Name: molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Yararlı tartışmalar için Guillaume Troadec'e, donanım danışmanlığı için Zihao Wang'a ve laboratuvar girişimimizi desteklediği için Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning ve Simon Ringer'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi (DP200101970 - L.A.J.), NSW Kardiyovasküler Kapasite Geliştirme Programı (Erken-Orta Kariyer Araştırmacısı Grant - L.A.J.), Sydney Araştırma Hızlandırıcı ödülü (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations tarafından desteklendi. Sağlık Yatırım Hibesi (2020HIG76 - L.A.J.), Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Fikirler Hibesi (APP2003904 - L.A.J.) ve Sydney Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Başlangıç Fonu ve Ana Ekipman Programı (L.A.J.). Lining Arnold Ju, Avustralya Araştırma Konseyi DECRA üyesidir (DE190100609).

1. Çözümlenebilir DFS Olayları Elde Edin
<ol><li>BFP kontrolü ve parametre ayarı(Şekil S1A)için deneyi yazılımda (örneğin LabVIEW VI) başlatın.</li>
	<li>BFP Monitörü(Şekil S1B)yazılımında tekrarlayan prob boncuk hedef boncuk / hücre dokunuşlarını gözlemleyin.</li>
	<li>DFS yapıştırma olayının ≥% 89'unun tek bir bağ tarafından aracılık ≤ sağladığı impingement kuvvetini ve temas süresini ayarlayarak ilk 50 dokunuşta%20y...

<ol>
	<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe:+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell.">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).</li><li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics.">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li><li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds.">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li><li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells.">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li><li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+cell+mechanosensing.">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes.">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces.">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models.">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).</li><li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4+trimolecular+complex.">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886 (2014).</li><li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion.">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation.">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li><li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+force+spectroscopy+on+cells.">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li><li>Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib&#945;.">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ib&#945;.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li><li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals.">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447 (2016).</li></ol>

Özetle, BFP Boncuk-Boncuk ve Boncuk Hücre analiz modlarında DFS ham verilerinin ön işlemesi ve moleküler yay sabitlerinin türetilmesi için ayrıntılı bir veri analizi protokolü sağladık. Moleküler ve hücresel yay sabitlerinin belirlenmesi için gerekli biyomekanik modeller ve denklemler sunulmuştur. Farklı integrinler çalışılmış olsa da, Boncuk-Boncuk modu ve Boncuk Hücresi modu ile ölçülen kmol önemli aralık farklılıklarına sahiptir(Şekil 3A</stro...

