Name: the automated crystallography pipelines at the embl htx facility in grenoble
Uploaded: 2021-06-05T14:30:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить совместную группу структурной биологии EMBL-ESRF (JSBG) за поддержку в использовании и эксплуатации макромолекулярных лучевых линий ESRF. Мы благодарны Мэтью Боулеру за поддержку в сборе данных на линии луча MASSIF-1 ESRF и Томасу Шнайдеру и команде EMBL Hamburg за отличную поддержку в сборе данных на P14 синхротрона PetraIII (DESY, Гамбург, Германия). Комбайн CrystalDirect разработан в сотрудничестве с командой приборов EMBL Grenoble. Этот проект был поддержан финансированием программы Европейского сообщества H2020 в рамках проектов iNEXT (грант No 653706) и iNEXT Discovery (грант No 871037), а также Région Auvergne-Rhône-Alpes через программу Booster.

ПРИМЕЧАНИЕ: Финансируемый доступ к этим трубопроводам для ученых во всем мире поддерживается через ряд программ финансирования. На момент написания этой рукописи заявки на доступ принимаются либо через программу iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), европейскую сеть объектов для стимулирования трансляционной структурной биологии20, финансируемую программой Horizon 2020 Европейской комиссии, либо INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Свяжитесь с соответствующим автором для получения текущих условий и маршрутов для финансируемого доступа в определенное время. Этот протокол описывает работу конвейера от белка до структуры и включает этапы, общие для всех наших конвейеров, в то время как особенности для двух других конвейеров обсуждаются в следующем разделе. Инструкции здесь относятся к CRIMS V4.0.
1. Лаборатория кристаллизации высокой пропускной способности
<ol><li>Перед началом работы попросите быть регистратором в лаборатории HTX через систему CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. Учетные данные пользователя обеспечивают удаленный доступ ко всем интерфейсам экспериментального проектирования и оценки.<ol>
<li>Войдите в CRIMS через веб-навигатор (поддерживаются Firefox, Chrome и Safari). Веб-сервер CRIMs шифруется, чтобы предотвратить доступ третьих лиц к данным во время их перемещения через Интернет. Оказавшись в CRIMS, серия меню слева от скрининга помогает управлять и создавать образцы, запрашивать эксперименты по кристаллизации, управлять и визуализировать пластины и т. Д. Серия видеоуроков доступна на сайте https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d. ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи, отправляя образцы курьером, должны зарегистрировать образцы и запрошенные эксперименты кристаллизации через CRIMS перед отправкой образца, чтобы гарантировать, что они могут быть обработаны без задержек по прибытии. Пожалуйста, отправьте детали отправления в htx@embl.fr.</li>
	</ol></li>
	<li>Войдите в CRIMS (https://htxlab.embl.fr) с помощью веб-браузера и нажмите на меню примеров. Откроется интерфейс с проектами и образцами средств управления.</li>
	<li>Нажмите кнопку «Новый образец» и предоставьте запрашиваемую информацию. CRIMS позволяет организовывать выборки под различные проекты, цели и конструкции. Назначьте образец существующим или создайте новые на этом этапе.</li>
	<li>После того, как запрошенная информация была введена, нажмите «Сохранить и сделать запрос». Выберите протокол кристаллизации, используемые кристаллизационные экраны, температуру инкубации и желаемую дату экспериментов.<ol>
<li>Используйте поля комментариев, чтобы предоставить сведения о образцах, которые важно знать операторам лаборатории HTX. Также можно выбрать пользовательские экраны (см. ниже). После отправки запроса на кристаллизацию он будет проверен командой лаборатории HTX и подтверждение о планировании экспериментов будет отправлено по электронной почте. Убедитесь, что выбраны даты эксперимента, совместимые со временем, необходимым для отправки образца.</li>
	</ol></li>
	<li>Как только образцы поступят на объект, операторы в лаборатории HTX проведут эксперименты по запросу. Как только эксперименты по кристаллизации будут настроены, подтверждение будет отправлено по электронной почте, а лотки кристаллизации будут переданы автоматизированным томоикроителям. CRIMS предоставляет доступ ко всем экспериментальным параметрам и автоматически отслеживает новые сеансы визуализации. Уведомления по электронной почте будут автоматически отправляться при наличии новых изображений. Эксперимент по оценке качества образцов на основе термофтора на основе30 образцов, основанный на протоколе, разработанном на объекте25,26, проводится с каждым образцом на этом этапе и будет доступен через CRIMS.</li>
	<li>Изображения экспериментов по кристаллизации вместе с результатами оценки качества образцов будут доступны в CRIMS вскоре после установки лотков кристаллизации. Нажмите на меню Термофтор и перейдите к образцу, чтобы увидеть результаты эксперимента по оценке качества образца.<ol>
<li>Нажмите на меню Пластины, чтобы увидеть изображения с пластин кристаллизации. Перейдите к образцу и щелкните Вид, чтобы увидеть последний сеанс обработки изображений, или символ + (развернуть), чтобы выбрать другой сеанс обработки изображений. Ряд инструментов помогает легко находить примеры и перемещаться по ним. Например, щелкнув поле проекта в верхней части экранов, образцы фильтров для этого проекта и функции поиска доступны для большинства столбцов таблицы.</li>
	</ol></li>
