Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Vi takker Guillaume Troadec for nyttig diskusjon, Zihao Wang for maskinvarekonsultasjon, og Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning og Simon Ringer for støtte til vår lab-oppstart. Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), og University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund og Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju er en australsk forskningsråd DECRA fellow (DE190100609).

1. Få tak i analyserbare DFS-hendelser
<ol><li>Start eksperimentet i programvaren (f.eks. LabVIEW VI) for BFP-kontrollen og parameterinnstillingen (Figur S1A).</li>
	<li>Vær oppmerksom på de repeterende sondeperle-bead/celleinnslagene i programvaren for BFP Monitor (Figur S1B).</li>
	<li>Test og oppnå vedheftsfrekvensen ≤ 20 % i løpet av de første 50 berøringene ved å justere impingementkraften og kontakttiden, der den sikrer at ≥ 89 % av DFS-vedheftshendelsen formidles av ...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

Oppsummert har vi gitt en detaljert dataanalyseprotokoll for forhåndsbehandling av DFS-rådata og avlede molekylære vårkonstanter i analysemodusene BFP Bead-Bead og Bead-Cell. Biomekaniske modeller og ligninger som kreves for å bestemme molekylære og cellulære vårkonstanter presenteres. Selv om forskjellige integriner studeres, har kmol målt ved Bead-Bead-modus og Bead-Cell-modus betydelige områdeforskjeller ( Figur3A vs. Figur 3C). ...

Som en live-celle DFS-teknikk utvikler BFP en menneskelig rød blodlegeme (RBC; Figur 1) inn i en ultrasensitiv og justerbar krafttransduser med et kompatibelt fjærkonstantområde på 0,1-3 pN/nm1,2,3. For å undersøke ligandreseptorinteraksjon aktiverer BFP DFS-målinger ved ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) og ~0,5 ms (10-3 s) i kraft, romlig og tidsmessig oppløsning4,5. Den eksperimentelle konfigurasjonen består av to motsatte mikropipetter, nemlig sonden og målet. Probemikropipetten aspirerer en RBC og en perle limes på toppen via en biotin-streptavidin interaksjon. Perlen er belagt med ligaen av interesse (Figur 1A). Målmikropipetten aspirerer enten en celle eller en perle som bærer reseptoren av interesse, tilsvarende bead-celle (figur 1B) og perle(figur 1C) modi, henholdsvis5.
BFP-konstruksjon, montering og DFS eksperimentelle protokoller ble beskrevet i detalj tidligere1,6. Kort sagt består en BFP-berøringssyklus av 5 trinn: Approach, Impinge, Contact, Retract and Dissociate (Figur 1D). Den horisontale RBC apex-posisjonen er betegnet som ΔxRBC. I begynnelsen er den ubenyttede (nullkrafts) RBC-deformasjonen ΔxRBC 0 (Tabell 1). Målet drives deretter av en piezotranslator for å hindre og trekke seg tilbake fra sondeperlen (figur 1D). RBC-sonden komprimeres først av Target med negativ RBC-deformasjon ΔxRBC < 0. I en Bond-hendelse går tilbaketrekningsfasen fra et kompressiv til en strekkfase med positiv RBC-deformasjon ΔxRBC > 0 (Figur 2C og D). I henhold til Hookes lov kan BFP-lagerkraften måles som F = kRBC × ΔxRBC, der kRBC ( tabell1) er RBC-fjærkonstanten til BFP. Ved bindingsbrudd og fullføring av en berøringssyklus går sondeperlen tilbake til nullkraftposisjon med ΔxRBC = 0 (Figur 1D).
For å bestemme kRBCmåler og registrerer vi radiene til sondens mikropipette indre åpning (Rp), RBC (R0) og det sirkulære kontaktområdet (Rc) mellom RBC og sondeperlen ( figur1A). Deretter beregnes kRBC i henhold til Evans modell (Eq. 1)7,8 ved hjelp av et LabVIEW-program som fungerer som et virtuelt instrument (VI) for å betjene BFP ( FigurS1A)8,9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (Eq. 1)
Med en BFP etablert og DFS rådata oppnådd, presenterer vi herved hvordan vi analyserer vårkonstanten til ligandreseptorpar eller celler. DFS-rådataene om samspillet mellom det glykosylerte proteinet Thy-1 og K562 cellebærende integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figur 3A og 3B)10 og fibrinogen og perle belagt integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 har blitt brukt til å demonstrere bead-cell og perle analyse moduser, henholdsvis.
BFP eksperimentell forberedelse Hvis du vil ha mer informasjon om BFP eksperimentell forberedelse og instrumentering, kan du se de tidligere publiserte protokollene3. Kort fortalt har human RBC blitt biotinylert ved hjelp av Biotin-PEG3500-NHS i karbon/bikarbonatbufferen. Proteiner av interesse har blitt kovalent koblet til borosilikatglassperler ved hjelp av MAL-PEG3500-NHS i fosfatbufferen. For å feste til den biotinylerte RBC, er sondeperlen også belagt med streptavidin (SA) ved hjelp av MAL-SA. Se Materialtabellen og tabell 2.
For å montere BFP (Figur 1, venstre), vil den tredje mikropipetten kalt 'Hjelper' bli brukt til å levere sondeperlen og lime den til RBCs apex1,3. Den kovalente interaksjonen mellom SA-belagt sondeperle og biotinylert RBC er mye sterkere enn den ligandreseptorbindingen av interesse. Dermed kan Dissociate-scenen tolkes som ligandreseptorbindingsbruddet i stedet for løsrivelse av sondeperle fra RBC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