Canlı hücreli bir DFS tekniği olarak, BFP bir insan kırmızı kan hücresi (RBC; Şekil 1) 0.1-3 pN/nm 1,2,3'te uyumlu bir yay sabit aralığına sahip ultra duyarlı ve ayarlanabilir bir kuvvetdönüştürücüye. Ligand-reseptör etkileşimini araştırmak için BFP, DFS ölçümlerini ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) ve ~0,5 ms(10 -3 s) kuvvet, mekansal ve zamansal çözünürlük4,5'te etkinleştirir. Deneysel konfigürasyonu iki karşıt mikropipetten oluşur, yani Prob ve hedef. Prob mikropipette bir RBC'yi aspire eder ve bir boncuk, biotin-streptavidin etkileşimi yoluyla tepe noktasında yapıştırılır. Boncuk, ilgi çekici ligand ile kaplanmıştır (Şekil 1A). Hedef mikropipette, sırasıyla Boncuk Hücresi (Şekil 1B) ve Boncuk-Boncuk ( Şekil 1C ) modlarına karşılık gelen,ilgi çekiciyi taşıyan bir hücre veya boncuk aspireeder.
BFP inşaat, montaj ve DFS deneysel protokolleri daha önce ayrıntılı olarak açıklanmıştır1,6. Kısaca, bir BFP dokunma döngüsü 5 aşamadan oluşur: Yaklaşım, impinge, temas, geri çekme ve ayrışma (Şekil 1D). Yatay RBC apeks konumu ΔxRBColarak gösterilir. Başlangıçta, paysız (sıfır kuvvet) RBC deformasyonu ΔxRBC 0'dır( Tablo 1 ). Hedef daha sonra bir piezotranslator tarafından Prob boncuk üzerinde impinge ve geri çekmek için tahrik edilir (Şekil 1D). RBC probu ilk olarak Hedef tarafından negatif RBC deformasyonu ΔxRBC < 0 ile sıkıştırılır. Bir Bond olayında, Geri Çekme aşaması pozitif RBC deformasyonu Δ x RBC> 0(Şekil 2C ve D)ile bir basınçtan çekme faza geçiş yapar. Hooke yasasına göre, BFP rulman kuvveti F = kRBC × ΔxRBColarak ölçülebiliyor, burada kRBC ( Tablo1) BFP'nin RBC yay sabitidir. Bağ yırtılması ve bir dokunma döngüsünün tamamlanması üzerine, prob boncuk ΔxRBC = 0 (Şekil 1D)ile sıfır kuvvet konumuna geri döner.
kRBC'yibelirlemek için, prob mikropipette iç deliğin (Rp), RBC ( R0) ve RBC ile prob boncuk arasındaki dairesel temas alanının (Rc) radiisini ölçüp kaydederiz (Şekil 1A). Daha sonra kRBC, Evan'ın modeline göre hesaplanır (Eq.1) 7,8, BFP ' yi çalıştırmak için sanal bir enstrüman (VI) görevi görür bir LabVIEW programı kullanılarak ( ŞekilS1A)8,9.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg"> (Eş. 1)
Kurulan bir BFP ve elde edilen DFS ham verileri ile ligand-reseptör çiftinin veya hücrelerinin yay sabitinin nasıl analiz edildiğini sunuyoruz. Glikosillenmiş protein Thy-1 ve K562 hücreli integrin α 5 β1(Thy-1-α 5 β1' in etkileşimineilişkinDFSham verileri; Şekil 3A ve 3B)10 ve fibrinojen ve boncuk kaplı integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Şekil 3C) 11,12 sırasıyla Boncuk Hücre ve Boncuk-Boncuk analiz modlarını göstermek için kullanılmıştır.
BFP Deneysel Hazırlık BFP deneysel hazırlık ve enstrümantasyonunun ayrıntıları için lütfen daha önce yayınlanan protokollere bakın3. Kısacası, insan RBC karbon/bikarbonat tamponunda Biotin-PEG3500-NHS kullanılarak biyotinillenmiştir. İlgi çekici proteinler, fosfat tamponunda MAL-PEG3500-NHS kullanılarak borosilikat cam boncuklarla birlikte tanımlanmıştır. Biyotinillenmiş RBC'ye bağlanmak için, prob boncuk ayrıca MAL-SA kullanılarak streptavidin (SA) ile kaplanır. Lütfen Malzeme Masası ve Tablo 2'yebakın. 
BFP'yi monte etmek için (Şekil 1, sol), prob boncuklarını teslim etmek ve RBC'nin apeksi1,3'e yapıştırmak için 'Yardımcı' olarak adlandırılan üçüncü mikropipette kullanılacaktır. SA kaplamalı prob boncuk ve biyotinilasyonlu RBC arasındaki etkileşim, ligand-reseptör bağından çok daha güçlüdür. Bu nedenle, Ayrışma aşaması, Prob boncukunun RBC'den kopuşundan ziyade ligand-reseptör bağı kopuşsu olarak yorumlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td>
			<td>Uct, Specialties, llc</td>
			<td>4420-74-0</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data acquisition VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP control and parameter setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BFP data analysis VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP raw data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5026-1</td>
			<td>RBC biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass beads</td>
			<td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td>
			<td>9002</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0336</td>
			<td>Ligand functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera VI</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
			<td>BFP monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAL-PEG3500-NHS</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A5002-1</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td>Carbonate/bicarbonate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Tyrode&#8217;s buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4&#8226;H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Phosphate buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Maleimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9415</td>
			<td>Glass bead functionalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular spring constant analysis by biomembrane force probe spectroscopy

Bir biyomembran kuvvet sondası (BFP) son zamanlarda tek moleküler bağlayıcı kinetiği ölçebilen, ligand-reseptör etkileşimlerinin mekanik özelliklerini değerlendirebilen, protein dinamik konformasyonel değişiklikleri ve daha heyecan verici bir şekilde elucidate reseptör aracılı hücre mekanosensing mekanizmalarını değerlendirebilen bir yerli hücre yüzeyi veya yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) nanotool olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, BFP moleküler bağların yay sabitini ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol, moleküler yay sabit DFS çözümlemesi gerçekleştirmek için adım adım yordamı açıklar. Özellikle, boncuk hücresi ve boncuk-boncuk modları olmak üzere iki BFP çalışma modu tartışılır. Bu protokol, moleküler bağın ve hücrenin yay sabitlerini DFS ham verilerinden türetme üzerine odaklanır.