	<li>Используйте интерфейс представления пластин для оценки и оценки результатов экспериментов по кристаллизации. Он позволяет навигацию по различным скважинам кристаллизационных пластин, выбирать типы изображений (например, Vis, UV), выбирать разрешение изображения или записывать оценки, например. Этот интерфейс также предоставляет все экспериментальные параметры, используемые для экспериментов кристаллизации, включая состав кристаллизационных растворов.</li>
	<li>Нажмите на меню Уточнение, чтобы спроектировать экраны оптимизации кристаллов на основе основных условий попадания, определенных в ходе первоначального скрининга. Подменю «Химические вещества и стоковые решения» позволяет регистрировать и управлять кристаллизацией стоковых растворов. Подменю «Экраны» предоставляет доступ к интерфейсу для разработки собственных оптимизаций или пользовательских экранов.<ol>
<li>Выберите тип пластины, стандартные решения или конфигурации градиента, которые наилучшим образом соответствуют экспериментальному проекту. Можно попросить CRIMS вывести файл, непосредственно совместимый с formulator Robot (Formulatrix), чтобы автоматически пипетировать экраны в пластину или вывести печатный документ с томами для ручного управления.</li>
	</ol></li>
	<li>Выполните итерацию шагов 1.2-1.8 для проведения экспериментов по оптимизации кристаллов.</li>
	<li>После того, как кристаллы, подходящие для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей, будут идентифицированы, перейдите к интерфейсу просмотра пластины и выберите изображение, соответствующее правильному капле кристаллизации. Предварительно сохраненные оценки помогут вам сделать это легко.<ol>
<li>Нажмите либо на Crystal Harvesting, чтобы записать автоматический план сбора кристаллов для робота-комбайна CrystalDirect, либо на Ручной сбор для традиционного ручного монтажа кристаллов, если используется CRIMS на объекте, который не оснащен CrystalDirect. Оба интерфейса будут направлять пользователя через процесс сбора кристаллов. CRIMS автоматически записывает и сохраняет местоположение собранных кристаллов в SPINE или Unipucks21.</li>
	</ol></li>
	<li>Выберите меню Crystal Manager в CRIMS. Нажмите на подменю «Собранные кристаллы», чтобы осмотреть замороженные образцы. При использовании комбайна CrystalDirect представлены изображения процесса сбора урожая, в том числе изображения штифтов с собранными кристаллами.</li>
	<li>Выберите меню «Отгрузки», чтобы подключиться к синхротронам ESRF или Petra III и создать партии образцов для рентгеновского дифракционного анализа. Нажмите кнопку «Создать отправление» и выберите синхротрон, который вы хотите использовать, и номер сумки (пароль сумки на синхротроне необходим здесь). Следующая серия интерфейсов используется для выбора пуксов, которые будут включены в отгрузку. Система позволяет предоставлять комментарии для поддержки сбора данных и определения параметров сбора данных для автоматизированных линий луча, таких как MASSIF-1.</li>
	<li>Если сбор данных осуществляется в лаборатории ESRF или Petra III HTX, операторы будут передавать образцы на линию луча, сбор данных на других синхротронах будет осуществляться за счет пользователя. Сбор данных возможен путем перемещения к синхротрону, через дистанционное управление лучевой линией или на MASSIF-1. В последнем случае процесс сбора данных полностью автоматизирован. На синхротроне специальные интерфейсы в ISPyB29 позволяют пользователям восстанавливать информацию, отправленную CRIMS, и связывать с ней пики образцов, чтобы результаты сбора данных автоматически отслеживались. Для экспериментов, описанных здесь, сбор данных на синхротронах обычно осуществлялся с помощью программного обеспечения MXcube31, в то время как обработка данных и уточнение структуры осуществлялись с помощью atuoPROC32,Staraninso33,BUSTER33,Pipedream32,33 и Coot35.</li>
	<li>После проведения экспериментов по сбору данных CRIMS извлекает сводную информацию вместе с результатами первоначальной обработки данных на синхротроне из системы ISPyB29. Перейдите в меню CRIMS Crystal Manager и нажмите на подменю Crystal Diffraction Data. Вся информация и метаданные, касающиеся сбора данных о дифракции, имеются. Также можно загружать обработанные данные с синхротрона, а также необработанные дифракционные изображения. Просмотр нескольких коллекций данных или выбор определенных наборов данных. Примеры средств управления позволяют перемещаться и выбирать образцы для конкретных конструкций проектов. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот конвейер обеспечивает полностью автоматизированную работу через Интернет от чистого белка до результатов рентгеновской дифракции и может работать с одним или несколькими образцами одновременно. Он может быть применен к различным контекстам и типам проектов в структурной биологии.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+X-ray+crystallography.">Automation of X-ray crystallography.</a> Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).</li><li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+towards+effective+methods+in+exploiting+high-throughput+technologies+for+the+determination+of+human+protein+structures+of+high+biomedical+value.">First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).</li><li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+structural+biology+of+the+human+proteome.">Large-scale structural biology of the human proteome.