Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المحقق الجديد لصندوق كونوت إلى S.P.، المؤسسة الكندية للابتكار، برنامج منحة اكتشاف NSERC (المنح RGPIN-2015-05114 وRGPIN-2020-05881)، جامعة مانشستر وجامعة تورنتو صندوق البحوث المشتركة، وجامعة تورونتو XSeed البرنامج. وقد تم دعم C.T. من قبل زمالة NSERC USRA.

1. معالجة ما قبل المعالجة في الغطاء
<ol><li>إعداد صرير نظيفة coverlips كما هو موضح في واترمان ستورر، 199825.</li>
	<li>إعداد 1٪ (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) الحل واحتضان الأغطية في الحل لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف. تأكد من أن الأغطية تتحرك بحرية في الحل.</li>
	<li>يغسل الأغطية مرتين مع DH2O لمدة 5 دقا?...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

تظهر النتائج أعلاه أن بروتوكول التجزئ المصغر بمساعدة IR الموصوف بالليزر (microphotopatterning) يوفر أنماطا قابلة للاستنساخ من مختلف الأشكال التي تمكن من التلاعب في شكل الخلية والهندسة الهيكلية الخلوية. على الرغم من أن العديد من أساليب micropatterning قد وضعت قبل وبعد ظهورها لأول مرة من microphotopatterning، هذه الط?...