Bu çalışmada BFP bahar sabit analizinin protokolünü ortaya koyduk. Boncuk Hücresi analiz modu için, Prob boncuk üzerine kaplanmış glikosillenmiş protein THY-1 ile HedefK562hücresinde ifade edilen 5 β1 α integrin arasındaki moleküler bağın kmol'ını analiz ettik (Thy-1-integrin α5β1; Şekil 3A) 10. Khücresi ayrıca Boncuk Hücresi modundan (K562 Hücresi; <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy at JoVE.com

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

Biyomembran kuvvet probu (BFP), yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) tekniğidir. BFP, canlı hücreler üzerindeki moleküler etkileşimlerin yay sabitini ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, BFP tarafından tespit edilen moleküler bağlar için yay sabit analizi sunar.

Biyomembran Kuvvet Probu Spektroskopisi ile Moleküler Yay Sabit Analizi

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Bu videoda, moleküler yay sabitini ölçmek için Biyomembran Kuvvet Sondası veya BFP kullanmayla ilgili adım adım prosedürler açıklanmaktadır. Kuvvet probunda, BFP son zamanlarda doğal hücre yüzeyinde veya SITU Dinamik Kuvvet Spektroskopisi analizinde ortaya çıkmıştır. Bu tekniğin temel amacı tek molekül bağlayıcı genetiği ölçmektir.Bu veri analizi prosedürü basit ama güçlü bir mesajdır ve mekanik bilgiler, özellikle hücre zarını ifade eden moleküllerin dinamik kuvveti ve iltihabı sağlar. BFP deney döngüsü sırasında, kırmızı kan hücresi ve veraset ile prob mikrobiyom bahsi, hedef hücre ve prob ile hedef arasındaki ligand reseptör moleküler bağlanması bir dizi bağlı beyin sistemi olarak düşünülebilir. Hooke yasasına dayanarak, bir dizi bağlı yay sisteminin toplam yay sabitinin karşılığı, denklemin gösterdiği gibi, her bir bileşenin ters yay sabitinin toplamına eşittir.Kırmızı kan hücresinin yay sabiti, delikteki prob mikropipette radyaline bağlı olan olay hareketine göre hesaplanır. Kırmızı kan hücresi, kırmızı kan hücresi ile vasiyetname arasındaki dairesel temas alanı ve mikro pipet aspirasyon presi. BFP yol verileri, hedef mikro pipet hareketini bir PAs Translator tarafından kontrol eden ev yapımı bir sol görünüm sanal cihazı tarafından elde edilir.Tam bir PFP dokunma döngüsü beş aşamadan oluşur. Approach.Impinge.Contact. Geri çek ve ayrış. Başlangıçta, Robusto APICS konumunun X siyah deshine'de 0'a eşittir olarak belirtildiğini vurgular.Hedef daha sonra negatif veraset hareketine neden olmak için robusto'yu engellemek ve sıkıştırmak için bir parça veya çevirmen tarafından yönlendirilir. Kırmızı çizgi çizgisinde sıfırdan küçük X olarak not edersiniz. Geri çekme aşamasında, kırmızı busto apeksi X'ten sıfırdan küçük konuma geri döner ve X'e eşit olarak basınç fazı olarak adlandırılır.Ligand reseptör molekül kompleksi arasında bir bağ oluşursa, kırmızı kan hücresi diğer pozitif yönden daha farklı olacaktır. Sıfırdan büyük bu X dönemi, geri çekme aşamasının geri çekme aşaması olarak adlandırılır. Geri çekme aşaması, bağlanma molekülünün yay sabitini belirlemek için en kritik kısımdır.BSP veri toplama platformunu kullanarak zamana karşı zaman yol verilerini toplayın. Her deney genellikle 50 ila 200 dokunma döngüsü kaydeder, PFP veri analizi yazılımını açın. Sarı klasör simgesine tıklayın ve çift tıklayarak ilgili satır veri dosyasını