</a> Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).</li><li>Rupp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TB+structural+genomics+consortium+crystallization+facility:+towards+automation+from+protein+to+electron+density.">The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Cusack, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+is+beautiful:+protein+micro-crystallography.">Small is beautiful: protein micro-crystallography.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).</li><li>McCarthy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ID30B+&#8211;+a+versatile+beamline+for+macromolecular+crystallography+experiments+at+the+ESRF.">ID30B &#8211; a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>von Stetten, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ID30A-3+(MASSIF-3)+&#8211;+a+beamline+for+macromolecular+crystallography+at+the+ESRF+with+a+small+intense+beam.">ID30A-3 (MASSIF-3) &#8211; a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).</li><li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+experiences+with+semi-autonomous+robotic+harvesting+of+protein+crystals.">First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).</li><li>Khajepour, M. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REACH:+Robotic+Equipment+for+Automated+Crystal+Harvesting+using+a+six-axis+robot+arm+and+a+micro-gripper.">REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).</li><li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).</li><li>Collins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle,+fast+and+effective+crystal+soaking+by+acoustic+dispensing.">Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing.</a> Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).</li><li>Deller, M. C., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+automated+protein+crystal+harvesting.">Approaches to automated protein crystal harvesting.</a> Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).</li><li>Cipriani, F., R&#246;wer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., M&#225;rquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).</li><li>M&#225;rquez, J. A., Cipriani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirectTM:+A+Novel+Approach+for+Automated+Crystal+Harvesting+Based+on+Photoablation+of+Thin+Films.">CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films.</a> Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li><li>Cianci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P13,+the+EMBL+macromolecular+crystallography+beamline+at+the+low-emittance+PETRA+III+ring+for+high-+and+low-energy+phasing+with+variable+beam+focusing.">P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li><li>iNEXT Consortium . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNEXT:+a+European+facility+network+to+stimulate+translational+structural+biology.">iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology.</a> FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).</li><li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography.">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li><li>Whittle, P. J., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Structure-Based+drug+design.">Protein Structure-Based drug design.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).</li><li>Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallography+for+lead+discovery+in+drug+design.">High-throughput crystallography for lead discovery in drug design.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).</li><li>Krojer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+XChemExplorer+graphical+workflow+tool+for+routine+or+large-scale+protein&#8211;ligand+structure+determination.">The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein&#8211;ligand structure determination.</a> Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).</li><li>Mariaule, V., Dupeux, F., M&#225;rquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Crystallization+Likelihood+Through+a+Fluorimetric+Thermal+Stability+Assay.">Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay.</a> Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).</li><li>Dupeux, F., R&#246;wer, M., Seroul, G., Blot, D., M&#225;rquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermal+stability+assay+can+help+to+estimate+the+crystallization+likelihood+of+biological+samples.">A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).</li><li>Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+crystallization+and+X-ray+data+collection+from+microcrystals+of+the+extracellular+domain+of+the+human+inhibitory+receptor+expressed+on+myeloid+cells+IREM-1.">Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1.</a> Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).</li><li>Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Ericsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE:+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Smart, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+structure+similarity+in+refinement:+automated+NCS+and+target-structure+restraints+in+BUSTER.">Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).</li><li>Bezerra, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+protease+uses+distinct+thermodynamic+signatures+for+substrate+recognition.">Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).