prega di consultare la Tabella dei materiali e la Tabella 2.
Per assemblare il BFP (Figura 1, a sinistra), la terza micropipetta denominata 'Helper' verrà utilizzata per consegnare la sonda e incollarla all'apice del RBC1,3. L'interazione covalente tra il perle della sonda rivestito sa e l'RBC biotinilato è molto più forte del legame ligando-recettore di interesse. Pertanto, lo stadio di dissociato può essere interpretato come la rottura del legame ligando-recettore piuttosto che il distacco del perlo della sonda dal RBC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

Una sonda di forza biomembrana (BFP) è recentemente emersa come nanostrutto per spettroscopia di forza dinamica (DFS) a superficie cellulare nativa o in situ in grado di misurare la cinetica di legame molecolare singolo, valutare le proprietà meccaniche delle interazioni ligando-recettore, visualizzare i cambiamenti conformazionali dinamici della proteina e chiarire in modo più eccitante i meccanismi di meccanosensing cellulare mediati dal recettore. Più recentemente, la BFP è stata utilizzata per misurare la costante di molla dei legami molecolari. Questo protocollo descrive la procedura passo-passo per eseguire l'analisi DFS a molla molecolare costante. In particolare, vengono discusse due modalità operative BFP, vale a dire le modalità Bead-Cell e Bead-Bead. Questo protocollo si concentra sulla derivazione di costanti molle del legame molecolare e della cellula dai dati grezzi DFS.

In questo lavoro, abbiamo dimostrato il protocollo dell'analisi costante della molla BFP. Per la modalità di analisi Bead-Cell, abbiamo analizzato il kmol del legame molecolare tra la proteina glicosilata Thy-1 rivestita sul probe bead e l'integrina α5β1 espressa sulla cellula Target K562 (Thy-1-integrina α5β1; Figura 3A) 10. Lacella kderiva anche dal modo Bead-Cell (K562 Cell; <...

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Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.

Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Questo video descrive le procedure dettagliate sull'utilizzo della sonda a forza biomembrana o BFP per misurare la costante molecolare della molla. Nella sonda di forza, la BFP è recentemente emersa nella superficie cellulare nativa o nell'analisi SITU Dynamic Force Spectroscopy. Lo scopo principale di questa tecnica è quello di misurare la genetica di legame a singola molecola.Questa procedura di analisi dei dati è un messaggio semplice ma potente e fornisce informazioni meccaniche, in particolare la forza dinamica e l'infiammazione della membrana cellulare che esprime molecole. Durante il ciclo dell'esperimento BFP, la scommessa del microbioma della sonda con il globuli rosso e la successione, la cellula bersaglio e il legame molecolare del recettore del ligando tra la sonda e il bersaglio possono essere considerati come un sistema cerebrale collegato in serie. In base alla legge di Hooke, il reciproco della costante totale della molla di un sistema di molle connesse in serie è uguale alla somma della costante di molla inversa di ogni singolo componente, come mostra l'equazione.La costante di molla dei globuli rossi viene calcolata in base al movimento degli eventi, che dipende dal radiale della micropipetta della sonda nell'orifizio. Il globuli rossi, l'area di contatto circolare tra il globuli rosso e la successione e la micro-pipetta aspirando la pressione. I dati stradali BFP sono ottenuti da uno strumento virtuale di visione sinistra fatto in casa, che controlla il movimento della micro-pipetta target da un traduttore di VA.Un ciclo tattile PFP completo è composto da cinque fasi. Approach.Impinge.Contact. Ritrarre e dissociarsi. All'inizio, sottolinea che la posizione robusto APICS è indicata come X uguale a 0 in deshine nero.Il bersaglio viene quindi guidato da un pezzo o da un traduttore per impattire e comprimere il robusto per causare un movimento di successione negativo. Lo noti come X più piccolo di zero nella linea del trattino rosso. Nella fase di retrazione, l'apice del busto rosso si sposta dalla posizione X più piccola di zero alla posizione X uguale a zero denominata fase di compressione.Se si forma un legame tra il complesso molecolare del recettore del ligando, il globuli rosso sarebbe ulteriormente diverso da un'altra direzione positiva. Questo periodo X maggiore di zero è indicato come la fase di trazione dello stadio di retrazione. Lo stadio di retrazione è la parte più critica per determinare la costante di molla della molecola di legame.Raccogli i dati stradali forza/tempo utilizzando la piattaforma di acquisizione dati BSP. Ogni esperimento di solito registra da 50 a 200 cicli di tocco, apri il software di analisi dei dati PFP. Fare clic sull'icona della cartella gialla e selezionare il file di dati della riga corrispondente facendo doppio clic su di essi.Siamo nel programma. Quindi fare clic sui pulsanti freccia su e giù per passare da un evento all'altro. Utilizzo dei criteri di esclusione anomala per escludere eventi non validi.Selezionare il tipo di dati di esportazione forzato al formato temporale e scegliere l'intervallo di tempo di stato appropriato. Fare clic sul pulsante Esporta dati di plottaggio. I dati esportati vengono salvati come file di testo per impostazione predefinita.Questo file di testo contiene due colonne di dati. È la prima colonna che rappresenta i papà del tempo e la seconda colonna che rappresenta la forza corrispondente in ogni punto temporale. Traccia la curva di forza rispetto a quella temporale utilizzando un software di fogli di calcolo per ottenere la curva forzata rispetto a quella di spostamento.Moltiplicare il valore temporale di ciascun punto dati per il movimento PSO Willow Steel. Azzerare il primo punto dati sottraendo il valore di spostamento più piccolo da ciascun punto dati. Questa trasformazione orizzontale non influisce sul successivo calcolo della costante di molla.Nella curva forza contro spostamento, due gruppi distinti di attori erano diversi se si può identificare la nuova pendenza della forza. Ognuno rappresenta la fase compressiva e la fase di stile 10. Adatta una linea di regressione a ciascun gruppo di dati.La linea con pendenza più ripida rappresenta la costante totale della molla in una fase del compressore indicata come K1. E la linea che era la parte superiore più piccola rappresenta la linea in questa fase di stile 10 indicata come K2.As ho menzionato, la costante totale della molla è il reciproco del figlio della costante di molla di serie di ciascun componente. Durante la fase di compressione del battito in modalità cellulare, il legame molecolare non viene allungato, quindi la costante della molla di legame molecolare non viene presa in considerazione. La costante della molla della cella target è descritta come l'equazione visualizzata dove K1 rappresenta la costante totale della molla durante la fase del compressore.Nella fase di stile 10 della modalità beat to sell, la costante totale della primavera è il sole della costante della molla uverse del legame molecolare dei globuli rossi. E la cellula bersaglio, usa l'equazione visualizzata per calcolare la costante della molla di legame del moleculer, che K2 rappresenta la costante totale della molla. Si legge la fase di 10 stop.Nella modalità beat to beat, poiché la deformazione B è trascurabile, il termine che descrive l'inverso della costante della molla della cella target si avvicina allo zero, quindi la costante totale della molla nella fase del compressore è equivalente alla costante della molla dei globuli rossi che mostra come la seguente equazione. Nella fase di trazione, la costante di molla del legame molecolare può essere calcolata sottraendo l'effetto del globuli rossi mostrando come seguente equazione. Raccogliere le costanti di molla del side-wind integrando l'assetto B, il complesso Beta 3, la cella K562 e la Febrifugina integrando l'atteggiamento B Beta tre complessi, calcolare la deviazione media e standard delle costanti di molla derivate su scala Newton o nanometri.Ora dovresti avere una migliore comprensione di quali sono i requisiti per la misurazione e la costante di molla dai dati VFD. Le differenze tra la modalità beat to cell e la modalità beat to beat dovrebbero essere notate. Diverse molecole che presentano il servizio avranno difese diverse per la misura della costante di molla.In conclusione, questa procedura passo-passo descrive come eseguire l'analisi costante della molla molecolare utilizzando la BFP. Prevediamo che saranno fatti sforzi futuri per automatizzare e integrare l'acquisizione dei dati BFP e l'analisi DFS in un unico programma di riposo per computer. Rendere l'intera analisi dei dati operativi BFP più facile da usare e alta in tutto.

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