شكل الخلية هو المحدد الرئيسي للعمليات البيولوجية الأساسية مثل مورفوجينيسيس الأنسجة1، هجرة الخلايا2، انتشار الخلايا3، والتعبير الجيني4. التغيرات في شكل الخلية مدفوعة بتوازن معقد بين إعادة الترتيب الديناميكي للهيكل الخلوي الذي يشوه غشاء البلازما والعوامل الخارجية مثل القوى الخارجية التي تمارس على الخلية وهندسة الالتصاقات الخلوية ومصفوفة الخلية5. ترحيل الخلايا mesenchymal، على سبيل المثال، بلمرة شبكة أكتين كثيفة في الحافة الرائدة التي تدفع غشاء البلازما إلى الأمام ويخلق lamellipodia واسعة6،في حين actomyosin انكماش يتراجع حافة الخلية زائدة ضيقة لفصل الخلية من وضعها الحالي7،8. تعطيل الأحداث الإشارات التي تؤدي إلى مثل هذه الهياكل الهيكلية الخلوية المتخصصة الاضطرابات الشكل والقطبية ويبطئ هجرة الخلايا9. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب الانحناء الظهاري للصفائح أثناء الاختراق انقباضا apical قائما على الأكتوميوسين الذي يتسبب في أن تصبح الخلايا وجيرانها على شكل إسفين10. على الرغم من أن هذه الدراسات تسلط الضوء على أهمية شكل الخلية، إلا أن التغايرية المتأصلة في شكل الخلية قد قيدت الجهود الرامية إلى تحديد الآليات التي تربط مورفولوجيا بالعمل.
وتحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير العديد من النهج للتلاعب بشكل الخلية على مدى العقود الثلاثة الماضية. هذه النهج تحقيق هدفهم إما عن طريق تقييد الخلية مع قالب ثلاثي الأبعاد أو السيطرة على هندسة الالتصاق الخلوي من خلال ترسب منقوشة من البروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) على سطح مضاد للضروب، وهي تقنية يطلق عليها micropatterning11. هنا سوف نستعرض عددا من التقنيات التي اكتسبت شعبية على مر السنين.
رائدة أصلا كنهج لتطبيقات الإلكترونيات الدقيقة، لينة الطباعة microcontact الطباعة المطبوعة الحجرية على أساس أصبح بشكل لا لبس فيه عبادة المفضلة12. يتم تصنيع رقاقة رئيسية لأول مرة من خلال تعريض مناطق من ركيزة السيليكون المغلفة بطبقة مضادة للريضة الضوئية بشكل انتقائي ، تاركة وراءها سطحا منقوشا13. ثم يتم سكب الاستومر ، مثل PDMS ، على الرقاقة الرئيسية لتوليد "ختم" ناعم ينقل بروتينات ECM إلى الركيزة المطلوبة11،14. مرة واحدة ملفقة، ويمكن استخدام رقاقة رئيسية ليلقي العديد من الطوابع PDMS التي تؤدي إلى micropatterns استنساخها للغاية12. ومع ذلك، لا يمكن تعديل الأنماط بسهولة بسبب عملية التصوير الضوئي الطويلة. تتطلب هذه العملية أيضا معدات عالية التخصص وغرف تنظيف لا تتوفر عادة في أقسام البيولوجيا.
وفي الآونة الأخيرة، أبلغ عن الطباعة المباشرة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية العميقة للتحايل على القيود التي تفرضها النهج التقليدية القائمة على الطباعة الحجرية. يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية العميق من خلال قناع ضوئي إلى مناطق انتقائيةمن غطاء زجاجي مغلف ببولي-L-lysine-المطعم-البولي إيثيلين غليكول. المجموعات الكيميائية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية العميقة يتم تحويلها ضوئيا دون استخدام وصلات حساسة للضوء لتمكين ربط بروتينات ECM15. عدم وجود وصلات حساسة للضوء تمكن coverlips منقوشة لتبقى مستقرة في درجة حرارة الغرفة لأكثر من سبعة أشهر15. وتتجنب هذه الطريقة استخدام غرف التنظيف ومعدات التصوير الضوئي وتتطلب تدريبا أقل تخصصا. ومع ذلك، فإن الحاجة إلى الكتل الضوئية لا تزال تشكل عقبة كبيرة أمام التجارب التي تتطلب تغييرات متاحة بسهولة في الأنماط.
بالإضافة إلى الأساليب التي تعالج هندسة الخلايا من خلال الترسب المراقب لبروتينات ECM على سطح 2D ، تسعى أخرى إلى التحكم في شكل الخلية عن طريق حصر الخلايا في الهياكل الدقيقة ثلاثية الأبعاد. وقد تكيفت العديد من الدراسات النهج اللين القائم على الطباعة الحجرية المذكورة أعلاه لتوليد 3D، بدلا من 2D، غرف PDMS للتحقيق في العمليات البيولوجية التي تعتمد على الشكل في الأجنة والبكتيريا والخميرة والنباتات16و17و18و19. وقد اتخذت البلمرة اثنين الفوتون (2PP) أيضا زمام المبادرة كبقنية microfabrication التي يمكن أن تخلق معقدة 3D هيدروجيل السقالات مع قرار نانومتر20. يعتمد 2PP على مبادئ الامتزاز ثنائي الفوتون ، حيث يتم امتصاص فوتونين يتم تسليمهما في نبضات femtosecond في وقت واحد بواسطة جزيء - فوتونيتيتور في هذه الحالة - يمكن من البلمرة المحلية للبوليمرات الضوئية21. وقد استخدمت هذه التقنية بشكل كبير لطباعة السقالات 3D التي تحاكي هياكل ECM الأصلية من الأنسجة البشرية، وقد ثبت للحث على الضرر الضوئي منخفضة للخلايا22.
أعطى ظهور microphotopatterning لأول مرة قبل 10 سنوات الباحثين الفرصة لتصنيع الأجهزة الدقيقة مع تجنب المعدات المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها. Microphotopatterning يخلق أنماط على مقياس ميكرون عن طريق إزالة المناطق الانتقائية حراريا من الكحول بولي الفينيل (PVA) المغلفة على الأسطح الزجاجية المنشطة باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء23،24. بروتينات ECM التي تعلق فقط سطح الزجاج الأساسي وليس PVA ثم بمثابة إشارات بيوكيميائية لتمكين ديناميات الانتشار التي تسيطر عليها وشكل الخلية. كما توفر هذه الطريقة مرونة فائقة حيث يمكن تغيير الأنماط بسهولة في الوقت الحقيقي. هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من microphotopatterning باستخدام نظام التصوير متعدد الفوتونات التجارية. تم تصميم البروتوكول الموصوف للتصنيع السريع والآلي للأنماط الكبيرة. لقد أثبتنا أن هذه الأنماط تتحكم بكفاءة في شكل الخلية من خلال تقييد هندسة الالتصاقات بين الخلية و ECM. وأخيرا، فإننا نثبت أن تقنية النقش الموصوفة تعدل تنظيم وديناميات الهيكل الخلوي actin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