</li><li>Bezerra, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+protease+uses+distinct+thermodynamic+signatures+for+substrate+recognition.">Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).</li><li>Martin-Malpartida, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+genome+wide+recognition+of+5-bp+GC+motifs+by+SMAD+transcription+factors.">Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors.</a> Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).</li><li>Arag&#243;n, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+distinct+roles+of+SMAD2+and+SMAD3+in+FOXH1+pioneer-directed+TGF-&#946;+signaling.">Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-&#946; signaling.</a> Genes &amp; Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).</li><li>M&#252;nzker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment&#8208;Based+Discovery+of+Non&#8208;bisphosphonate+Binders+of+Trypanosoma+brucei+Farnesyl+Pyrophosphate+Synthase.">Fragment&#8208;Based Discovery of Non&#8208;bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase.</a> ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).</li></ol>

JAM является соавтором патента на систему CrystalDirect

Автоматизированные кристаллографические конвейеры, описанные здесь, доступны исследователям по всему миру через различные программы финансирования. В настоящее время финансируемый доступ для экспериментов по кристаллизации и технологии CrystalDirect можно получить, обратившись к программе iNEXT Discovery и INSTRUCT-ERIC, в то время как доступ к макромолекулярным кристаллографическим лучевым линиям в ESRF поддерживается через программу доступа пользователей ESRF. Этот подход сводит к минимуму задержку между ростом кристаллов и измерением, ускоряя прогрессирование очень сложных проектов, требующих дифракционной оптимизации условий производства и кристаллизации белка, и освобождает ученых от сложных операций, связанных с кристаллизацией, обработкой кристаллов и работой с лучевой линией, делая кристаллографию более доступной для неэкспертных групп. Он также может быть использован для быстрого исследования кристаллизационных добавок, фазовых агентов или для скрининга соединений с помощью экспериментов по кокристаллизации. В то время как большинство проектов кристаллографии потенциально могут извлечь выгоду из этого подхода, для некоторых образцов могут потребоваться специальные протоколы, не поддающиеся автоматизации или представленным здесь трубопроводам, например, те, которые требуют микрофлюидных систем или узкоспециализированных устройств кристаллизации или образцов, которые являются чрезвычайно лабильными и не допускают транспортировки.
Технология CrystalDirect также позволяет автоматизировать замачивание кристаллов17 для характеристики комплексов малых молекул-мишеней. Для этого лазером создается небольшое отверстие перед процессом сбора урожая и сверху добавляется капля раствора, содержащего желаемые химические вещества (т.е. фазовые агенты или потенциальные лиганды), так что он вступает в контакт и диффундирует в кристаллизационный раствор, в конечном итоге достигая кристалла. Химические растворы могут быть сформулированы в воде, ДМСО или других органических растворителях. После определенного времени инкубации кристаллы могут быть собраны и проанализированы дифракционным путем, как описано выше. Этот подход был применен к быстрой характеристике лиганд-белковых комплексов в контексте структурно-ориентированного лекарственного дизайна, а также к крупномасштабному скринингу соединений и фрагментов. В последнем случае можно быстро проанализировать библиотеки фрагментов с сотнями и более чем тысячей фрагментов. Конкретные интерфейсы CRIMS, не представленные здесь, облегчают проектирование и автоматическое отслеживание экспериментов по замачинию кристаллов, в то время как интеграция между программным обеспечением CRIMS и пакетом программного обеспечения Pipedream, разработанным Global Phasing Ltd (Великобритания), позволяет автоматизировать обработку данных, фазирование, идентификацию лигандов и уточнение структуры сотен наборов данных параллельно, оптимизируя анализ и интерпретацию данных32,33 . Например, этот конвейер был недавно применен для идентификации фрагментов, связывающих как с активным сайтом, так и с несколькими аллостерическими участками Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase, ключевого фермента паразита, вызывающего африканский трипаносомоз человека.
Представленные здесь конвейеры могут способствовать ускорению темпов открытий в структурной биологии и сделать макромолекулярную кристаллографию более доступной для большего числа исследовательских групп. Кроме того, способствуя крупномасштабному скринингу соединений и фрагментов, они могут способствовать трансляционным исследованиям и ускорению процесса открытия лекарств, способствуя разработке более совершенных и безопасных лекарств против большего числа мишеней.

Автоматизация внедрена на всех этапах экспериментального процесса макромолекулярной кристаллографии, от кристаллизации до сбора и обработки дифракционных данных1,2,3,4,5,6,7,8,9,включая ряд технологий монтажа образцов10,11,12 ,13,14,15,16,17. Это не только ускорило темпы получения кристаллографических структур, но и способствовало упорядочению приложений, таких как структурно-управляемый дизайн лекарств18,19,20,21,22,23,24. В этой рукописи мы описываем некоторые аспекты автоматизированных кристаллографических конвейеров, доступных в лаборатории HTX в Гренобле, а также базовые технологии.