En biomembrane force probe (BFP) har nylig dukket opp som en innfødt-celle-overflate eller in situ dynamisk kraft spektroskopi (DFS) nanoverktøy som kan måle enkeltmolekylære binding kinetikk, vurdere mekaniske egenskaper av ligand-reseptor interaksjoner, visualisere protein dynamiske konformasjonsendringer og mer spennende belyse reseptormediert celle mechanosensing mekanismer. Mer nylig har BFP blitt brukt til å måle vårkonstanten av molekylære bindinger. Denne protokollen beskriver den trinnvise prosedyren for å utføre molekylær vårkonstant DFS-analyse. Nærmere bestemt diskuteres to BFP-operasjonsmoduser, nemlig Bead-Cell- og Bead-Bead-modusene. Denne protokollen fokuserer på å utlede vårkonstanter av molekylærbindingen og cellen fra DFS-rådata.

I dette arbeidet har vi demonstrert protokollen til BFP vårens konstante analyse. For Bead-Cell analysemodus analyserte vi kmol av molekylær binding mellom det glykosylerte proteinet Thy-1 belagt på sondeperlen og den integrinske α5β1 uttrykt på Target K562-cellen (Thy-1-integrin α5β1; Figur 3A) 10. K-cellen er også avledet fra Bead-Cell-modus (K562 Cell; ...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

En biomembrane force probe (BFP) er en in situ dynamic force spektroskopi (DFS) teknikk. BFP kan brukes til å måle vårkonstanten av molekylære interaksjoner på levende celler. Denne protokollen presenterer vårkonstantanalyse for molekylære bindinger oppdaget av BFP.