Micropatterning هو تقنية راسخة في مجتمع بيولوجيا الخلايا المستخدمة لدراسة الاتصالات بين مورفولوجيا ووظيفة المقصورات الخلوية مع التحايل على المضاعفات الناشئة عن الاختلافات الطبيعية من خلية إلى خلية. لتوحيد شكل الخلية، تقتصر الخلايا إما في قوالب ثلاثية الأبعاد أو يتم التحكم فيها للهندسة اللاصقة من خلال الجزر اللاصقة. ومع ذلك، تعتمد تقنيات التجهم المجهري التقليدية القائمة على التصوير الضوئي وحفر الأشعة فوق البنفسجية العميقة بشكل كبير على الغرف النظيفة أو المعدات المتخصصة. هنا نقدم تقنية micropatterning بمساعدة الليزر بالأشعة تحت الحمراء (microphotopatterning) المعدلة من دويل وآخرون التي يمكن إعدادها بشكل ملائم مع أنظمة التصوير المتاحة تجاريا. في هذا البروتوكول، نستخدم نظام تصوير نيكون A1R MP+ لتوليد أجهزة مجهرية بدقة ميكرون من خلال ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) الذي يهيج المناطق المحددة مسبقا على الأغطية المغلفة بالكحول متعدد الفينيل. نحن نستخدم سيناريو مخصص لتمكين تصنيع نمط الآلي مع كفاءة عالية ودقة في أنظمة غير مجهزة التركيز البؤري التلقائي الأجهزة. نظهر أن هذا الليزر الأشعة تحت الحمراء بمساعدة micropatterning (microphotopatterning) يؤدي البروتوكول في أنماط محددة التي تعلق الخلايا حصرا وتأخذ على الشكل المطلوب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون متوسط البيانات من عدد كبير من الخلايا بسبب توحيد شكل الخلية. يمكن استخدام الأنماط الناتجة عن هذا البروتوكول ، إلى جانب التصوير عالي الدقة والتحليل الكمي ، لشاشات الإنتاجية العالية نسبيا لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين يتوسطون في الصلة بين الشكل والوظيفة.

وتعتمد جودة البيانات التجريبية التي يتم الحصول عليها من خلال الترنيم الدقيق إلى حد كبير على جودة الأنماط. لتحديد نوعية الأنماط المتولدة مع الطريقة المذكورة أعلاه ، استخدمنا أولا المجهر العاكس لتقييم شكل وحجم المناطق المائلة للصور من الغطاء. وجدنا أن كل نمط فردي يشبه إلى حد كبير قناع الاس?...

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

البروتوكول المعروض هنا يمكن التصنيع الآلي للخلايا الدقيقة التي توحد شكل الخلية لدراسة الهياكل الخلوية داخل خلايا الثدييات. ويمكن إنشاء هذه التقنية سهلة الاستخدام باستخدام نظم التصوير المتاحة تجاريا ولا تتطلب معدات متخصصة لا يمكن الوصول إليها في مختبرات بيولوجيا الخلايا القياسية.