Лаборатория HTX в EMBL Grenoble является одним из крупнейших академических учреждений для скрининга кристаллизации в Европе. Он расположен в европейском кампусе фотонов и нейтронов (EPN) вместе с Европейской установкой синхротронного излучения (ESRF), которая производит некоторые из самых ярких рентгеновских лучей в мире, и Институтом Лауэ Ланжевена (ILL), который обеспечивает пучки нейтронов с высоким потоком. С момента начала работы в 2003 году лаборатория HTX оказала услуги более чем 800 ученым и обрабатывает более 1000 образцов в год. Лаборатория HTX уделяет большое внимание разработке новых методов в макромолекулярной кристаллографии, включая методы оценки образцов и контроля качества25,26 и технологию CrystalDirect, позволяющую полностью автоматизировать монтаж и обработку кристаллов15,16,17. Лаборатория HTX также разработала Систему управления кристаллографической информацией (CRIMS), веб-систему лабораторной информации, которая обеспечивает автоматизированную связь между средствами кристаллизации и сбора синхротронных данных, обеспечивая непрерывный поток информации в течение всего цикла выборки от чистого белка до дифракционных данных. Благодаря сочетанию мощностей установки HTX, технологии CrystalDirect и программного обеспечения CRIMS мы разработали полностью автоматизированные трубопроводы от белка к структуре, объединяющие кристаллизационное скрининг, оптимизацию кристаллов, автоматизированную обработку сбора кристаллов и криокооление и сбор рентгеновских данных на нескольких синхротронах в единый и непрерывный рабочий процесс, которым можно удаленно управлять через веб-браузер. Эти трубопроводы могут быть применены для поддержки быстрого определения новых структур, характеристик белково-лигандных комплексов и крупномасштабного скрининга соединений и фрагментов с помощью рентгеновской кристаллографии.
Лаборатория HTX оснащена необъемным кристаллизационным роботом (включая модуль LCP, который позволяет кристаллизировать как растворимые, так и мембранные белки), кристаллическими фермами (при 5 °C и 20 °C), двумя роботизированными станциями обработки жидкости для подготовки кристаллизационных экранов и двумя автоматизированными кристаллоуборочными комбайнами CrystalDirect с возможностью производства и хранения до 400 замороженных образцов штифтов за рабочий цикл. Ученые отправляют свои образцы на объект экспресс-курьером, которые затем обрабатываются специальными техниками в лаборатории HTX. Ученые могут удаленно проектировать эксперименты по скринингу кристаллизации и оптимизации через веб-интерфейс, предоставляемый системой CRIMS. Благодаря этому интерфейсу они могут выбирать из широкого спектра параметров и экспериментальных протоколов, доступных на объекте, в соответствии с их конкретными требованиями к образцам. Результаты вместе со всеми экспериментальными параметрами предоставляются пользователям в режиме реального времени через CRIMS. Все полученные образцы анализируются с помощью специально разработанного метода, позволяя оценить вероятность кристаллизации образца25,26,27. На основе результатов этого анализа пользователям даются конкретные рекомендации относительно оптимальной температуры инкубации и возможных экспериментов по оптимизации образцов. Как только эксперименты по кристаллизации установлены, ученый может оценить результаты, глядя на изображения кристаллизации, собранные в разные моменты времени через Интернет. Когда кристаллы, подходящие для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей, идентифицированы, ученые могут использовать специальный интерфейс для создания плана монтажа кристаллов, который затем будет выполнен роботом CrystalDirect.