Molekylær vårkonstantanalyse av Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Denne videoen beskriver trinnvise prosedyrer for bruk av Biomembrane Force Probe, eller BFP for å måle molekylær fjærkonstant. I kraftsonde har BFP nylig dukket opp i den opprinnelige celleoverflaten eller i SITU Dynamic Force Spectroscopy-analysen. Hovedmålet med denne teknikken er å måle enkeltmolekylbindende genetikk.Denne dataanalyseprosedyren er et enkelt, men kraftig budskap og gir mekanisk informasjon, spesielt den dynamiske kraften og betennelsen i cellemembranen som uttrykker molekyler. Under BFP-eksperimentsyklusen kan sondemikrobiomet satse med den røde blodcellen og rabatten, målcellen og ligandreseptormolekylær bindingen mellom sonden og målet betraktes som et serietilkoblet hjernesystem. Basert på Hookes lov er resiprokalen til den totale vårkonstanten til et serietilkoblet fjærsystem lik summen av den inverse vårkonstanten til hver enkelt komponent, som ligningen viser.Vårkonstanten av rød blodlegeme beregnes basert på hendelsesbevegelse, som er avhengig av radial av sondemikropipetten i åpningen. Den røde blodcellen, det sirkulære kontaktområdet mellom den røde blodcellen og rabatten og mikropipetten aspirerende trykk. BFP-veidataene er innhentet av et hjemmelaget virtuelt venstre visning-instrument, som styrer bevegelsen av målmikropipetten av en PAs-oversetter.En fullstendig PFP-berøringssyklus består av fem trinn. Approach.Impinge.Contact. Trekk tilbake og ta avstand fra. I begynnelsen, understreker Robusto APICS posisjon er betegnet som X tilsvarer 0 i svart deshine.Målet drives deretter av et stykke eller en oversetter for å hindre og komprimere robustoen for å forårsake negativ rabattbevegelse. Du noterer den som X mindre enn null i rød streklinje. I tilbakekallingsfasen flyttes den røde busto-apexen fra X mindre enn nullposisjonen tilbake til X lik nullposisjonen som kalles komprimeringsfasen.Hvis det dannes et bånd mellom ligandreseptormolekylkomplekset, vil den røde blodcellen ytterligere forskjellig fra annen positiv retning. Denne X-perioden som er større enn null, kalles strekkfasen av tilbaketrekkingsfasen. Tilbaketrekningsstadiet er den mest kritiske delen for å bestemme vårkonstanten av bindingsmolekylet.Samle inn kraft kontra tidsveidata ved hjelp av BSP-datainnsamlingsplattformen. Hvert eksperiment registrerer vanligvis 50 til 200 berøringssykluser, Åpne PFP-dataanalyseprogramvaren. Klikk på det gule mappeikonet og velg den tilsvarende raddatafilen ved å dobbeltklikke på dem.Vi er på programmet. Klikk deretter på pil opp og pil ned for å bytte mellom hendelser. Bruke de ytterste utelatelseskriteriene til å sile ut ugyldige hendelser.Velg den eksporterende datatypen som er tvunget til tidsformat, og velg riktig tidsintervall for tilstand. Klikk på eksporttegningsdataknappen. De eksporterte dataene lagres som standard som tekstfil.Denne tekstfilen inneholder to kolonner med data. Det er den første kolonnen som representerer tiden daddies og den andre kolonnen som representerer den tilsvarende kraften på hvert tidspunkt. Tegn kraften kontra tidskurven ved hjelp av regnearkprogramvare for å oppnå den tvungne kontra forskyvningskurven.Multipliser tidsverdien for hvert datapunkt med Willow Steel PSO-bevegelsen. Nullstill det første datapunktet ved å trekke den minste forskyvningsverdien fra hvert datapunkt. Denne horisontale transformasjonen påvirker ikke den påfølgende vårkonstantberegningen.I kraft kontra forskyvningskurve var to distinkte aktørgrupper forskjellige hvis den nye krafthellingen kan identifiseres. Hver av dem representerer komprimeringsfasen og 10-stilfasen. Tilpasser en regresjonslinje til hver datagruppe.Linjen med brattere skråning representerer den totale fjærkonstanten i en kompressorfase betegnet som K1. Og linjen som var den minste toppen representerer linjen i denne 10-stilfasen betegnet som K2.As jeg har nevnt, den totale vårkonstanten er resiprokalen til sønnen til seriens vårkonstant for hver komponent. Under den kompresjonsfasen av takten til cellemodus strekkes ikke molekylær binding, derfor tas ikke den molekylære bindingsfjærkonstanten i betraktning. Fjærkonstanten til målcellen beskrives som ligningen som vises der K1 representerer den totale fjærkonstanten under kompressorfasen.I 10-stilfasen av takten for å selge modus, er den totale vårkonstanten solen til den uverse vårkonstanten til den røde blodcellemolekylære bindingen. Og målcellen, bruk ligningen som vises for å beregne molekylerbindingsfjærkonstanten, som K2 representerer den totale vårkonstanten. Du leser 10 stoppfasen.I takt til beat-modus, siden B-deformasjon er ubetydelig, er begrepet som beskriver det motsatte av målcellefjærkonstanten null, derfor tilsvarer den totale vårkonstanten i kompressorfasen den røde blodlegemens vårkonstant som vises som følgende ligning. I strekkfasen kan vårkonstanten av molekylær binding beregnes ved å trekke effekten av den røde blodcellen som vises som følgende ligning. Samle vårkonstanter av sidevindintegrerende holdning B, Beta 3-komplekset, K562-cellen og Febrifugine-integrerende holdning B Beta tre komplekset, beregn gjennomsnitts- og standardavviket til de avledede vårkonstantene ved å velge en Newton- eller nanometerskala.Nå bør du ha en bedre forståelse av hva som er kravene til måling og vårkonstant ut av VFD-dataene. Forskjellene mellom beat til cellemodus og beat til beat-modus bør legges merke til. Ulike molekyl presentasjonstjeneste vil ha forskjellige forsvar til målet på vårkonstanten.Til slutt beskriver denne trinnvise prosedyren hvordan du utfører molekylær vårkonstantanalyse ved hjelp av BFP. Vi forutser fremtidig innsats for å automatisere og integrere BFP-datainnsamlingen og DFS-analysen i ett datastøtteprogram. Gjør hele BFP-operasjonsdataanalysen mer brukervennlig og høy gjennomgående.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En mikrofluid Technique å sondere Cell Fleksibilitet

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Dannelse av biomembranen Mikromatriser med en nal-basert Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflaten Potential Måling av bakterier ved hjelp av Kelvin Probe Force Mikros

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Måling av maksimal isometrisk Force generert av permeabilized skjelettmuskulatur Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescens Biomembrane Force Probe: Samtidig Kvantifisering av Receptor-ligand Kinetics og Binding-indusert intracellulære signal på en enkelt celle

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...