السيطرة على هندسة الخلية من خلال الأشعة تحت الحمراء الليزر بمساعدة Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Micropatterning هو تقنية قوية يستخدمها العلماء لفهم الاتصالات بين شكل الخلية ونشاط الآلات بين الخلايا. على الرغم من أن العديد من التقنيات تسمح للباحثين لتعديل شكل الخلية، فإن هذه التقنيات تتطلب في كثير من الأحيان معدات متخصصة لا يمكن الوصول إليها من قبل بعض مختبرات البيولوجيا. هذا الفيديو سوف يرشدك من خلال الخطوات اللازمة لأتمتة micropatterning على نظام التصوير متعددة الفوتون المتاحة تجاريا.وإحدى مزايا هذا البروتوكول هي أنه يتجنب استخدام المعدات المتخصصة. يمكن أيضا تغيير الأنماط بسهولة دون إعادة تصنيع الكتل الضوئية ، والتي عادة ما تكون العملية الأكثر استهلاكا للوقت في micropatterning. لدينا أداة معالجة الصور يولد متوسط الصور الخلية التي تعكس توزيع تمثيلي للبروتينات بطريقة غير منحازة والآلية.على الرغم من أننا نستخدم الأغطية في تجاربنا ، إلا أن سير العمل الآلي يسمح لك أيضا بالنمط على الشرائح والأطباق ذات القاع الزجاجي. العرض البصري لهذه الطريقة مهم لأن إعداد المجهر المناسب أمر بالغ الأهمية للنظام لتصوير وتحديد المستوى البؤري الصحيح والنمط بطريقة آلية. إعداد حل PVA حسب التعليمات.إضافة جزء واحد HCL إلى ثمانية أجزاء PVA. عكس الأنبوب بعناية عدة مرات لخلط. صب اثنين من ملليلتر من الحل في طبق بيتري صغيرة وغمر غطاء نظيفة المعالجة مسبقا في السائل.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على شاكر. إزالة غطاء بعناية من الحل. استخدام الدوار coverslip لتدور معطف لمدة 40 ثانية.في هذه الأثناء، نظف الملاقط. نقل غطاء إلى مربع والجافة في أربع درجات بين عشية وضحاها. قم بتشغيل برنامج المجهر.أولا، تعيين خط الليزر إلى 750 نانومتر. ثم قم بإعداد تكوين بصري جديد يسمى ، صورة. هذا هو التكوين البصري الأساسي الذي يسمح لنا بتصوير الغطاء من خلال عاكسات.اترك خيارات أخرى كخيار افتراضي وحدد الهدف المناسب. تكوين إعدادات الأجهزة ضمن هذا التكوين البصري. تعيين الليزر الأشعة تحت الحمراء كما لدينا ليزر التحفيز.ضع مقسم الشعاع في مسار الضوء لاستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء للتصوير. حدد وحدة الماسح الضوئي غالفانو وكاشف المسح الضوئي D المناسبة. حدد حجم المسح الضوئي ووقت الإسهاب الكافي لالتقاط الميزات الصغيرة على غطاء الغطاء.تأكد من تحديد المربع استخدام الليزر الأشعة تحت الحمراء. ضبط قوة الليزر اكتساب وحساسية كاشف للحصول على صورة مشرقة، ولكن ليس المشبعة، من سطح coverlip. في إطار منطقة المسح الضوئي، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى واحد لالتقاط حقل العرض بأكمله.حفظ التكوين البصري. الآن سنقوم بإعداد سلسلة من التكوينات البصرية التي من شأنها أن تسمح للمجهر للتركيز، وتحميل قناع عائد الاستثمار وتوليد أنماط بطريقة آلية. التكوين البصري الأول يسمح لنا لطباعة علامة ائتمانية تستخدم للتركيز التلقائي على مجال الرؤية الحالي.تكرار التكوين البصري للصورة وإعادة تسميتها، طباعة علامة ائتمانية. بما أننا نطبع في هذه الخطوة، حرك مقسم الحزمة من مسار الضوء واستبدله بمرآة ديكهروية مناسبة. حدد أصغر حجم مسح لتوفير الوقت.