Технология CrystalDirect основана на использовании модифицированной микропластины кристаллизации паровой диффузии и лазерного луча для монтажа криоохладимых кристаллических образцов в дифракционно-совместимые средства, закрывающие зазор автоматизации, существующий между кристаллизацией и сбором данных15,16,17. Вкратце, кристаллы выращиваются в модифицированной пародиффузионной пластине, микропластине CrystalDirect. Как только появляются кристаллы, робот для сбора данных CrystalDirect автоматически применяет лазерный луч, чтобы иссечь кусок пленки, содержащий кристалл, прикрепить его к стандартному штифту сбора дифракционных данных и криохлаждать его в потоке газообразного азота (см. Zander et al. 2016 и https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). Эта технология имеет ряд дополнительных преимуществ по сравнению с ручными или полуавтоматическими протоколами монтажа кристаллов. Например, размер и форма кристаллов не являются проблемой, что делает одинаково легким сбор крупных кристаллов или микрокристаллов, часто можно избежать использования криопротекторов, из-за особого способа, которым работает технология (см. ссылку 17, Zander et al.), что делает рентгеновский дифракционный анализ гораздо более простым. Лазерный луч также может быть использован в качестве хирургического инструмента для отбора лучших частей образца, когда кристаллы растут на кластерах или показывают эпитаксиальный рост, например. Технология CrystalDirect также может быть использована для автоматизированных экспериментов по замачивания17. Доставка растворов с малыми молекулами или другими химическими веществами к кристаллам. Таким образом, это позволяет поддерживать полностью автоматизированный, крупномасштабный скрининг соединений и фрагментов. После того, как кристаллы собраны и криокоолены роботом CrystalDirect, они передаются либо в SPINE, либо в Unipuck шайбы, которые совместимы с большинством синхронных макромолекулярных кристаллографических лучей по всему миру. Система может собирать до 400 штифтов (емкость криогенного хранилища Дьюара) полностью автономным образом. CRIMS взаимодействует с роботом-харвестером во время процесса и обеспечивает автоматическое отслеживание образцов кристаллов (шайб и штифтов). Шайбы маркируются как штрих-кодами, так и RFID-метками для облегчения управления образцами21,28.
CRIMS предоставляет интерфейс прикладной программы (API), поддерживающий автоматизированную связь с системой ISPyB, поддерживающей управление сбором и обработку рентгеновских данных на многих синхротронах в Европе и мире29. После завершения автоматизированного сбора кристаллов ученые могут отбирать образцы кристаллов (шайбы) и создавать партии образцов для макромолекулярных кристаллографических лучевых линий на синхротронах ESRF (Гренобль, Франция)7,8,9 или Петра III (Гамбург, Германия)18,19. CRIMS передают данные, соответствующие выбранным образцам лучевой линии, в синхротронную информационную систему вместе с предварительно выбранными параметрами сбора данных. Как только образцы поступают на выбранную линию синхротронного пучка, сбор рентгеновских данных осуществляется либо вручную, либо с помощью дистанционного управления лучевой линией, либо полностью автоматизированным способом (т.е. на линии пучка MASSIF-1 ESRF8, управляемой совместной объединенной группой структурной биологии EMBL ESRF (JSBG)). После сбора данных CRIMS автоматически извлекает информацию о результатах сбора данных вместе с исходными результатами обработки данных, осуществляемой системами синхротронной обработки данных, и представляет ее ученому через удобный пользовательский интерфейс.
Лаборатория HTX применяет эти автоматизированные конвейеры для поддержки трех различных применений: быстрого определения новых структур, быстрой характеристики белково-лигандных комплексов и крупномасштабного скрининга соединений и фрагментов. Ниже мы опишем, как их использовать и эксплуатировать.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CrystalDirect harvester</td>
			<td>Arinax</td>
			<td></td>
			<td>Automated crystal mounting and cryocooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalDirect Crystallization plate</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>SKU: M-XDIR-96-2</td>
			<td>96-well crytsallization microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator 16</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>For the autoamted preparation of crystallization screens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito crystallization Robot</td>
			<td>SPT Labtech</td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of crystallization experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Evo Liquid handling station</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of crystallization solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spine Pucks</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>SKU: M-SP-SC3-1</td>
			<td>SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniPucks</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>SKU: M-CP-111-021</td>
			<td>Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the automated crystallography pipelines at the embl htx facility in grenoble

EMBL Grenoble управляет Лабораторией кристаллизации высокой пропускной способности (HTX Lab), крупномасштабным пользовательским объектом, предлагающим высокопроизводительный кристаллографический сервис для пользователей по всему миру. Лаборатория HTX уделяет большое внимание разработке новых методов в макромолекулярной кристаллографии. Благодаря сочетанию высокопроизводительной платформы кристаллизации, технологии CrystalDirect для полностью автоматизированного монтажа и криокоирования кристаллов и программного обеспечения CRIMS мы разработали полностью автоматизированные трубопроводы для макромолекулярной кристаллографии, которые могут удаленно управляться через Интернет. К ним относятся конвейер «белок-структура» для определения новых структур, конвейер для быстрой характеристики белково-лигандных комплексов в поддержку медицинской химии и крупномасштабный автоматизированный конвейер скрининга фрагментов, позволяющий оценить библиотеки из более чем 1000 фрагментов. Здесь мы расскажем, как получить доступ к этим ресурсам и использовать их.