seçin.Programa geldik. Ardından olaylar arasında geçiş yapmak için yukarı ve aşağı ok düğmelerine tıklayın. Geçersiz olayları taramak için aykırı dışlama ölçütlerini kullanma.Zaman biçimine zorlanan dışa aktarma veri türünü seçin ve uygun zaman aralığını seçin. Çizim verilerini dışa aktar düğmesine tıklayın. Verilen veriler varsayılan olarak metin dosyası olarak kaydedilir.Bu metin dosyası iki veri sütunu içeriyor. Zaman babalarını temsil eden ilk sütun ve her zaman noktasında karşılık gelen gücü temsil eden ikinci sütun. Zorla yer değiştirme eğrisini elde etmek için elektronik tablolar yazılımını kullanarak kuvvete karşı zaman eğrisini çizin.Her veri noktasının zaman değerini Willow Steel PSO hareketiyle çarpın. Her veri noktasından en küçük öteleme değerini çıkararak ilk veri noktasını sıfırla. Bu yatay dönüşüm sonraki bahar sabit hesaplamasını etkilemez.Kuvvet ve yer değiştirme eğrisinde, yeni kuvvet eğimi tanımlanabilirse iki farklı aktör grubu farklıydı. Her biri basınç fazını ve 10 stil fazını temsil eder. Her veri grubuna bir regresyon satırı sığdır.Daha dik eğimli hat, K1 olarak belirtilen bir kompresör fazındaki toplam yay sabitini temsil eder. Ve en küçük üst olan çizgi, bahsettiğim K2.As olarak belirtilen bu 10 stil aşamasındaki çizgiyi temsil eder, toplam yay sabiti, her bileşenin seri bahar sabitinin oğlunun karşılığıdır. Ritmin hücre moduna kompresif fazı sırasında moleküler yapıştırma gerilmez, bu nedenle moleküler bağlanma yay sabiti dikkate alınmaz. Hedef hücrenin yay sabiti, K1'in kompresör fazı sırasında toplam yay sabitini temsil ettiği görüntülenen denklem olarak tanımlanır.Satmak için ritmin 10 stil aşamasında, toplam yay sabiti kırmızı kan hücresi moleküler bağının ters yay sabitinin güneşidir. Ve hedef hücre, K2'nin toplam yay sabitini temsil ettiği molekül yapıştırma yay sabitini hesaplamak için görüntülenen denklemi kullanın. 10 durak aşamasını okudun.Beat to beat modunda, B deformasyonu ihmal edilebilir olduğundan, hedef hücre yay sabit yaklaşımının tersini tanımlayan terim sıfırdır, bu nedenle kompresör fazındaki toplam yay sabiti aşağıdaki denklem olarak gösterilen kırmızı kan hücresi yay sabitine eşdeğerdir. Gerilme fazında, moleküler bağlanmanın yay sabiti, aşağıdaki denklem olarak gösterilen kırmızı kan hücresinin etkisi çıkarılarak hesaplanabilir. Yan rüzgar bütünleştirici tutum B, Beta 3 kompleksi, K562 hücresi ve Febrifugine bütünleştirici tutum B Beta üç kompleksinin yay sabitlerini toplayın, newton veya nanometre ölçeğinde türetilmiş yay sabitlerinin ortalama ve standart sapması hesaplayın.Artık VFD verilerinden ölçüm ve yay sabiti gereksinimlerinin neler olduğunu daha iyi anlamanız gerekir. Beat to cell modu ile beat to beat modu arasındaki farklar fark edilmelidir. Farklı molekül sunum hizmeti, yay sabiti ölçüsünde farklı savunmalara sahip olacaktır.Sonuç olarak, bu adım adım prosedür, BFP kullanılarak moleküler yay sabit analizinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklar. BFP veri toplama ve DFS analizini tek bir bilgisayar dinlenme programına otomatikleştirmek ve entegre etmek için gelecekteki çabaların yapılacağını öngörüyoruz. Tüm BFP işlem veri analizini daha kullanıcı dostu ve yüksek hale getirir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...