نظرا لهذه الخطوة، لا يلزم التصوير، قم بتعيين حساسية الكاشف إلى الصفر. زيادة طاقة الليزر لتمكين الطباعة. في إطار منطقة المسح الضوئي، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى أقصى حد ووضع منطقة المسح في منتصف حقل العرض.الآن سنقوم بإعداد تجربة Z-كومة لحساب أي تفاوت في سطح PVA. تعيين الحركة في الموضع Z إلى النسبي. حدد الجهاز Z المناسب.بعد ذلك، كرر التكوين البصري للصورة وإعادة تسميتها، التركيز التلقائي. حدد أصغر حجم مسح ضوئي واختف عامل التكبير/التصغير في إطار منطقة المسح الضوئي بحيث يكون مجال الرؤية أكبر قليلا من علامة الالتصاط. وهذا يضمن أن الميزات الصغيرة الأخرى على غطاء لن تتداخل مع التركيز التلقائي.في القائمة الأجهزة، حدد إعداد التركيز التلقائي. تعيين سمك المسح الضوئي إلى ذلك في تجربة Z-المكدس. المجهر سوف تفحص من خلال هذا النطاق والعثور على أفضل طائرة محورية باستخدام علامة ائتمانية.بعد ذلك، قم بتكرار التكوين البصري للصورة وإعادة تسميته، تحميل عائد الاستثمار. تعيين حجم المسح الضوئي مطابقة لتلك التي قناع ROI لأنه سيتم تحميل القناع على صورة مأخوذة مع هذا التكوين البصري. استخدمنا 2048 بكسل لتحقيق التوازن الأمثل بين الدقة والسرعة.الآن سنقوم بإعداد التكوين البصري المستخدمة لنمط coverlip. تكرار الطباعة التهيئة البصرية علامة ائتمانية وإعادة تسميته، Micropattern. تعيين عامل التكبير/التصغير إلى واحد.زيادة قوة الليزر التحفيز ل ablate PVA. حدد سرعة مسح مناسبة. في إطار التحفيز ND، إعداد تجربة التحفيز ND.إضافة بضع مراحل إلى الجدول الزمني وتعيين كل في التحفيز. تأكد من صحة منطقة التحفيز ومدته. في نفس النافذة، قم بتمكين المرحلة من نقل الدالة Z الرئيسية قبل كل مرحلة.وهذا يمثل مرة أخرى أي انحرافات في اتجاه Z. وأخيرا، قم بإعداد تكوين بصري لإنشاء ملصق مرئي على غطاء الغطاء يمكن أن يساعدنا في تحديد موقع الأنماط. طباعة علامة ائتمانية مكررة وإعادة تسميته، سطح التسمية.زيادة طاقة الليزر بشكل ملحوظ وتعيين التكبير إلى واحد. نقل غطاء المغلفة PVA على حامل. للحصول على مجهر مستقيم، تأكد من أن سطح PVA يواجه لأسفل.إضافة الماء إلى زوايا لتحقيق الاستقرار في coverlip. جبل حامل على مرحلة المجهر. خفض الهدف وإضافة الماء في ما بين.في برنامج المجهر، قم بتشغيل مصراع ليزر الأشعة تحت الحمراء واؤن محاذاة تلقائية قبل النقش. التبديل إلى التكوين البصري للصورة. مسح مجال الرؤية أثناء تحريك الهدف ببطء أقرب إلى غطاء.في البداية، ستظهر الصورة باهتة للغاية. حرك الهدف أقرب إلى غطاء الغطاء حتى يزيد سطوع الصورة قليلا. هذا هو سطح الغطاء الذي يواجه الهدف.الاستمرار في تحريك الهدف حتى ينخفض السطوع ويزيد مرة أخرى. هذا هو سطح PVA الذي سنقوم بنقشه. ركز على أي ميزة صغيرة، مثل عيوب الأغطية أو الغبار، وحدد صفرا على محرك الأقراص Z.التبديل إلى التكوين البصري سطح التسمية. انقر على التقاط. العودة إلى التصوير والمسح الضوئي.يظهر تلف الزجاج أن التسمية قد تمت طباعتها بنجاح. نقل المرحلة من جانب واحد إلى حقلين من الرؤية لتجنب جزيئات الزجاج. تفحص لتأكيد.