Автоматизированный кристаллографический конвейер, описанный выше, был применен для поддержки большого количества внутренних и внешних проектов с замечательным успехом. Несколько основных моментов включают проект Джиновича-Каруго и сотрудников из Лаборатории Макса Перуца (Вена), сосредоточенный на структурном и функциональном анализе дипептидилпептидазы, необходимой для роста бактериального патогена. Быстрая последовательность циклов скрининга кристаллизации, дифракционной оценки, оптимизации кристаллов и сбора рентгеновских данных (до 8 итераций для данного проекта) позволила всего за несколько недель получить структурные модели для трех различных конформационных состояний белка, что обеспечило ключевое механистическое понимание функции этого класса белков36 (см. Рисунок 1).
Другим примером является Масиас и его коллеги из Института биомедицинских исследований (IRB, Барселона), которые объединили инструменты биоинформатики и структурные подходы для выявления новых мотивов связывания ДНК для факторов транскрипции SMAD3 и SMAD4, участвующих в регуляции судьбы клеток. Эта работа произвела 6 структур высокого разрешения SMAD3 и 4 в комплексе с различными мотивами связывания ДНК37,38, раскрывая до сих пор неподозрительную способность этих факторов транскрипции распознавать и связываться с разнообразным массивом последовательностей ДНК, что является ключевым для интерпретации их функции в различных биологических контекстах. Эти технологии также применялись для поддержки собственных исследований в контексте проектов по разработке лекарств от исследовательских групп в фармацевтических и биотехнологических компаниях. Например, благодаря быстроте, которую вносят эти конвейеры, структурный анализ нескольких лиганд-целевых комплексов может быть достигнут в течение нескольких дней, что имеет большое значение для поддержки последовательных раундов оптимизации медицинской химии в контексте разработки лекарств. Наконец, мы также применили эту инфраструктуру для крупномасштабного рентгеновского скрининга фрагментов39.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62491/62491fig01.jpg"> Рисунок 1:Автоматизированный кристаллографический конвейер. Интегрированная работа лаборатории EMBL HTX, включая технологию CrystalDirect и программное обеспечение CRIMS с лучевой линией MASSIF-1 на ESRF и автоматизированной связью между программным обеспечением CRIMS и ISPyB, позволяет поддерживать полностью автоматизированный, дистанционно управляемый трубопровод белка в структуру, объединяющий скрининг и оптимизацию кристаллизации, автоматизированный сбор кристаллов и криоохлаждение и автоматизированный сбор и обработку данных. Структурные модели соответствуют трем различным конформационным состояниям протеазы из патогенной бактерии, идентифицированной в рекордно короткие сроки путем применения этих трубопроводов36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62491/62491fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble at JoVE.com

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

Здесь мы описываем, как использовать автоматизированные макромолекулярные кристаллографические конвейеры для анализа белково-структурного, быстрого анализа лиганд-белкового комплекса и крупномасштабного скрининга фрагментов на основе технологии CrystalDirect в лаборатории HTX в EMBL Гренобле.

Автоматизированные кристаллографические трубопроводы на заводе EMBL HTX в Гренобле

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

Лаборатория HTX предлагает онлайн-доступ к полностью автоматизированным белковым структурированным трубопроводам, которые могут быть применены для решения новых структур и для проведения более масштабного скрининга фрагментов и легана. Благодаря сочетанию технологии CrystalDirect для автоматизированного сбора кристаллов и охлаждения CRI на программном обеспечении CRIM, где ученые могут контролировать весь процесс кристаллографии через Интернет. Начните с открытия и входа в систему управления графической информацией Crystal в веб-браузере и щелкните меню Примеры, чтобы открыть интерфейс с проектом в средствах управления образцами.Щелкните Новый образец и в окне примера введите запрашиваемую информацию и нажмите кнопку Сохранить и сделать запрос. На панели запросов выберите протокол кристаллизации, температуру инкубации, используемые кристаллизационные экраны и желаемую дату экспериментов, которая должна быть совместима со временем, необходимым для отгрузки образца. Используйте поля комментариев, чтобы предоставить сведения о образцах, которые важно знать операторам лаборатории HDX.После отправки запрос на кристаллизацию будет проверен командой лаборатории кристаллизации высокой пропускной способности. Подтверждение о планировании эксперимента будет отправлено по электронной почте. По прибытии образца на объект.Персонал лаборатории настроит эксперимент, отправит подтверждение настройки по электронной почте и передаст кристаллизационные лотки автоматизированным тепловизоприятелям. CRIMS обеспечит доступ ко всем экспериментальным параметрам и будет отслеживать новые сеансы визуализации в режиме реального времени. Когда новые изображения будут доступны, уведомления по электронной почте будут отправляться автоматически.