Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
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这项工作得到了康诺特基金新调查员奖、加拿大创新基金会、NSERC发现赠款计划（授予RGPIN-2015-05114和RGPIN-2020-05881）、曼彻斯特大学和多伦多大学联合研究基金和多伦多大学XSeed项目的支持。C.T. 得到了国家人权委员会USRA研究金的支持。

1. 盖滑预处理
<ol><li>准备吱吱作响的干净盖片，如沃特曼-斯托勒，1998年25年描述。</li>
	<li>准备 1% （3-氨基丙基） 三氧硅烷 （APTMS） 溶液，并在溶液中孵育盖片 10 分钟，轻轻搅拌。确保盖片在解决方案中自由移动。</li>
	<li>用dH2O清洗两次盖片，每次5分钟。</li>
	<li>准备 0.5% 谷氨酸 （GA） 溶液，并在摇床上将溶液中的盖片孵育 30 分钟。对于 25 个盖片，使用 50 mL 的谷?...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

上述结果表明，所述的 IR 激光辅助微模式（微光托管）协议提供了各种形状的可重复粘附模式，能够操作细胞形状和细胞细胞结构。虽然在显微相位法出现之前和之后都开发出许多微模式方法，但这种方法具有若干优点。首先，它不需要专业设备和清洁室，通常只在工程部门内找到。事实上，随着多光子显微镜在生物学部门越来越常见，显微光学扩展了多光子显微镜的应用，并增加了潜在的用户...

细胞形状是组织形态形成1、细胞迁移2、细胞增殖3和基因表达4等基本生物过程的关键决定因素。细胞形状的变化是由细胞细胞的动态重新排列之间的复杂平衡驱动的，细胞体的动态重新排列使等离子膜变形，外在因素，如施加在细胞上的外力，以及细胞细胞和细胞基质粘附5的几何形状。例如，迁移间质细胞，在前沿聚合一个密集的活性蛋白网络，推动等离子膜向前推进，并创建一个宽的跛脚皮6，而活体肌素收缩性收回细胞的狭窄尾随边缘，以分离细胞从其当前位置7，8。破坏信号事件，导致这种特殊的细胞骨结构扰动形状和极性，并减缓细胞迁移9。此外，上皮板弯曲在胃结石需要基于肌素的阿皮收缩，导致细胞及其邻居成为楔形10。虽然这些研究强调了细胞形状的重要性，但细胞形状固有的异质性阻碍了确定将形态与功能联系起来的机制的努力。
为此，在过去三十年中，已经开发出许多操纵细胞形状的方法。这些方法通过用三维模具约束细胞或通过细胞外基质 （ECM） 蛋白质的图案沉积控制细胞几何学来达到他们的目标，这种技术称为微模式11。在这里，我们将回顾一些技术，已经获得了多年来的流行。
最初作为微电子应用的方法而开创，软光刻为基础的微接触印刷已明确成为崇拜者的最爱12。主晶圆首先通过选择性地将光层涂层硅基板的区域暴露在光照射下制造，留下图案表面13。然后，将弹性体（如 PDMS）倒入主晶圆上，生成一个软"标记"，将 ECM 蛋白质转移到所需的基板11、14上。一旦制造，主晶圆可用于铸造许多 PDMS 邮票，产生高可重复性的微模式12。然而，由于光刻过程冗长，这些模式无法轻易调整。这个过程还需要高度专业化的设备和清洁室，这些设备和洁净室通常不在生物学部门。
最近，据报道，使用深紫外线进行直接印刷是为了规避传统光刻方法带来的限制。深紫外线通过光罩定向到涂有聚L-lysine-嫁接-聚乙二醇的玻璃盖唇的选择性区域。暴露在深紫外线下的化学组在不使用感光连杆的情况下进行光转换，使 ECM 蛋白15具有结合性。缺乏感光链接器使图案盖片在室温下保持稳定超过7个月15。这种方法避免使用洁净室和光刻设备，需要较少的专业培训。然而，对光罩的要求仍然给需要随时可用的模式变化的实验带来了巨大的障碍。
除了通过在二维表面上控制 ECM 蛋白质沉积来操纵细胞几何的方法外，其他方法还试图通过将细胞限制在 3D 微结构中来控制细胞形状。许多研究已经调整了软石版印刷为基础的方法，以产生3D，而不是2D，PDMS室，以调查在胚胎，细菌，酵母和植物16，17，18，19的形状依赖生物过程。双光子聚合（2PP）还率先采用微晶硅技术，可制造出分辨率为20纳米的复杂3D水凝胶脚手架。2PP依赖于双光子吸附原理，即在股骨脉冲中交付的两个光子同时被分子（在此情况下的光启动器）吸收，从而实现光聚合物21的局部聚合。这项技术已被大量用于打印3D脚手架，模仿人体组织的原生ECM结构，并已被证明诱导低光化学损伤细胞22。
10年前，微型磷酸盐的首次亮相让研究人员有机会制造微型模式，同时避免无法访问和专用的设备。微光托管通过使用红外激光23、24在活性玻璃表面涂上多乙烯醇（PVA）的选择性区域，在微米尺度上创建模式。ECM 蛋白仅附着在底层玻璃表面，而不是 PVA，然后作为生化线索，使控制扩散动力学和细胞形状。这种方法还具有优越的灵活性，因为模式可以随时实时更改。在这里，我们使用商用多光子成像系统提供微光托邦的分步协议。所述协议专为快速和自动地制造大型图案而设计。我们证明，这些模式通过限制细胞-ECM粘附的几何形状，有效地控制了细胞形状。最后，我们证明，描述的模式技术调节细胞的组织和动态。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