في قائمة الأجهزة، افتح ماكرو حركة المرحلة. تعيين المتغيرات M و N إلى العدد المطلوب من حقل طرق العرض التي سيتم نقش. حفظ الماكرو وتشغيله.بعد اكتمال النقش، قم بالتبديل إلى التكوين البصري للصورة وافحص الأنماط. وينبغي أن يكون للجزر النمطية في كل مجال من مجالات الرؤية حدود واضحة وأن تعكس الضوء بالتساوي. الأنماط التي تظهر أكثر قتامة وغير متساو تشير إلى إزالة PVA غير مكتملة.ويرجع ذلك عادة إلى عدم كفاية طاقة الليزر أو عدم صحة المستوى البؤري. إذا تم تعيين طاقة الليزر عالية جدا، فإنه يمكن أيضا أن يسبب PVA لفقاعة. بعد طلاء الخلايا على الأغطية ، يجب أن تنتشر الخلايا وتأخذ شكل النمط.هذه صورة مناعة لورم ليفي بشري مطلي على نمط القوس والنشاب. تعرض الخلية حافة لاميلبوديا غنية بال أكتين. سميكة، ألياف الإجهاد البطني على طول الجانبين وألياف الإجهاد الظهري متصلة بالأقواس العرضية.جلست سلسلة ضوء Myosin خلف حافة lamellipodia الكثيفة وعرضت نمطا المخطط على طول حزم أكتين. باستخدام أداة معالجة الصور المخصصة لدينا ، قمنا بتوليد صورة متوسطة لبروتيناتنا ذات الاهتمام. تظهر هذه الصورة أن هياكل actin الموضحة أعلاه متسقة عبر عدد كبير من الأنماط.على الرغم من أننا نفقد الهياكل الفردية من الميوسين بعد المتوسط ، إلا أنه يتم الحفاظ على التعريب على طول حزم actin. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرا على إعداد سير عمل النقش الصغير باستخدام نظام متعدد الفوتون متاح تجاريا مع الحد الأدنى من العمل اليدوي. من المهم تحسين طاقة الليزر لنظامك الخاص لتجنب توليد أنماط غير مكتملة أو يمكن تحقيق أقصى قدر من الكفاءة PVA عن طريق ضبط المعلمات في خطوات التركيز البؤري التلقائي والتكييف الدقيق.بالإضافة إلى التحقيق في المسارات الخلوية التي تنطوي على مورفولوجيا الخلايا ، يمكن تطبيق هذه التقنية أيضا على فحص الأدوية والتطبيقات الأخرى الحساسة للاختلافات في شكل الخلية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

انتقائية القضاء خلية من الثقافة 3D المختلطة باستخدام تقنية الأشعة تحت الحمراء بالقرب من Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

كامل الجسم الطيف الكتلي التصوير من قبل بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء ليزر الامتزاز Electrospray التأين (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

التنبؤ الجينات إسكات من خلال التحكم المكاني الزماني من سيرنا الافراج عن نانوكاريرز البوليمرية استجابة الصورة

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

التحكم الكتلة الخلية الأولى 3D في جهاز مكعب جل هجين لتشكيلات نمط التكرار

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

تركيب مجموعات نانوية ذهبية قريبة من الأشعة تحت الحمراء للتطبيقات البيولوجية

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

التخفيف من مرفق الخلايا المنقولة بالدم إلى يزرع المعادن من خلال CD47-المشتقة الببتيد تجميد

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

المزدوج النقطي المسح الضوئي photoacoustic صورة الحيوانات الصغيرة للتصور الأوعية الدموية

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...