Чтобы просмотреть изображения с пластин кристаллизации, откройте меню «Пластины» и перейдите к образцу. Щелкните Вид, чтобы просмотреть последний сеанс обработки изображений, или щелкните символ разворачивать, чтобы выбрать другой сеанс обработки изображений и проверить журнал перетаскивания. Фильтрация образцов для выбранного проекта.Нажмите на поле конкретного проекта. Функции поиска также доступны для большинства столбцов таблицы. Чтобы оценить и оценить результаты экспериментов по кристаллизации, выберите интерфейс представления пластин и переместитесь по различным стенкам кристаллизационных пластин.Выберите тип изображения и выберите качество изображения или запишите оценки. Интерфейс представления также предоставляет все экспериментальные параметры, используемые для экспериментов кристаллизации, включая состав кристаллизационного раствора. Чтобы спроектировать экраны оптимизации кристаллов на основе основных условий попадания, определенных в ходе первоначального скрининга, откройте меню «Уточнение» и выберите подменю «Экраны».Выберите тип пластины, стандартные решения или конфигурации градиента, которые наилучшим образом соответствуют экспериментальному проекту. Можно попросить CRIMS вывести файл, непосредственно совместимый с формуляром-роботом formulatrix, чтобы автоматически пипетировать экраны в пластину или вывести печатный документ, но тома для ручного управления. После того, как кристалл подходит для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей, перейдите к интерфейсу просмотра пластин и используйте предварительно сохраненные баллы для выбора изображения, соответствующего правильному падению кристаллизации.Нажмите «Сбор кристаллов», чтобы записать автоматический план сбора кристаллов с помощью робота прямого сбора кристаллов. CRIMS автоматически записывает и сохраняет местоположение собранных кристаллов в позвоночнике или единицах шайбы. Далее операторы нашего объекта снимут пластины с планами уборки с тепловизоров и передадут их роботу CrystalDirect.После завершения сбора кристаллов шайбы, содержащие образцы, помещаются в CX 100 Dewar или передаются на синхротрон по вашему выбору. Чтобы проверить криоохлажденные образцы, откройте меню Crystal Manager и выберите Собранные кристаллы. Там будут доступны изображения процесса сбора урожая, в том числе изображения штифтов с собранными кристаллами.Чтобы создать образцы отправлений для рентгеновского дифракционного анализа, откройте меню «Отправления» и нажмите «Создать отправление», чтобы выбрать интересующий синхротрон и номер сумки. Также могут быть введены комментарии для поддержки сбора данных, а также предопределенные параметры для сбора данных на полностью автоматизированных линиях луча. Лаборатория HDX также предоставляет доступ к полностью автоматизированному крупномасштабному скринингу фрагментов.Ресурсы CRIMS для автоматизированной обработки данных и идентификации попаданий на основе глобального программного обеспечения для поэтапной реализации Pipeline Pipe Dream позволяют быстро оценивать и расставлять приоритеты результатов по сотням и тысячам наборов данных в одном проекте. CRIMS взаимодействует с системами управления информацией Синхротронов и извлекает информацию о фактических дифракционных экспериментах. Откройте меню Crystal Manager и выберите данные дифракции кристаллов для просмотра сводной информации и результатов первоначальной обработки данных на синхротроне.В этом репрезентативном анализе автоматизированные кристаллографические конвейеры использовались, как показано, для структурной идентификации различных белков. Как было замечено, три различных подтверждающих состояния протеазы из патогенной бактерии были идентифицированы за очень короткое время, благодаря быстрой последовательности оптимизации скрининга кристаллов и дифракционных измерений. Этот конвейер также недавно был применен для идентификации фрагментов, связывающих оба с активными в нескольких аластерических участках Trypanosoma brucei.Фарнезилпирофосфатсинтаза является ключевым ферментом паразита, вызывающим африканский трипаносомоз человека. Этот процесс сводит к минимуму задержку между ростом кристаллов и измерением, ускоряя прогресс. Это также освобождает ученых от сложных операций, таких как обработка кристаллов и работа с лучевой линией, делая кристаллографию более доступной для неспециалистов.Этот подход может способствовать трансляционным исследованиям, а затем ускорить процесс открытия лекарств. Содействие разработке более совершенных и безопасных лекарств против большего числа мишеней.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Автоматизированные протоколы для высокомолекулярных кристаллизации в MRC лаборатории молекулярной биологии

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Подготовка хлоропласта суб отсеков от Arabidopsis для анализа белка локализации Immunoblotting или протеомики

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...