微模式是细胞生物学界的一项既定技术，用于研究细胞隔间的形态和功能之间的联系，同时规避自然细胞与细胞变异引起的并发症。为了标准化细胞形状，细胞要么被限制在3D模具中，要么通过粘合岛控制粘合几何形状。然而，基于光刻和深紫外线蚀刻的传统微模式技术在很大程度上依赖于洁净室或专用设备。在这里，我们展示了一种红外激光辅助微模式技术（微光托邦），该技术由道尔等人修改，可通过市售成像系统方便设置。在此协议中，我们使用尼康 A1R MP+ 成像系统，通过红外 （IR） 激光器生成微缩精度的微模式，从而消融聚乙烯醇涂层盖片上的预设区域。我们采用自定义脚本，在未配备硬件自动对焦的系统中实现高效、准确的自动模式制造。我们表明，这种红外激光辅助微模式（微光托位）协议导致定义的模式，细胞只附加和采取所需的形状。此外，由于细胞形状的标准化，大量细胞的数据可以平均化。与此协议生成的模式，结合高分辨率成像和定量分析，可用于相对较高的吞吐量屏幕，以识别干扰形式和函数之间联系的分子玩家。

通过微观模式获得的实验数据的质量在很大程度上取决于模式的质量。为了确定使用上述方法生成的图案的质量，我们首先使用反射显微镜来评估盖唇照片消融区域的形状和大小。我们发现，每个图案看起来非常类似于消融面膜，并显示清晰的板和表面，反射光均匀 （图2B）.各种形状和尺寸可以打印取决于所需的细胞骨架构，但我们使用的十字弓形状，最适合我们的目的。...

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Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

这里提出的协议使微型模式能够自动制造，使细胞形状标准化，以研究哺乳动物细胞中的细胞骨结构。这种用户友好型技术可以与市售成像系统建立，不需要标准细胞生物学实验室无法使用的专用设备。

通过红外激光辅助微模式控制细胞几何

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

微模式是科学家用来了解细胞形状和细胞间机器活动之间的联系的有力技术。虽然几种技术允许研究人员调节细胞形状，但这些技术往往需要一些生物实验室无法利用的专用设备。此视频将引导您完成在市售多光成像系统上实现微模式自动化所需的步骤。此协议的一个优点是避免使用专用设备。模式也可以很容易地改变，而无需重新灌接光面膜，这通常是微模式中最耗时的过程。我们的图像处理工具生成平均细胞图像，以公正和自动化的方式反映蛋白质的代表性分布。虽然我们在实验中使用盖片，但自动化工作流还允许您在滑梯和玻璃底盘上进行图案。此方法的视觉演示非常重要，因为适当的显微镜设置对于系统以自动化的方式映像、识别正确的焦距平面和模式至关重要。按照指示准备 PVA 解决方案。将一部分 HCL 添加到八个部分 PVA 中。小心地倒置管子几次混合。将两毫升溶液倒入小培养皿中，将干净的预处理盖滑入液体中。在室温下在摇床上孵化五分钟。小心地从溶液中删除盖子。使用盖片微调器旋转外套40秒。同时，清洁钳子。将盖片转移到一个盒子上，并在四度下通宵干燥。打开显微镜软件。首先，将激光线设置为 750 纳米。然后设置一个新的光学配置称为"图像"。这是基线光学配置，使我们能够通过反射器对盖子进行成像。将其他选项保留为默认选项，并选择适当的目标。在此光学配置下配置硬件设置。将红外激光器设置为我们的刺激激光。将光束分离器放入光路径中，使用 IR 激光进行成像。选择加尔瓦诺扫描仪单元和适当的 D 扫描探测器。选择扫描大小和停留时间，足以捕获盖单上的小功能。确保检查使用 IR 激光框。调整采集激光功率和探测器灵敏度，以获得覆盖滑面的明亮但不饱和的图像。在扫描区域窗口中，将变焦设置为一个以捕获整个视场。保存光学配置。现在，我们将设置一系列光学配置，使显微镜聚焦、加载 ROI 面膜并以自动化方式生成模式。第一个光学配置允许我们打印用于自动聚焦当前视场的受托标记。复制图像光学配置并重命名它，打印受托标记。由于我们在此步骤中进行打印，因此将光束分离器移出光路，并将其替换为适当的二色镜。选择最小的扫描尺寸以节省时间。由于此步骤不需要成像，将探测器灵敏度设置为零。增加激光功率，实现打印。在扫描区域窗口中，设置变焦最大值并将扫描区域放置在视图的中间。现在，我们将建立一个 Z 堆栈实验，以解释 PVA 表面的任何不均匀性。将移动设置为相对的 Z 位置。选择合适的 Z 设备。接下来，复制图像光学配置并重命名它，自动对焦。选择最小的扫描大小并减少扫描区域窗口中的变焦因子，以便视场略大于受托标记。这可确保盖上的其他小功能不会干扰自动对焦。在设备菜单中，选择自动对焦设置。将扫描厚度设置为 Z 堆栈实验中的扫描厚度。显微镜将扫描这个范围，并找到最好的焦点平面使用信托标记。接下来，复制图像光学配置并重命名它，加载投资回报率。设置与投资回报率面膜相同的扫描大小，因为面膜将加载到使用此光学配置拍摄的图像上。我们使用 2048 像素实现了分辨率和速度之间的最佳平衡。现在，我们将设置用于对盖滑进行图案的光学配置。复制打印信托标记光学配置并重命名它，微型模式。将变焦因子设置为一个。增加刺激激光功率以消融 PVA。选择适当的扫描速度。在ND刺激窗口中，设置ND刺激实验。在时间安排中添加几个阶段，并设置每个阶段进行刺激。确保刺激区域和持续时间正确。在同一窗口中，使阶段在每个阶段之前移动主 Z 功能。这再次解释了 Z 方向的任何偏差。最后，设置光学配置，在盖上做一个可见的标签，可以帮助我们找到模式。复制打印受托标记并重命名它，标签表面。显著增加激光功率，并将变焦设置为一个。将 PVA 涂层盖盖滑移到支架上。对于直立显微镜，请确保 PVA 表面朝下。将水添加到角落以稳定盖滑。将支架安装到显微镜舞台上。降低目标，并在两者之间加水。在显微镜软件中，打开 IR 激光快门，在图案调整之前执行自动对齐。切换到图像光学配置。扫描视场，同时缓慢地将目标移近盖滑移。起初，图像将显得极其暗淡。将目标移近盖滑，直到图像亮度略有增加。这是面向目标的盖滑表面。继续移动目标，直到亮度降低并再次增加。这是我们将模式化的PVA表面。专注于任何小功能，如盖滑不完美或灰尘，并在 Z 驱动器上设置为零。切换到标签表面光学配置。单击"捕获"。返回成像和扫描。玻璃损坏表明标签已成功打印。将舞台移到一到两个视野，以避免玻璃颗粒。扫描以确认。在设备菜单中，打开舞台运动宏。将变量 M 和 N 设置为将要建模的视图字段的所需数。保存并运行宏。图案完成后，切换到图像光学配置并扫描图案。每个视野中的图案岛屿应具有清晰的边界，并均匀地反射光线。看起来较暗和不均匀的模式表示不完整的 PVA 去除。这通常是由于激光功率不足或焦距平面不正确。如果激光功率设置过高，也可能导致 PVA 冒泡。在盖片上电镀细胞后，细胞应扩散并形成图案的形状。这是一个在十字弓图案上镀的人类成纤维细胞的免疫荧光图像。细胞显示一个行为丰富的跛脚皮迪亚边缘。两侧有厚的腹应力纤维，两侧有由横弧连接的后部应力纤维。Myosin 灯链位于密集的跛脚皮皮亚边缘后面，沿 actin 捆绑显示条纹图案。使用我们的自定义图像处理工具，我们生成了我们感兴趣的蛋白质的平均图像。此图显示上述行为结构在大量模式中是一致的。虽然我们在平均后丢失了肌素的单个结构，但它沿 actin 捆绑包的本地化是保守的。观看此视频后，您应该能够使用市售的多光子系统设置微模式工作流，而手动工作最少。重要的是要优化自己的系统的激光功率，以避免生成不完整的模式或PVA通过调整自动对焦和微模式步骤中的参数可以达到最大的效率。除了研究涉及细胞形态的细胞通路外，该技术还可用于药物筛选和其他对细胞形状变化敏感的应用。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

通过微接触印刷的定向功能性心肌组织的产生

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

科研

生物工程

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

从混合三维培养使用近红外Photoimmunotherapy技术选择性细胞消除

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

全身质谱成像红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

缩微和3D微血管大会

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Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

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